Na escala evolutiva dos processos de polpação de alto rendimento (PAR), a mais recente promessa é a biopolpação, ou seja, o pré-tratamento microbiológico do cavaco de madeira utilizado na polpação. Esse pré-tratamento tem o potencial de reduzir o consumo de energia necessária ao refino em até 38%, e ainda, ou consequentemente, melhorar importantes propriedades mecânicas deficientes nas PAR, como rasgo, estouro, e tração. Enorme atenção foi dispensada ao assunto nos últimos 20 anos com importantes avanços na compreensão dos mecanismos envolvidos, e ainda, com a condução de testes em escala piloto (50 ton de cavacos) por inoculação direta do fungo. Entretanto, esses testes foram conduzidos e se mostraram eficazes num clima temperado, com madeira típica da América do Norte. O presente trabalho detalha o desenvolvimento, implantação e operação de uma planta piloto para biotratamento de cavacos (inoculação e incubação) de Eucalyptus grandis, usados num processo de escala industrial de polpação termimecânica (TMP) e quimiotermomecânico (CTMP). Também estão detalhados nessa tese os esforços para se alcançar a eficácia desejada desse biotratamento. Vários testes em diferentes escalas - incluindo 40-50 ton - foram conduzidos em diferentes épocas do ano, sob as condições normalmente encontradas nos pátios de cavacos da indústria de celulose. Diferentes fungos (Ceriporiopsis subvermispora e Phanerochaete chrysosporium) e sistemas de inoculação (inoculação por aspersão e inoculação por semente) foram testados, e o escalonamento de um processo anteriormente factível apenas em nível laboratorial foi desenvolvido. Os resultados mostram que os sistemas de inoculação de C. subvermispora por aspersão com micélio suspenso em água e um auxiliar de crescimento foram sujeitos à contaminação dos cultivos por bolores primários, de ocorrência natural no ambiente de pátios de cavacos de indústrias de celulose. Por outro lado, o sistema de inoculação com cavacos pré-cultivados (inoculação por semente) mostrou-se eficaz na escala piloto, pois não esteve sujeito a ocorrência de contaminantes durante a incubação dos cavacos. Esse sistema de inoculação gerou resultados condizentes com a literatura em termos de economia de energia de refino que foram de 18% e 27% nos processos TMP e CTMP, respectivamente. No caso da inoculação por aspersão com P. chrysosporium, os cultivos não apresentaram contaminação por bolores primários, provavelmente devido à temperatura de incubação que nesse caso foi de 38 oC. Nesse experimento foi possível reduzir o consumo de energia em 18,5% no processo CTMP. Uma avaliação da viabilidade financeira do processo é apresentada e simulações de benefícios econômicos foram feitas para diferentes cenários de custo de energia elétrica e níveis de redução no consumo de energia. As simulações mostraram que benefícios econômicos da ordem de R$10/ton de polpa produzida podem ser obtidos para uma redução no consumo de energia da ordem de 20% advinda do biotratamento. Embora esperados, ganhos de propriedades mecânicas das biopolpas quando comparadas às polpas convencionais não foram observados, fato que limitou a extensão da análise econômica de considerar um processo integrado com máquina de papel na substituição de polpa kraft por polpas bio-CTMP ou bio-TMP. / In the evolution of the high yield pulping processes (HYP) biopulping have been considered the latest promise. Biopulping, defined as the microbiological pretreatment of wood chips prior to the pulping process, have the potential to reduce the refining energy consumption in 38%. Besides this benefit, or consequently, it can also enhance important mechanical properties usually poor in HYP pulps like tear, burst and tensile strength. Considerable efforts have been deposited in this issue during the last 20 years with important advances on understanding the involved mechanisms. Between these efforts trials were conducted in a pilot scale (50 ton of wood chips) by the direct spraying of the fungus. However such successful tests were conducted in a region of temperate climate, with a wood typically found in North America. The present work details the development, installation and operation of a pilot plant to biotreat (inoculation and incubation) Eucalyptus grandis wood chips used in an industrial thermomechanical (TMP) and chemithermomechanical (CTMP) mill. The efforts spent to reach the desired efficacy of this biotreatment are also presented. Several trials with different scales - including 40-50 ton trials - were conducted in different seasons, under the conditions normally found in woodyards of a tropical pulp mill. Different fungi (Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium) and different inoculation systems (by direct spraying and by seed introduction) were tested, and one of them developed at the first time in this pilot scale. The results show that when C. subvermispora was used with the direct spraying systems of the mycelium suspended in water with corn steep liquor the pile was strongly contaminated by primary molds of natural occurrence at an industrial woodyard tropical environment. On the other hand, the inoculation using pre-cultivated wood chips (seed system) was successfully conducted in pilot scale since it does not showed expressive contamination during the incubation period. The refining of the wood chips prepared by seed inoculation resulted in energy savings of 18% and 27% for the TMP and CTMP processes, respectively. By using the P. chrysosporium the pile was not contaminated by primary molds either, probably due to the higher incubation temperature, around 38 oC. The CTMP processing of the wood chips incubated in this experiment refining energy saving of 18.5% was observed. An economic evaluation of the biopulping process is presented and saving of R$10/ton was simulated for a 20% reduction in refining energy saving. The enhancement of the mechanical properties of the biopulp compared to the reference was not observed, regardless being expected. This fact limited the extension of the economical simulation, since the replacement of kraft pulp by bio-TMP or bio-CTMP is usually considered in an integrated paper mill.

