Les triacylglycérols d'algues (TAG) représentent une source prometteuse de biocarburants. Les principales étapes de la synthèse des acides gras et du métabolisme du TAG des algues ont été déduites de celles des plantes terrestres, mais on en sait peu sur les sources de carbones et d’énergie intervenant dans la synthèse de lipides de réserve. Nous avons donc étudié la synthèse des acides gras chez l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en utilisant une combinaison d'approches génétiques, biochimiques et microscopiques. Plus précisément, j'ai d'abord examiné la localisation subcellulaire de gouttelettes de lipides dans des cellules d'algues exposées à une forte lumière, conditions où une plus grande quantité de pouvoir réducteur est produite. J'ai ensuite contribué à mettre en évidence que la bêta-oxydation des acides gras est un processus peroxysomal, et que pendant une carence en azote réalisée en conditions photoautotrophe, des mutants dépourvus de la malate déshydrogénase 2 peroxysomale (mdh2) accumulent 50% plus TAG que les souches parentales. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence l'importance du contexte redox cellulaire sur la synthèse lipidique. Cette étude a également permis de révéler l’existence d'un échange d’énergie entre le peroxysome et le chloroplaste. Enfin, en caractérisant des mutants déficients dans la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), j'ai montré que le catabolisme des BCAAs joue un double rôle dans la synthèse de TAG en fournissant des précurseurs carbonés et de l'ATP. L'ensemble de ces travaux ouvert de nouvelles pistes pour l'amélioration génétique future de souches d'algues pour la production de biocarburants. / Algal triacylglycerols (TAG) represent a promising source for biofuel. The major steps for fatty acid synthesis and TAG metabolism have been deduced based on that of land plants, but little is known about carbon and energy sources. To address this question, we investigated fatty acid synthesis in algal cells using a combination of genetic, biochemical and microscopic approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, I first examined subcellular localization of lipid droplets in algal cells exposed to high light, a condition favoring production of reducing power. Secondly, I contributed to put on evidence that the beta-oxidation of fatty acids is a peroxisomal process, and that during photoautotrophic nitrogen starvation, knock-out mutants of the peroxisomal malate dehydrogenase 2 (mdh2) made 50% more TAG than parental strains, highlighting the importance of cellular redox context on lipid synthesis. This study also revealed for the first time the occurrence of an energy trafficking pathway from peroxisome to chloroplast. And finally, by characterizing mutants defected in degradation of branched-chain amino acids (BCAAs), I showed that BCAA catabolism plays a dual role in TAG synthesis via providing carbon precursors and ATP. Taken together, this work highlighted the complex interplay between carbon and energy metabolism in green photosynthetic cells, and pointed future directions for genetic improvement of algal strains for biofuel productions.

Das Konzept des Idealproteins (IAAR) bietet einen Ansatzpunkt zur umweltschonenden Tierproduktion. Das IAAR definiert genau die Relationen an AA, die der Körper für eine gewünschte Leistung, z.B. Wachstum, Reproduktion, etc., benötigt. Im Idealfall liegt keine AA im Überschuss oder im Mangel vor. In der Folge wirken alle AA gleichermaßen limitierend. Das Protein kann unter diesen Bedingungen mit der höchsten Effizienz genutzt werden. Stickstoff (N)-Exkretionen und Belastungen des Stoffwechsels werden minimiert. Bei der Umsetzung des IAAR-Konzepts wird die zu untersuchende AA in Relation zu einer Referenz-Aminosäure (AA), meistens Lysin (Lys), gesetzt. Eine umfassende Literaturrecherche zeigte, dass fundierte Angaben über die idealen Verhältnisse der verzweigtkettigen AA (engl.: branched-chain amino acids, BCAA) Leucin (Leu), Isoleucin (Ile) und Valin (Val) zu Lys beim Masthähnchen rar sind, insbesondere Angaben zum idealen Leu:Lys-Verhältnis. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Ermittlung der idealen BCAA:Lys- Verhältnisse in Futtermischungen für männliche Masthähnchen der Genetik Ross 308 und eine anschließende Validierung der gefundenen Ergebnisse. Dabei erfolgte die Auswertung von aus Stoffwechselversuchen gewonnen NAnsatz- Daten mit Hilfe eines nicht-linearen N-Verwertungsmodells für wachsende Monogastride. Des Weiteren sollte der optimale Zeitpunkt für die Blutabnahme zur Analyse der verzweigtkettigen Ketosäuren, die wichtige Informationen zum Stoffwechsel der BCAA vermitteln können, definiert werden, da in der Literatur keine Hinweise auf einen optimalen Zeitpunkt gegeben sind. Drei aufeinander aufbauende Versuchskomplexe wurden durchgeführt, die neben N-Bilanz-Studien parallel Wachstumsversuche umfassten. Diese waren in eine Starter- und Growerperiode unterteilt. In den Bilanzversuchen schlossen sich an eine fünf-tägige Adaptationsperiode die zweimal fünftägigen Sammelperioden an (je 36 Tiere in der Starter- (10.-20. Lebenstag (LT)) und Growerperiode (25.-35.LT)). Im Wachstumsversuch gliederten sich die Versuchsabschnitte vom 1.-12. 