No presente trabalho buscaram-se formas adequadas de produzir micélio de Ceriporiopsis subvermispora em culturas submersas, com o objetivo de preparar inóculo destinado ao processo de biopolpação. A obtenção de inóculo pode ser considerada uma etapa chave na biopolpação, visto que atualmente não existem processos industriais estabelecidos para a produção de micélio de basidiomicetos em quantidades compatíveis com a demanda prevista no processo. Mesmo uma planta industrial pequena de biopolpação (200 ton de polpa/dia) pode demandar cerca de 1 kg de micélio seco/dia, considerando-se as cargas de inoculação de 5 g de micélio seco/ton de madeira tratada. Desta forma, o sucesso desse processo pode depender de um baixo custo da produção dos inóculos fúngicos em larga escala. Os experimentos realizados consistiram inicialmente no crescimento do fungo em Erlenmeyers de 250 mL contendo 20 mL de meio líquido. Numa segunda etapa, os experimentos foram conduzidos em biorreatores de 1,5 L (Bioflo-NewBrunswick) e por último em um biorreator de 14 L. No último caso, o biorreator em questão foi especialmente desenhado e construído com o intuito de minimizar efeitos de cisalhamento da hifa durante o cultivo, mantendo ainda níveis adequados de aeração. Em Erlenmeyer foram feitos cultivos utilizando meio composto por 2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de levedura (DB-EL), além de um meio potencialmente de menor custo que era composto por 2,0% de sacarose e 3,2% de milhocina (SM). A biomassa total obtida nos cultivos com meio SM foi compatível com aquela obtida no meio DB-EL. Os cultivos subsequentes realizados em biorreator utilizaram então o meio SM. O maior nível de biomassa fúngica obtida nos cultivos com biorreator agitado por pás (1,5 L) foi de 7,0 g/L, após 12 dias de crescimento. As maiores produtividades foram observadas a partir do 7o dia de cultivo, atingindo 0,93 g/L.dia quando a biomassa total era de 6,5 g/L. No biorreator de 14 L foram realizados 3 cultivos em condições diferenciadas (denominados de A, B e C). No cultivo A não houve intervenção em relação à correção de pH ou nível de nutrientes disponíveis ao longo de 14 dias. No cultivo B foi realizado o controle do pH a fim de mantê-lo entre 4,0 e 5,0. No cultivo C foi realizada a adição de sacarose correspondente a uma reposição de 5 g/L após 5 dias de crescimento. Os cultivos foram monitorados quanto à biomassa produzida, o pH, o teor de açúcar residual e o nível de O2 dissolvido. De forma geral, o acúmulo de biomassa sempre foi seguido pelo consumo de açúcares, pela diminuição nos níveis de O2 dissolvido e pela tendência de elevação do pH. A maior quantidade de biomassa foi obtida no cultivo C (14,1 g/L), correspondendo a uma produtividade de 1,72 g/L.dia. O surgimento de clamidósporos foi verificado em todos os tipos de cultivo, sendo que no cultivo C (em biorreator de 14 L) foi observada a menor quantidade de clamidósporos. Isso sugeriu que nessa situação houve melhores condições de crescimento para o fungo e menor estresse nutricional ou induzido por cisalhamento. A viabilidade dos inóculos preparados para a efetiva colonização da madeira foi testada e indicou que o inóculo produzido no biorreator de 14 L, tanto micélio como clamidósporos, foi efetivo para colonizar Eucalyptus grandis. / The present work evaluated suitable systems for producing Ceriporiopsis subvermispora mycelium in submerged cultures. Mycellium produced was used in subsequent inoculation of wood chips in biopulping processes. The development of appropriated technologies for producing large amounts of inoculum may be a key step in biopulping, since currently there are no established processes designed to produce basidiomycetes mycelium to supply biopulping demands. Even a small biopulping plant (200 ton pulp / day) may require about 1 kg of dry mycelium/day, taking into account inoculation of 5 g of dry mycelium/ton of wood to be biotreated. Thus, the success of this process may depend on the low cost of large scale fungal inoculum production. The experiments were conducted initially in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 20 mL of liquid medium. In a second step, the experiments were conducted in bioreactors of 1.5 L (Bioflo-NewBrunswick) and finally in a bioreactor of 14 L. In the latter case, the bioreactor has been designed and constructed in order to minimize the effects of shear stress during cultivation and supply suitable aeration levels. Culture broths were composed of 2.4% potato extract and 0.7% yeast extract (BD-EL) or 2.0% sucrose and 3.2% of corn steep liquor (SM) that represent a potentially lower cost culture broth. The total biomass obtained in flask-cultures with SM broth was similar to that obtained with DB-EL. Cultures performed in the subsequent bioreactor used then the SM broth. The higher level of fungal biomass obtained in the cultures performed in the 1.5 L-stirred bioreactor was 7.0 g/L after 12 days. The highest mycelium yield was observed from the 7th day of cultivation, reaching 0.93 g/L.day and 6.5 g/L total biomass. In the 14 L-bioreactor, 3 experiments were performed in different conditions (called A, B and C). In cultivation A, no interventions were performed to correct the culture pH or the level of available nutrients over 14 days of culturing. In culture B pH was controlled to keep it between 4.0 and 5.0. Cultivation C was carried out with addition of sucrose (final concentration of 5 g/L) after 5 days of growth. All cultures were monitored with basis on the biomass produced, culture pH, residual sugar content and dissolved O2 levels. In general, biomass accumulation was always followed by sugar consumption, decrease in dissolved O2 levels and a rising tendency for the pH values. The highest biomass amount was obtained in culture C (14.1 g / L), corresponding to a yield of 1.72 g/L.day. The presence of clamydospores was observed in all cultures, whereas in culture C (in 14 L bioreactor) it appeared at the lowest amounts. This fact suggested that culture C presented the lowest stress level for the fungus, including low hypha shear stress and low nutritional depletion. The viability of inoculum prepared, both mycelium and clamydospores, was checked by culturing them on Eucalyptus grandis wood chips. Both inoculum types (prepared from the 14 L-bioreactor) were efficient on colonizing wood chips and to produce the manganese peroxidase enzyme.

No presente trabalho buscaram-se formas adequadas de produzir micélio de Ceriporiopsis subvermispora em culturas submersas, com o objetivo de preparar inóculo destinado ao processo de biopolpação. A obtenção de inóculo pode ser considerada uma etapa chave na biopolpação, visto que atualmente não existem processos industriais estabelecidos para a produção de micélio de basidiomicetos em quantidades compatíveis com a demanda prevista no processo. Mesmo uma planta industrial pequena de biopolpação (200 ton de polpa/dia) pode demandar cerca de 1 kg de micélio seco/dia, considerando-se as cargas de inoculação de 5 g de micélio seco/ton de madeira tratada. Desta forma, o sucesso desse processo pode depender de um baixo custo da produção dos inóculos fúngicos em larga escala. Os experimentos realizados consistiram inicialmente no crescimento do fungo em Erlenmeyers de 250 mL contendo 20 mL de meio líquido. Numa segunda etapa, os experimentos foram conduzidos em biorreatores de 1,5 L (Bioflo-NewBrunswick) e por último em um biorreator de 14 L. No último caso, o biorreator em questão foi especialmente desenhado e construído com o intuito de minimizar efeitos de cisalhamento da hifa durante o cultivo, mantendo ainda níveis adequados de aeração. Em Erlenmeyer foram feitos cultivos utilizando meio composto por 2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de levedura (DB-EL), além de um meio potencialmente de menor custo que era composto por 2,0% de sacarose e 3,2% de milhocina (SM). A biomassa total obtida nos cultivos com meio SM foi compatível com aquela obtida no meio DB-EL. Os cultivos subsequentes realizados em biorreator utilizaram então o meio SM. O maior nível de biomassa fúngica obtida nos cultivos com biorreator agitado por pás (1,5 L) foi de 7,0 g/L, após 12 dias de crescimento. As maiores produtividades foram observadas a partir do 7o dia de cultivo, atingindo 0,93 g/L.dia quando a biomassa total era de 6,5 g/L. No biorreator de 14 L foram realizados 3 cultivos em condições diferenciadas (denominados de A, B e C). No cultivo A não houve intervenção em relação à correção de pH ou nível de nutrientes disponíveis ao longo de 14 dias. No cultivo B foi realizado o controle do pH a fim de mantê-lo entre 4,0 e 5,0. No cultivo C foi realizada a adição de sacarose correspondente a uma reposição de 5 g/L após 5 dias de crescimento. Os cultivos foram monitorados quanto à biomassa produzida, o pH, o teor de açúcar residual e o nível de O2 dissolvido. De forma geral, o acúmulo de biomassa sempre foi seguido pelo consumo de açúcares, pela diminuição nos níveis de O2 dissolvido e pela tendência de elevação do pH. A maior quantidade de biomassa foi obtida no cultivo C (14,1 g/L), correspondendo a uma produtividade de 1,72 g/L.dia. O surgimento de clamidósporos foi verificado em todos os tipos de cultivo, sendo que no cultivo C (em biorreator de 14 L) foi observada a menor quantidade de clamidósporos. Isso sugeriu que nessa situação houve melhores condições de crescimento para o fungo e menor estresse nutricional ou induzido por cisalhamento. A viabilidade dos inóculos preparados para a efetiva colonização da madeira foi testada e indicou que o inóculo produzido no biorreator de 14 L, tanto micélio como clamidósporos, foi efetivo para colonizar Eucalyptus grandis. / The present work evaluated suitable systems for producing Ceriporiopsis subvermispora mycelium in submerged cultures. Mycellium produced was used in subsequent inoculation of wood chips in biopulping processes. The development of appropriated technologies for producing large amounts of inoculum may be a key step in biopulping, since currently there are no established processes designed to produce basidiomycetes mycelium to supply biopulping demands. Even a small biopulping plant (200 ton pulp / day) may require about 1 kg of dry mycelium/day, taking into account inoculation of 5 g of dry mycelium/ton of wood to be biotreated. Thus, the success of this process may depend on the low cost of large scale fungal inoculum production. The experiments were conducted initially in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 20 mL of liquid medium. In a second step, the experiments were conducted in bioreactors of 1.5 L (Bioflo-NewBrunswick) and finally in a bioreactor of 14 L. In the latter case, the bioreactor has been designed and constructed in order to minimize the effects of shear stress during cultivation and supply suitable aeration levels. Culture broths were composed of 2.4% potato extract and 0.7% yeast extract (BD-EL) or 2.0% sucrose and 3.2% of corn steep liquor (SM) that represent a potentially lower cost culture broth. The total biomass obtained in flask-cultures with SM broth was similar to that obtained with DB-EL. Cultures performed in the subsequent bioreactor used then the SM broth. The higher level of fungal biomass obtained in the cultures performed in the 1.5 L-stirred bioreactor was 7.0 g/L after 12 days. The highest mycelium yield was observed from the 7th day of cultivation, reaching 0.93 g/L.day and 6.5 g/L total biomass. In the 14 L-bioreactor, 3 experiments were performed in different conditions (called A, B and C). In cultivation A, no interventions were performed to correct the culture pH or the level of available nutrients over 14 days of culturing. In culture B pH was controlled to keep it between 4.0 and 5.0. Cultivation C was carried out with addition of sucrose (final concentration of 5 g/L) after 5 days of growth. All cultures were monitored with basis on the biomass produced, culture pH, residual sugar content and dissolved O2 levels. In general, biomass accumulation was always followed by sugar consumption, decrease in dissolved O2 levels and a rising tendency for the pH values. The highest biomass amount was obtained in culture C (14.1 g / L), corresponding to a yield of 1.72 g/L.day. The presence of clamydospores was observed in all cultures, whereas in culture C (in 14 L bioreactor) it appeared at the lowest amounts. This fact suggested that culture C presented the lowest stress level for the fungus, including low hypha shear stress and low nutritional depletion. The viability of inoculum prepared, both mycelium and clamydospores, was checked by culturing them on Eucalyptus grandis wood chips. Both inoculum types (prepared from the 14 L-bioreactor) were efficient on colonizing wood chips and to produce the manganese peroxidase enzyme.

Na escala evolutiva dos processos de polpação de alto rendimento (PAR), a mais recente promessa é a biopolpação, ou seja, o pré-tratamento microbiológico do cavaco de madeira utilizado na polpação. Esse pré-tratamento tem o potencial de reduzir o consumo de energia necessária ao refino em até 38%, e ainda, ou consequentemente, melhorar importantes propriedades mecânicas deficientes nas PAR, como rasgo, estouro, e tração. Enorme atenção foi dispensada ao assunto nos últimos 20 anos com importantes avanços na compreensão dos mecanismos envolvidos, e ainda, com a condução de testes em escala piloto (50 ton de cavacos) por inoculação direta do fungo. Entretanto, esses testes foram conduzidos e se mostraram eficazes num clima temperado, com madeira típica da América do Norte. O presente trabalho detalha o desenvolvimento, implantação e operação de uma planta piloto para biotratamento de cavacos (inoculação e incubação) de Eucalyptus grandis, usados num processo de escala industrial de polpação termimecânica (TMP) e quimiotermomecânico (CTMP). Também estão detalhados nessa tese os esforços para se alcançar a eficácia desejada desse biotratamento. Vários testes em diferentes escalas - incluindo 40-50 ton - foram conduzidos em diferentes épocas do ano, sob as condições normalmente encontradas nos pátios de cavacos da indústria de celulose. Diferentes fungos (Ceriporiopsis subvermispora e Phanerochaete chrysosporium) e sistemas de inoculação (inoculação por aspersão e inoculação por semente) foram testados, e o escalonamento de um processo anteriormente factível apenas em nível laboratorial foi desenvolvido. Os resultados mostram que os sistemas de inoculação de C. subvermispora por aspersão com micélio suspenso em água e um auxiliar de crescimento foram sujeitos à contaminação dos cultivos por bolores primários, de ocorrência natural no ambiente de pátios de cavacos de indústrias de celulose. Por outro lado, o sistema de inoculação com cavacos pré-cultivados (inoculação por semente) mostrou-se eficaz na escala piloto, pois não esteve sujeito a ocorrência de contaminantes durante a incubação dos cavacos. Esse sistema de inoculação gerou resultados condizentes com a literatura em termos de economia de energia de refino que foram de 18% e 27% nos processos TMP e CTMP, respectivamente. No caso da inoculação por aspersão com P. chrysosporium, os cultivos não apresentaram contaminação por bolores primários, provavelmente devido à temperatura de incubação que nesse caso foi de 38 oC. Nesse experimento foi possível reduzir o consumo de energia em 18,5% no processo CTMP. Uma avaliação da viabilidade financeira do processo é apresentada e simulações de benefícios econômicos foram feitas para diferentes cenários de custo de energia elétrica e níveis de redução no consumo de energia. As simulações mostraram que benefícios econômicos da ordem de R$10/ton de polpa produzida podem ser obtidos para uma redução no consumo de energia da ordem de 20% advinda do biotratamento. Embora esperados, ganhos de propriedades mecânicas das biopolpas quando comparadas às polpas convencionais não foram observados, fato que limitou a extensão da análise econômica de considerar um processo integrado com máquina de papel na substituição de polpa kraft por polpas bio-CTMP ou bio-TMP. / In the evolution of the high yield pulping processes (HYP) biopulping have been considered the latest promise. Biopulping, defined as the microbiological pretreatment of wood chips prior to the pulping process, have the potential to reduce the refining energy consumption in 38%. Besides this benefit, or consequently, it can also enhance important mechanical properties usually poor in HYP pulps like tear, burst and tensile strength. Considerable efforts have been deposited in this issue during the last 20 years with important advances on understanding the involved mechanisms. Between these efforts trials were conducted in a pilot scale (50 ton of wood chips) by the direct spraying of the fungus. However such successful tests were conducted in a region of temperate climate, with a wood typically found in North America. The present work details the development, installation and operation of a pilot plant to biotreat (inoculation and incubation) Eucalyptus grandis wood chips used in an industrial thermomechanical (TMP) and chemithermomechanical (CTMP) mill. The efforts spent to reach the desired efficacy of this biotreatment are also presented. Several trials with different scales - including 40-50 ton trials - were conducted in different seasons, under the conditions normally found in woodyards of a tropical pulp mill. Different fungi (Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium) and different inoculation systems (by direct spraying and by seed introduction) were tested, and one of them developed at the first time in this pilot scale. The results show that when C. subvermispora was used with the direct spraying systems of the mycelium suspended in water with corn steep liquor the pile was strongly contaminated by primary molds of natural occurrence at an industrial woodyard tropical environment. On the other hand, the inoculation using pre-cultivated wood chips (seed system) was successfully conducted in pilot scale since it does not showed expressive contamination during the incubation period. The refining of the wood chips prepared by seed inoculation resulted in energy savings of 18% and 27% for the TMP and CTMP processes, respectively. By using the P. chrysosporium the pile was not contaminated by primary molds either, probably due to the higher incubation temperature, around 38 oC. The CTMP processing of the wood chips incubated in this experiment refining energy saving of 18.5% was observed. An economic evaluation of the biopulping process is presented and saving of R$10/ton was simulated for a 20% reduction in refining energy saving. The enhancement of the mechanical properties of the biopulp compared to the reference was not observed, regardless being expected. This fact limited the extension of the economical simulation, since the replacement of kraft pulp by bio-TMP or bio-CTMP is usually considered in an integrated paper mill.