13.-24. und 25.-36. Lebenstag in Experiment 1. In Experiment 2 und 3 umfasste die Starterperiode den 1.-21. LT bzw. 10.-20. LT und die Growerperiode den 21.-35. LT bzw. 25.-35. LT. Für jeden Abschnitt wurden jeweils 240 Tiere verwendet. Zu Beginn und zum Ende jedes Wachstumsabschnittes wurden repräsentative Tiere für eine Ganzkörperanalyse ausgewählt, 24h genüchtert, eingeschläfert, autoklaviert, homogenisiert und im Hinblick auf XP, TS und XA analysiert. Dies ermöglichte die Berechnung des N-Ansatzes der Versuchstiere für den jeweiligen Wachstumsabschnitt. Hauptkomponenten der Diäten in allen Versuchen waren Weizen, Weizenkleber, Sojaproteinkonzentrat und Fischmehl. Das zunächst als Referenz angenommene IAAR basierte auf Literaturdaten. Die Diätgestaltung erfolgte nach dem Prinzip der Verdünnungsmethode. Zur Bestimmung des optimalen Blutabnahmezeitpunktes wurden 40 Tiere verwendet. Nur Tiere, die eine AA-balancierte Kontrollmischung erhalten hatten, kamen zur Anwendung. Über einen gestaffelten Zeitraum wurde den Masthähnchen Blut am 36. LT abgenommen. Die Bestimmung des Gehalts an verzweigtkettigen α-Ketosäuren erfolgte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Nachfolgend sind die Ergebnisse der einzelnen Versuchskomplexe dargestellt: Experiment 1 diente der Ermittlung der Modellparameter des täglichen NErhaltungsbedarfs (NMR) sowie des täglichen maximalen N-Retentionsvermögens (NRmaxT) für die Ergebnisevaluierung nach dem exponentiellen N-Verwertungsmodell. Auf Grundlage der N-Bilanz-Daten ergaben sich ein NMR und NRmaxT von 113 mg N/LMkg0,67/d und 4705 mg N/LMkg0,67/d für die Starter-, sowie von 215 mg N/LMkg0,67/d und 4516 mg N/LMkg0,67/d für die Growerperiode. Weiterhin konnte basierend auf der ermittelten Lys-Effizienz der Lys-Bedarf für unterschiedliche Leistungsziele (g XP-Ansatz/d), verschieden unterstellte Futteraufnahmen sowie für eine definierte Lebendmasse quantifiziert werden. In Experiment 2 erfolgte die Ermittlung des IAAR für die BCAA in Relation zu Lys (IAARBCAA). Es ergab sich für die Starter- bzw. Growerperiode ein IAARBCAA von Lys:Leu:Ile:Val = 100:94:55:65 bzw. 100:106:56:72. Die Ergebnisse deuteten an, dass für die Growerperiode ein erhöhter relativer Bedarf an Leu und Val vorlag. Die ermittelten Werte des IAARBCAA lagen deutlich unterhalb des Referenz IAARBCAA (100:110:68:79). Die Analyse der verzweigtkettigen α-Ketosäuren zeigte, dass 3 – 12h nach Futterentzug keine signifikanten Konzentrationsänderungen im Blutplasma für alle drei α-Ketosäuren vorlag (p<0,05). Es wurde geschlussfolgert, dass dieser Zeitraum für weitere Untersuchungen zu präferieren ist. Experiment 3 diente der Validierung eines im Vergleich zum Referenz IAARBCAA (Lys:Leu:Ile:Val = 100:110:68:79) deutlich reduzierten BCAA-Anteils im Broilerfutter (Lys:Leu:Ile:Val = 100:89:53:63 in der Starter- und 100:97:56:70 in der Growerperiode). Es konnte festgehalten werden, dass sich die Einstellung eines im Vergleich zur Literatur niedrigeren IAARBCAA nicht negativ auf die Leistung von Masthähnchen auswirkte. Weiterer Forschungsbedarf besteht einerseits in der Methodik. Neben einer weiteren Optimierung von Stoffwechsel- und Wachstumsversuchen wäre auch ein Vergleich unterschiedlicher Modelle (z.B. N-Verwertungsmodell und Supplementationsmethode) zur Ableitung des AA-Bedarfs/des IAAR innerhalb eines Versuchskomplexes wünschenswert. Andererseits könnten nachfolgende Untersuchungen neben den Gehalt an verzweigtkettigen α- Ketosäuren im Blutplasma von Masthähnchen weitere Parameter, wie den AA- oder Harnsäure-Gehalt mit einbeziehen. Somit könnte ein Beitrag zu einem noch besseren Verständnis für den BCAA-Metabolismus und dessen Auswirkungen auf die Tierleistung und –gesundheit geleistet werden.

<p>The development of a novel charge inversion ion/ion reaction in conjunction with a mass spectrometry technique (collisional induced dissociation (CID)) to induce fragmentation of selected ions species in the gas-phase. The utility of this experiment allows identification of varying saturated and unsaturated classes of glycerophospholipids (GPLs) in a biological matrix. In this work, we are able to characterize GPLs species at the subclass, headgroup, fatty acyl sum compositional levels,  leaving the location(s) of carbon-carbon single bond (C-C), carbon-carbon double bond (C=C), cyclopropane moiety, branching site and differentiate isomeric species. </p> <p><br></p> <p>All data were collected on modified a Sciex QTRAP4000 hybrid triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer. Briefly, alternately, pulsed nano-electrospray ionization (nESI) was used for ion generation. Deprotonated lipid anions were generated via negative ion mode nESI, mass selected during transit through Q1, and transferred to q2 for storage. Next, the charge inversion (IIRXN) reagent doubly charged magnesium complex cations, were generated via positive ion mode nESI. To facilitate the ion/ion reaction, magnesium complex dictations and lipid anions were simultaneously stored in q2, resulting in the formation of charge-inverted lipid cations. Ion-trap CID of charge-inverted isomers resulted in distinctive fragmentation, facilitating differentiation of isomeric and localization of unsaturation sites in acyl chain constituents. </p>