Ceriporiopsis subvermispora é um fungo filamentoso, muito seletivo na degradação de lignina e, por isso, tem sido uma das espécies mais estudadas no processo de biopolpação. A biopolpação consiste em um tratamento biológico da madeira que antecede etapas convencionais de polpação, proporcionando níveis de economia de energia elétrica no processo que podem atingir valores de 30 a 40%. Para degradar a lignina, esse fungo secreta a enzima manganês-peroxidase (MnP), a qual requer um ácido carboxílico para quelar e transportar íons Mn3+ oriundos do seu ciclo catalítico. O complexo quelante-Mn3+ degrada apenas frações fenólicas da lignina, porém pode também iniciar a peroxidação de lipídeos e com isso gerar radicais peroxila que apresentam capacidade oxidativa suficiente para degradar estruturas não-fenólicas da lignina. Com base nesses aspectos, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar a degradação de lignina por reações que envolvem a peroxidação de ácido linoléico iniciadas por metabólitos extracelulares extraídos de cultivos de C. subvermispora. Também foram avaliados sistemas miméticos baseados nos íons Fe2+ e Mn3+ como iniciadores das mesmas reações. Essencialmente, foi estudada a degradação de lignina in vitro em reações iniciadas por sistemas compostos que incluíram, MnP/Mn+2/H2O2, Fe3+/agentes redutores de Fe3+ produzidos durante a biodegradação da madeira, íons Mn+3 ou íons Fe+2, todos adicionados ao ácido linoléico. Para realizar esse estudo foi necessário preparar, tanto MnP, quanto compostos redutores de Fe3+, em cultivos de C. subvermispora. Também foram preparados e caracterizados dois substratos para as reações em estudo. Esses substratos compreenderam um complexo lignina-carboidrato (CLC) e um modelo de um material lignocelulósico completo, porém moído e livrado de toda a fração de extrativos. Nos dois casos, o material de partida foi à madeira de Eucalyptus grandis. A caracterização química desses substratos indicou um teor de lignina de 44,8% e 29,0%, respectivamente. Reações de peroxidação de ácido linoléico iniciadas pelos sistemas em estudo mostraram que todos foram efetivos para esse propósito, sendo que as maiores taxas de consumo de oxigênio durante essas reações foram observadas nos meios reacionais que continham Fe2+ em solução. O CLC inibiu as reações de peroxidação quando adicionado ao meio reacional em concentraçãoes maiores do que 0,3 mg/mL. Entretanto, reações prolongadas por 72 h com o CLC numa concentração inicial de 1 mg/mL indicaram que ele sofreu despolimerização. As vias de degradação da lignina contida no CLC ou na madeira de E. grandis moída envolveram a despolimerização da molécula, ou simplesmente a oxidação das cadeias laterais e das estruturas fenólicas livres. Quando o sistema foi baseado na ação de MnP/Mn+2/H2O2/ácido linoléico, foram comprovadas vias de degradação da lignina que envolveram desde a simples oxidação do carbono-α até a quebra de ligações do tipo β-O-4 e/ou entre os carbonos α e β. Os resultados obtidos corroboraram dados anteriormente publicados para a ação de C. subvermispora in vivo. Uma exceção foi à observação da reação de simples oxidação do Cα nos sistemas in vitro, que havia sido descartada em trabalhos anteriores que se basearam na caracterização de lignina contida em madeira biotratada por C. subvermispora (sistema in vivo). Os resultados permitiram concluir que vários sistemas miméticos podem iniciar a peroxidação de ácido linoléico in vitro. Quando essas reações foram conduzidas na presença de lignina (CLC ou E. grandis moído) foi possível observar transformações importantes na estrutura da lignina que eventualmente poderiam ser exploradas, por exemplo, em etapas de processos de branqueamento de polpas kraft. / The white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora degrades lignin selectively, being one of the most studied species in biopulping. Biopulping consists of a biological treatment of wood that precedes conventional pulping stages. The process can provide up to 30-40% of energy savings in mechanical pulping. To degrade lignin, this fungus secretes the enzyme manganese-peroxidase (MnP), which needs carboxylic acids to chelate and transport Mn3+ ions formed in the catalytic cycle of the enzyme. The chelate-Mn3+ complex is able to degrade phenolic structures of lignin; however, can also initiate lipid peroxidation reactions generating peroxyl radicals that are able to degrade nonphenolic lignin structures. Based on this background, the aim of this work was to evaluate lignin degradation through linoleic acid peroxidation reactions initiated by extracellular metabolites recovered from C. subvermispora cultures. Some biomimetic systems based on Fe2+ and Mn3+ ions were also evaluated as initiators of such reactions. The lignin degradation was studied in reaction systems composed of MnP/Mn+2/H2O2, Fe3+-reducing compounds produced during wood biodegradation by C. subvermispora, Mn+3 or Fe+2 ions, all of them in the presence of linoleic acid. To perform this study, MnP and Fe3+-reducing compounds were initially produced in C. subvermispora cultures. Two different reaction substrates were also prepared. One was a lignin-carbohydrate complex (LCC) and, the other, was a complete lignocellulosic material that was milled and extracted to remove the extractive fraction. Both substrates were prepared from Eucalyptus grandis wood. The chemical characterization of the substrates showed 44.8 % and 29.0 % of total lignin, respectively. Linoleic acid peroxidation reactions initiated by the studied systems showed that all of them were efficient on this purpose. The highest oxygen consumption rates during these reactions were observed in the Fe2+ initiated reactions. The LCC inhibited the peroxidation reactions when added to the reaction medium at concentrations higher than 0.3 mg/mL. However, prolonging the reactions up to 72h with LCC at 1 mg/mL showed that it was depolymerized. The lignin degradation routes involved depolymerization or simple side chain and free-phenolic structure oxidations. When the reactive system was based on the use of MnP/Mn+2/H2O2/linoleic acid, some lignin degradation routes were demonstrated and they included Cα-oxidation, as well as β-O-4 and/or Cα-Cβ cleavages. These results corroborate previous findings published for the action of C. subvermispora in vivo. One exception was the simple Cα oxidation that was observed for the in vitro reactions, but was ruled out by previous works that were based on the characterization of residual lignins extracted from wood samples biotreated by C. subvermispora (in vivo system). The current results permitted to conclude that several mimetic systems were able to initiate linoleic acid peroxidation in vitro. When these reactions were performed in the presence of lignin (LCC or milled E. grandis) it was possible to show the occurrence of several lignin transformation reactions that could be exploited, for example, in pulp bleaching processes.

O fungo de podridão branca Ceriporiopsis subvermispora é seletivo na degradação de lignina em estágios curtos de colonização de madeira e dessa forma tem sido uma das espécies mais estudadas em biopolpação, que consiste em um tratamento biológico de cavacos de madeira que antecede etapas convencionais de polpação. Para degradar a lignina na parede celular vegetal esse fungo secreta a enzima manganês-peroxidase (MnP), a qual necessita de ácido oxálico para transportar o íon Mn3+ oriundo do seu ciclo catalítico. O complexo quelante-Mn3+ gerado degrada apenas porções fenólicas da lignina. Porém, por meio da peroxidação de lipídeos por Mn3+, radicais livres são gerados e apresentam potencial de oxidação suficiente para degradar estruturas não-fenólicas da lignina. Com base nesses aspectos, o presente trabalho avaliou a importância desses mediadores da MnP, ácido oxálico e lipídeos, no processo degradativo quanto à adição ou à supressão dessas substâncias nos cultivos. Em cultivos com madeira in natura ou extraídas com etanol (provavelmente isento de lipídeos) não ocorreu diferença significativa quanto à produção de metabólitos extracelulares (enzimas, ácido oxálico), à degradação de lignina e à atividade redutora de Fe3+ (envolvida na geração de radicais OH pela reação de Fenton). A formação de TBARS (substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico), que serve como indício de reações de peroxidação de lipídeos, também foi semelhante, demonstrando que mesmo a partir de madeira livre de extrativos essas reações ocorrem. Com o avanço do biotratamento, a lignina foi despolimerizada por meio da diminuição de ligações ?-O-4, os teores de OH alifáticas e fenólicas foram diminuídos, enquanto o teor de grupos carboxila aumentou. Embora a degradação de celulose em madeira tenha sido baixa, cartões de holocelulose (livres de lignina) adicionados nesses cultivos foram despolimerizados. Nos cultivos em que houve a adição de uma fonte extra de lipídeos (óleo de soja), a produção de enzimas e degradação de lignina foram similares, enquanto a produção de ácido oxálico e TBARS foi estimulada por esse co-substrato. A maior concentração de óleo de soja adicionado (10,4 g/kg de madeira) fez com que a lignina presente na madeira residual apresentasse o mesmo teor de ligações ?-O-4 que o controle, enquanto maior degradação de OH alifáticas e menor formação de grupos carboxila foram observadas nessas ligninas. Em outro ciclo de cultivos, íons Ca2+ foram adicionados para precipitar o ácido oxálico produzido pelo fungo. Nos cultivos com a mais alta carga de cálcio (1400 mg/kg) houve diminuição na formação de ácido oxálico e consequentemente uma inibição na degradação de todos os componentes da madeira. Ao serem realizados cultivos com ácido oxálico exógeno, o fungo atuou de forma a igualar a concentração de ácido oxálico livre em relação a um cultivo sem esse suplemento, tanto por catabolismo quanto por precipitação desse ácido. Para as máximas cargas de cálcio, ácido oxálico e óleo de soja foram realizados outros cultivos sobre madeira em biorreatores para realização de ensaios de polpação. A polpação quimiotermomecânica sulfito alcalino dessas amostras de madeira biodegradada mostrou que os cultivos adicionados de Ca2+ e os não suplementados foram os que proporcionaram os maiores benefícios atribuídos ao biotratamento. Por outro lado, a adição de ácido oxálico anulou o benefício oriundo do biotratamento. A busca de correlações entre os níveis de metabólitos extracelulares com os benefícios do biotratamento para a polpação quimiotermomecânica não apresentaram tendências claras que indiquem a relevância de um metabólito em especial. Pelo contrário, aparentemente deve haver um compromisso entre todas as atividades extracelulares para que um determinado benefício seja obtido. / The white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora degrades lignin selectively during the initial stages of wood colonization and in this way it has been one of the most studied species in biopulping. This process consists of a biological treatment of wood chips that precedes conventional pulping stages. To degrade lignin in the plant cell wall this fungus secretes the enzyme manganese-peroxidase (MnP), which needs oxalic acid to transport the Mn3+ ion formed in the catalytic cycle of the enzyme. The oxalate-Mn3+ complex degrades only lignin phenolic portions. However, through lipid peroxidation intiated by Mn3+, free radicals are generated and they present enough oxidation potential to degrade nonphenolic lignin structures. With basis in these aspects, the present work evaluated the importance of these mediators of MnP, oxalic acid and lipids, in the degradative process either by their addition or suppression in wood-containing cultures. In cultivations with in natura wood or ethanol extracted wood (probably free of lipids) thre was no significant difference in the production of extracelular metabolites (enzymes, oxalic acid), or in the lignin degradation and the Fe3+-reducing activity (involved in the OH radicals generation by the Fenton´s reaction). The formation of TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), that ii indicative of lipid peroxidation reactions, was also similar in both cultivations systems, demonstrating that even starting from extractives-free wood, these reactions can occur. With the progress of the biotreatment, the lignin was depolymerized through the decrease of ?-O-4 bonds, the contents of aliphatic and phenolic OH decreased, while carboxyl groups content increased. Although the cellulose degradation in wood has been low, holocellulose cards (free from lignin) added in these cultures were depolymerized. In the cultures where lipids were added (soy-bean oil), the enzyme production and lignin degradation were similar, while the oxalic acid and TBARS productions was stimulated by this co-substrate. With the highest concentration of soy-bean oil added (10,4 g/kg wood), the lignin in the residual wood presented the same content of ?-O-4 bonds as compared to the control, while higher degradation of aliphatic OH and lower formation of carboxyl groups were observed in these lignins. In another cycle of cultivations, Ca2+ ions were added to precipitate oxalic acid produced by the fungus. In the cultivations with the highest load of calcium (1400 mg/kg) there was a decrease in the oxalic acid formation and consequently an inhibition in the degradation of all the wood components. To the cultivations accomplished with exogenous oxalic acid, the fungus acted to equalize the concentration of free oxalic acid either by catabolism or by precipitation of this acid. For the highest loads of calcium, oxalic acid andsoy-bean oil, other cultivations were accomplished on 20 L-biorreactors to produce biotreated wood samples suitable for pulping experiments. The alkaline-sulfite chemitermomechanical pulping of these samples showed that the biotreated wood in Ca2+-ammended and nonsupplemented cultures were the ones that provided the highest benefits. On the other hand, the oxalic acid addition annulled the benefit originated from the biotreatment. The search for correlations among the levels of extracelular metabolites with the benefits of the biotreatment for the chemitermomechanical pulping did not present clear tendencies to indicate the relevance of a metabolite in special. On the contrary, probably there is a commitment among all of the extracellular activities, so that a certain benefit would be obtained.

Ceriporiopsis subvermispora é um fungo filamentoso, muito seletivo na degradação de lignina e, por isso, tem sido uma das espécies mais estudadas no processo de biopolpação. A biopolpação consiste em um tratamento biológico da madeira que antecede etapas convencionais de polpação, proporcionando níveis de economia de energia elétrica no processo que podem atingir valores de 30 a 40%. Para degradar a lignina, esse fungo secreta a enzima manganês-peroxidase (MnP), a qual requer um ácido carboxílico para quelar e transportar íons Mn3+ oriundos do seu ciclo catalítico. O complexo quelante-Mn3+ degrada apenas frações fenólicas da lignina, porém pode também iniciar a peroxidação de lipídeos e com isso gerar radicais peroxila que apresentam capacidade oxidativa suficiente para degradar estruturas não-fenólicas da lignina. Com base nesses aspectos, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar a degradação de lignina por reações que envolvem a peroxidação de ácido linoléico iniciadas por metabólitos extracelulares extraídos de cultivos de C. subvermispora. Também foram avaliados sistemas miméticos baseados nos íons Fe2+ e Mn3+ como iniciadores das mesmas reações. Essencialmente, foi estudada a degradação de lignina in vitro em reações iniciadas por sistemas compostos que incluíram, MnP/Mn+2/H2O2, Fe3+/agentes redutores de Fe3+ produzidos durante a biodegradação da madeira, íons Mn+3 ou íons Fe+2, todos adicionados ao ácido linoléico. Para realizar esse estudo foi necessário preparar, tanto MnP, quanto compostos redutores de Fe3+, em cultivos de C. subvermispora. Também foram preparados e caracterizados dois substratos para as reações em estudo. Esses substratos compreenderam um complexo lignina-carboidrato (CLC) e um modelo de um material lignocelulósico completo, porém moído e livrado de toda a fração de extrativos. Nos dois casos, o material de partida foi à madeira de Eucalyptus grandis. A caracterização química desses substratos indicou um teor de lignina de 44,8% e 29,0%, respectivamente. Reações de peroxidação de ácido linoléico iniciadas pelos sistemas em estudo mostraram que todos foram efetivos para esse propósito, sendo que as maiores taxas de consumo de oxigênio durante essas reações foram observadas nos meios reacionais que continham Fe2+ em solução. O CLC inibiu as reações de peroxidação quando adicionado ao meio reacional em concentraçãoes maiores do que 0,3 mg/mL. Entretanto, reações prolongadas por 72 h com o CLC numa concentração inicial de 1 mg/mL indicaram que ele sofreu despolimerização. As vias de degradação da lignina contida no CLC ou na madeira de E. grandis moída envolveram a despolimerização da molécula, ou simplesmente a oxidação das cadeias laterais e das estruturas fenólicas livres. Quando o sistema foi baseado na ação de MnP/Mn+2/H2O2/ácido linoléico, foram comprovadas vias de degradação da lignina que envolveram desde a simples oxidação do carbono-α até a quebra de ligações do tipo β-O-4 e/ou entre os carbonos α e β. Os resultados obtidos corroboraram dados anteriormente publicados para a ação de C. subvermispora in vivo. Uma exceção foi à observação da reação de simples oxidação do Cα nos sistemas in vitro, que havia sido descartada em trabalhos anteriores que se basearam na caracterização de lignina contida em madeira biotratada por C. subvermispora (sistema in vivo). Os resultados permitiram concluir que vários sistemas miméticos podem iniciar a peroxidação de ácido linoléico in vitro. Quando essas reações foram conduzidas na presença de lignina (CLC ou E. grandis moído) foi possível observar transformações importantes na estrutura da lignina que eventualmente poderiam ser exploradas, por exemplo, em etapas de processos de branqueamento de polpas kraft. / The white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora degrades lignin selectively, being one of the most studied species in biopulping. Biopulping consists of a biological treatment of wood that precedes conventional pulping stages. The process can provide up to 30-40% of energy savings in mechanical pulping. To degrade lignin, this fungus secretes the enzyme manganese-peroxidase (MnP), which needs carboxylic acids to chelate and transport Mn3+ ions formed in the catalytic cycle of the enzyme. The chelate-Mn3+ complex is able to degrade phenolic structures of lignin; however, can also initiate lipid peroxidation reactions generating peroxyl radicals that are able to degrade nonphenolic lignin structures. Based on this background, the aim of this work was to evaluate lignin degradation through linoleic acid peroxidation reactions initiated by extracellular metabolites recovered from C. subvermispora cultures. Some biomimetic systems based on Fe2+ and Mn3+ ions were also evaluated as initiators of such reactions. The lignin degradation was studied in reaction systems composed of MnP/Mn+2/H2O2, Fe3+-reducing compounds produced during wood biodegradation by C. subvermispora, Mn+3 or Fe+2 ions, all of them in the presence of linoleic acid. To perform this study, MnP and Fe3+-reducing compounds were initially produced in C. subvermispora cultures. Two different reaction substrates were also prepared. One was a lignin-carbohydrate complex (LCC) and, the other, was a complete lignocellulosic material that was milled and extracted to remove the extractive fraction. Both substrates were prepared from Eucalyptus grandis wood. The chemical characterization of the substrates showed 44.8 % and 29.0 % of total lignin, respectively. Linoleic acid peroxidation reactions initiated by the studied systems showed that all of them were efficient on this purpose. The highest oxygen consumption rates during these reactions were observed in the Fe2+ initiated reactions. The LCC inhibited the peroxidation reactions when added to the reaction medium at concentrations higher than 0.3 mg/mL. However, prolonging the reactions up to 72h with LCC at 1 mg/mL showed that it was depolymerized. The lignin degradation routes involved depolymerization or simple side chain and free-phenolic structure oxidations. When the reactive system was based on the use of MnP/Mn+2/H2O2/linoleic acid, some lignin degradation routes were demonstrated and they included Cα-oxidation, as well as β-O-4 and/or Cα-Cβ cleavages. These results corroborate previous findings published for the action of C. subvermispora in vivo. One exception was the simple Cα oxidation that was observed for the in vitro reactions, but was ruled out by previous works that were based on the characterization of residual lignins extracted from wood samples biotreated by C. subvermispora (in vivo system). The current results permitted to conclude that several mimetic systems were able to initiate linoleic acid peroxidation in vitro. When these reactions were performed in the presence of lignin (LCC or milled E. grandis) it was possible to show the occurrence of several lignin transformation reactions that could be exploited, for example, in pulp bleaching processes.

O fungo de podridão branca Ceriporiopsis subvermispora é seletivo na degradação de lignina em estágios curtos de colonização de madeira e dessa forma tem sido uma das espécies mais estudadas em biopolpação, que consiste em um tratamento biológico de cavacos de madeira que antecede etapas convencionais de polpação. Para degradar a lignina na parede celular vegetal esse fungo secreta a enzima manganês-peroxidase (MnP), a qual necessita de ácido oxálico para transportar o íon Mn3+ oriundo do seu ciclo catalítico. O complexo quelante-Mn3+ gerado degrada apenas porções fenólicas da lignina. Porém, por meio da peroxidação de lipídeos por Mn3+, radicais livres são gerados e apresentam potencial de oxidação suficiente para degradar estruturas não-fenólicas da lignina. Com base nesses aspectos, o presente trabalho avaliou a importância desses mediadores da MnP, ácido oxálico e lipídeos, no processo degradativo quanto à adição ou à supressão dessas substâncias nos cultivos. Em cultivos com madeira in natura ou extraídas com etanol (provavelmente isento de lipídeos) não ocorreu diferença significativa quanto à produção de metabólitos extracelulares (enzimas, ácido oxálico), à degradação de lignina e à atividade redutora de Fe3+ (envolvida na geração de radicais OH pela reação de Fenton). A formação de TBARS (substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico), que serve como indício de reações de peroxidação de lipídeos, também foi semelhante, demonstrando que mesmo a partir de madeira livre de extrativos essas reações ocorrem. Com o avanço do biotratamento, a lignina foi despolimerizada por meio da diminuição de ligações ?-O-4, os teores de OH alifáticas e fenólicas foram diminuídos, enquanto o teor de grupos carboxila aumentou. Embora a degradação de celulose em madeira tenha sido baixa, cartões de holocelulose (livres de lignina) adicionados nesses cultivos foram despolimerizados. Nos cultivos em que houve a adição de uma fonte extra de lipídeos (óleo de soja), a produção de enzimas e degradação de lignina foram similares, enquanto a produção de ácido oxálico e TBARS foi estimulada por esse co-substrato. A maior concentração de óleo de soja adicionado (10,4 g/kg de madeira) fez com que a lignina presente na madeira residual apresentasse o mesmo teor de ligações ?-O-4 que o controle, enquanto maior degradação de OH alifáticas e menor formação de grupos carboxila foram observadas nessas ligninas. Em outro ciclo de cultivos, íons Ca2+ foram adicionados para precipitar o ácido oxálico produzido pelo fungo. Nos cultivos com a mais alta carga de cálcio (1400 mg/kg) houve diminuição na formação de ácido oxálico e consequentemente uma inibição na degradação de todos os componentes da madeira. Ao serem realizados cultivos com ácido oxálico exógeno, o fungo atuou de forma a igualar a concentração de ácido oxálico livre em relação a um cultivo sem esse suplemento, tanto por catabolismo quanto por precipitação desse ácido. Para as máximas cargas de cálcio, ácido oxálico e óleo de soja foram realizados outros cultivos sobre madeira em biorreatores para realização de ensaios de polpação. A polpação quimiotermomecânica sulfito alcalino dessas amostras de madeira biodegradada mostrou que os cultivos adicionados de Ca2+ e os não suplementados foram os que proporcionaram os maiores benefícios atribuídos ao biotratamento. Por outro lado, a adição de ácido oxálico anulou o benefício oriundo do biotratamento. A busca de correlações entre os níveis de metabólitos extracelulares com os benefícios do biotratamento para a polpação quimiotermomecânica não apresentaram tendências claras que indiquem a relevância de um metabólito em especial. Pelo contrário, aparentemente deve haver um compromisso entre todas as atividades extracelulares para que um determinado benefício seja obtido. / The white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora degrades lignin selectively during the initial stages of wood colonization and in this way it has been one of the most studied species in biopulping. This process consists of a biological treatment of wood chips that precedes conventional pulping stages. To degrade lignin in the plant cell wall this fungus secretes the enzyme manganese-peroxidase (MnP), which needs oxalic acid to transport the Mn3+ ion formed in the catalytic cycle of the enzyme. The oxalate-Mn3+ complex degrades only lignin phenolic portions. However, through lipid peroxidation intiated by Mn3+, free radicals are generated and they present enough oxidation potential to degrade nonphenolic lignin structures. With basis in these aspects, the present work evaluated the importance of these mediators of MnP, oxalic acid and lipids, in the degradative process either by their addition or suppression in wood-containing cultures. In cultivations with in natura wood or ethanol extracted wood (probably free of lipids) thre was no significant difference in the production of extracelular metabolites (enzymes, oxalic acid), or in the lignin degradation and the Fe3+-reducing activity (involved in the OH radicals generation by the Fenton´s reaction). The formation of TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), that ii indicative of lipid peroxidation reactions, was also similar in both cultivations systems, demonstrating that even starting from extractives-free wood, these reactions can occur. With the progress of the biotreatment, the lignin was depolymerized through the decrease of ?-O-4 bonds, the contents of aliphatic and phenolic OH decreased, while carboxyl groups content increased. Although the cellulose degradation in wood has been low, holocellulose cards (free from lignin) added in these cultures were depolymerized. In the cultures where lipids were added (soy-bean oil), the enzyme production and lignin degradation were similar, while the oxalic acid and TBARS productions was stimulated by this co-substrate. With the highest concentration of soy-bean oil added (10,4 g/kg wood), the lignin in the residual wood presented the same content of ?-O-4 bonds as compared to the control, while higher degradation of aliphatic OH and lower formation of carboxyl groups were observed in these lignins. In another cycle of cultivations, Ca2+ ions were added to precipitate oxalic acid produced by the fungus. In the cultivations with the highest load of calcium (1400 mg/kg) there was a decrease in the oxalic acid formation and consequently an inhibition in the degradation of all the wood components. To the cultivations accomplished with exogenous oxalic acid, the fungus acted to equalize the concentration of free oxalic acid either by catabolism or by precipitation of this acid. For the highest loads of calcium, oxalic acid andsoy-bean oil, other cultivations were accomplished on 20 L-biorreactors to produce biotreated wood samples suitable for pulping experiments. The alkaline-sulfite chemitermomechanical pulping of these samples showed that the biotreated wood in Ca2+-ammended and nonsupplemented cultures were the ones that provided the highest benefits. On the other hand, the oxalic acid addition annulled the benefit originated from the biotreatment. The search for correlations among the levels of extracelular metabolites with the benefits of the biotreatment for the chemitermomechanical pulping did not present clear tendencies to indicate the relevance of a metabolite in special. On the contrary, probably there is a commitment among all of the extracellular activities, so that a certain benefit would be obtained.

O presente trabalho está inserido dentro de um estudo que pretende entender os mecanismos químicos e bioquímicos envolvidos na biodegradação da madeira por Ceriporiopsis subvermispora. Particularmente avaliou-se a relação entre a atividade redutora de Fe3+ presente em extratos aquosos de cultivos de Ceriporiopsis subvermispora sobre madeira com a iniciação de reações de peroxidação de ácido linoleico. A madeira foi biotratada por períodos de 7, 14 e 28 dias. Após a biodegradação, os cavacos foram extraídos com água e os extratos gerados foram caracterizados quanto a atividade redutora de Fe3+ e a capacidade de peroxidar ácido linoleico in vitro. As reações de peroxidação foram avaliadas a partir do monitoramento do consumo de O2 em um oxímetro. A partir desses ensaios foi possível determinar que tanto a oxidação de íons Fe2+ adicionados diretamente ao meio reacional ou a adição de íons Fe3+ e extratos com atividade redutora foram capazes de gerar radicais hidroperoxila que podem iniciar a peroxidação de ácido linoleico. As reações controle indicaram que a peroxidação não ocorre na presença de Fe3+. A adição de metanol às reações contendo Fe2+ não proporcionou menor capacidade de peroxidação de lipídeos, indicando que a reação não deve ser iniciada por OH radical. Tanto a atividade redutora de Fe+3 como a capacidade de iniciar a peroxidação de ácido linoleico dos extratos aumentaram em função do tempo de cultivo. A ultrafiltação dos extratos através de membranas seletivas associada com estudos de cromatografia de permeação em gel (CPG) indicaram que a maior parte da atividade redutora e da capacidade peroxidativa pode ser atribuída a compostos menores que 5kDa. Entre os compostos orgânicos identificados nas frações menores que 5 kDa, foram identificados, por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), alguns ácidos graxos como o palmítico e o ácido esteárico, além de glicerol e ácido oxálico e compostos aromáticos como a vanilina, e os ácidos vanílico, siríngico e gálico. A vanilina, detectada em todas as amostras em estudo, foi usada como padrão para um estudo comparativo das atividades redutoras de Fe3+ detectadas nos extratos. As concentrações estimadas de vanilina nos extratos foram de 5 a 22 ? moles/L de extrato ultrafiltrado. Soluções padrão de vanilina foram então preparadas em concentrações de 5 a 30 ? M e avaliadas quanto a capacidade de reduzir Fe3+ na presença de ferrozina. Essas misturas levaram à formação de Fe2+ nas concentrações de 0,5 a 0,7 ? M de Fe2+ , após 10 min de reação. A comparação desses dados com a capacidade redutora de Fe3+ encontrada nos ultrafiltrados da amostra de madeira biotratada por 14 dias, 43 ?M de Fe2+ em 10 min, sugeriu que a maior parte da capacidade redutora dos extratos não pode ser atribuída aos compostos detectados por CG/EM e sim deve ser atribuída a compostos que apresentam massa molar próxima àquela obtida pela calibração do sistema de CPG, entre 3 e 5 kDa. Isso sugere que a atividade redutora não estaria presente em compostos de baixa massa molar compatíveis com estruturas contendo 1 ou, no máximo, 2 anéis aromáticos e sim em derivados fenólicos maiores, oriundos da biodegradação da lignina. / The present work is inserted in a broad study aiming to understand the chemical and biochemical mechanisms involved in wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora. Particularly, the relationship between the Fe3+-reducing activity present in aqueous extracts recovered from Ceriporiopsis subvermispora cultures on wood with the initiation of linoleic acid peroxidation reactions was evaluated. Wood chips were biotreated for periods varying from 7 to 28 days. After biotreatment, the wood chips were extracted with water and the resulting extracts were characterized according to their Fe3+-reducing activity, as well as their capacity to initiate linoleic acid peroxidation reactions in vitro. The peroxidation reactions were monitored through O2 consumption by using an appropriated Oximeter. Based on these assays, it was possible to show that Fe2+ ions added directly to the reaction media or the addition of Fe3+ ions plus aqueous extracts were able to generate hidroperoxil radicals that initiated linoleic acid peroxidation. The control reactions indicated that the peroxidation did not occur in the presence of Fe3+ ions alone. Addition of methanol to the reaction media containing Fe2+ did not diminish the lipid peroxidation extent, suggesting that the reaction should not depend on the formation of hydroxyl radical. The Fe3+-reducing activity and the capacity to initiate linoleic acid peroxidation increased in the aqueous wood extracts as a function of culturing time. The ultrafiltration of the extracts associated with gel permeation chromatography (GPC) studies indicated that most of the reducing activity and the peroxidation capacity present in the extracts were assigned to compounds presenting molecular mass lower than 5 kDa. In the fraction lower than 5 kDa some organic compounds were identified by using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Palmitic and estearic acids, glycerol, oxalic acid and some aromatic compounds such as vanillin, vanillic, gallic and syringic acids were identified. Vanillin, detected in all the studied samples, was used as a standard for comparative evaluation of the Fe3+-reducing activities detected in the extracts. The estimated concentrations of vanillin in the extracts varied from 5 to 22 μmol/L of ultrafiltrated extract. Therefore, 5 to 30 μM standard solutions of va nillin were assayed for their Fe3+-reducing activity. These solutions reduced 0.5 to 0.7?M of Fe3+ after 10 min reaction. The comparison of these data with the Fe3+-reducing capacity found in the ultrafiltrated aqueous extract from the 14-day biotreated sample, 43 ? M of Fe3+ reduced after 10 min reaction, suggested that most of the reducing capacity in the extracts could not be attributed to compounds detect by GC/MS. Conversely, the Fe3+-reducing capacity could be assigned to compounds with higher molar mass as already observed in the GPC studies (3 to 5 kDa). These data suggest that the reducing activity detected in the aqueous extracts would not be compatible with low molar mass compounds containing 1 or, at least 2, aromatic rings. Instead, the Fe3+-reducing capacity should be assigned to high molar mass phenolic derivatives produced during the lignin biodegradation.

O presente trabalho está inserido dentro de um estudo que pretende entender os mecanismos químicos e bioquímicos envolvidos na biodegradação da madeira por Ceriporiopsis subvermispora. Particularmente avaliou-se a relação entre a atividade redutora de Fe3+ presente em extratos aquosos de cultivos de Ceriporiopsis subvermispora sobre madeira com a iniciação de reações de peroxidação de ácido linoleico. A madeira foi biotratada por períodos de 7, 14 e 28 dias. Após a biodegradação, os cavacos foram extraídos com água e os extratos gerados foram caracterizados quanto a atividade redutora de Fe3+ e a capacidade de peroxidar ácido linoleico in vitro. As reações de peroxidação foram avaliadas a partir do monitoramento do consumo de O2 em um oxímetro. A partir desses ensaios foi possível determinar que tanto a oxidação de íons Fe2+ adicionados diretamente ao meio reacional ou a adição de íons Fe3+ e extratos com atividade redutora foram capazes de gerar radicais hidroperoxila que podem iniciar a peroxidação de ácido linoleico. As reações controle indicaram que a peroxidação não ocorre na presença de Fe3+. A adição de metanol às reações contendo Fe2+ não proporcionou menor capacidade de peroxidação de lipídeos, indicando que a reação não deve ser iniciada por OH radical. Tanto a atividade redutora de Fe+3 como a capacidade de iniciar a peroxidação de ácido linoleico dos extratos aumentaram em função do tempo de cultivo. A ultrafiltação dos extratos através de membranas seletivas associada com estudos de cromatografia de permeação em gel (CPG) indicaram que a maior parte da atividade redutora e da capacidade peroxidativa pode ser atribuída a compostos menores que 5kDa. Entre os compostos orgânicos identificados nas frações menores que 5 kDa, foram identificados, por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), alguns ácidos graxos como o palmítico e o ácido esteárico, além de glicerol e ácido oxálico e compostos aromáticos como a vanilina, e os ácidos vanílico, siríngico e gálico. A vanilina, detectada em todas as amostras em estudo, foi usada como padrão para um estudo comparativo das atividades redutoras de Fe3+ detectadas nos extratos. As concentrações estimadas de vanilina nos extratos foram de 5 a 22 ? moles/L de extrato ultrafiltrado. Soluções padrão de vanilina foram então preparadas em concentrações de 5 a 30 ? M e avaliadas quanto a capacidade de reduzir Fe3+ na presença de ferrozina. Essas misturas levaram à formação de Fe2+ nas concentrações de 0,5 a 0,7 ? M de Fe2+ , após 10 min de reação. A comparação desses dados com a capacidade redutora de Fe3+ encontrada nos ultrafiltrados da amostra de madeira biotratada por 14 dias, 43 ?M de Fe2+ em 10 min, sugeriu que a maior parte da capacidade redutora dos extratos não pode ser atribuída aos compostos detectados por CG/EM e sim deve ser atribuída a compostos que apresentam massa molar próxima àquela obtida pela calibração do sistema de CPG, entre 3 e 5 kDa. Isso sugere que a atividade redutora não estaria presente em compostos de baixa massa molar compatíveis com estruturas contendo 1 ou, no máximo, 2 anéis aromáticos e sim em derivados fenólicos maiores, oriundos da biodegradação da lignina. / The present work is inserted in a broad study aiming to understand the chemical and biochemical mechanisms involved in wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora. Particularly, the relationship between the Fe3+-reducing activity present in aqueous extracts recovered from Ceriporiopsis subvermispora cultures on wood with the initiation of linoleic acid peroxidation reactions was evaluated. Wood chips were biotreated for periods varying from 7 to 28 days. After biotreatment, the wood chips were extracted with water and the resulting extracts were characterized according to their Fe3+-reducing activity, as well as their capacity to initiate linoleic acid peroxidation reactions in vitro. The peroxidation reactions were monitored through O2 consumption by using an appropriated Oximeter. Based on these assays, it was possible to show that Fe2+ ions added directly to the reaction media or the addition of Fe3+ ions plus aqueous extracts were able to generate hidroperoxil radicals that initiated linoleic acid peroxidation. The control reactions indicated that the peroxidation did not occur in the presence of Fe3+ ions alone. Addition of methanol to the reaction media containing Fe2+ did not diminish the lipid peroxidation extent, suggesting that the reaction should not depend on the formation of hydroxyl radical. The Fe3+-reducing activity and the capacity to initiate linoleic acid peroxidation increased in the aqueous wood extracts as a function of culturing time. The ultrafiltration of the extracts associated with gel permeation chromatography (GPC) studies indicated that most of the reducing activity and the peroxidation capacity present in the extracts were assigned to compounds presenting molecular mass lower than 5 kDa. In the fraction lower than 5 kDa some organic compounds were identified by using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Palmitic and estearic acids, glycerol, oxalic acid and some aromatic compounds such as vanillin, vanillic, gallic and syringic acids were identified. Vanillin, detected in all the studied samples, was used as a standard for comparative evaluation of the Fe3+-reducing activities detected in the extracts. The estimated concentrations of vanillin in the extracts varied from 5 to 22 μmol/L of ultrafiltrated extract. Therefore, 5 to 30 μM standard solutions of va nillin were assayed for their Fe3+-reducing activity. These solutions reduced 0.5 to 0.7?M of Fe3+ after 10 min reaction. The comparison of these data with the Fe3+-reducing capacity found in the ultrafiltrated aqueous extract from the 14-day biotreated sample, 43 ? M of Fe3+ reduced after 10 min reaction, suggested that most of the reducing capacity in the extracts could not be attributed to compounds detect by GC/MS. Conversely, the Fe3+-reducing capacity could be assigned to compounds with higher molar mass as already observed in the GPC studies (3 to 5 kDa). These data suggest that the reducing activity detected in the aqueous extracts would not be compatible with low molar mass compounds containing 1 or, at least 2, aromatic rings. Instead, the Fe3+-reducing capacity should be assigned to high molar mass phenolic derivatives produced during the lignin biodegradation.