Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: A utilização de terapias celulares no tratamento de lesões musculoesqueléticas cresce mundialmente em larga escala e é cada vez mais aceita. As células tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas e expandidas in vitro, sendo tipicamente obtidas do próprio paciente (autóloga). Contudo, o uso de células provenientes de um animal doador (alogênica) e submetidas ao cultivo e a criopreservação, cria a oportunidade de iniciar o tratamento imediatamente após o diagnóstico. Há evidencias de que as CTMs possuem capacidade de imunomodulação, interagindo com os linfócitos T de diversas maneiras, além de não estimularem a indução de uma resposta imune complexa por não expressarem MHC II. Contudo, ainda há falta de consenso entre os estudos quanto a imunogenicidade das CTMs. Desta forma, o presente estudo objetivou avaliar a segurança da administração das células alogênicas em equinos através da análise de uma possível inflamação decorrente do implante alogênico de CTMs em músculo hígido de equinos, por meio de exame físico, ultrassonográfico, termográfico, histopatológico e pela expressão gênica de IL-1 beta e TNF- alfa. Os resultados demostraram que aplicação de CTM alogênicas é um processo seguro uma vez que não houveram alterações clínicas significativas, contudo uma segunda aplicação de CTM alogênicas de um mesmo doador levou ao aumento significativo da expressão gênica de TNF- alfa, podendo caracterizar uma resposta imune celular mais acentuada. Nossos resultados contribuíram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of cell therapy for treatment of musculoskeletal injuries in horses is increasing in large scale worldwide. The mesenchymal stem cells (MSCs) are easily isolated and expanded in vitro, making them promising for use in clinical trials. Typically, these cells are obtained from the own patient (autologous), however, cell from a donor horse (allogeneic) expanded in vitro and cryopreserved create the opportunity of immediate treatment after diagnosis. There is evidence that MSCs have immunomodulatory capacity by interacting with T lymphocytes in several ways, and do not stimulate a complex immune response for not expressing MHC II. However, there is still a lack of consensus among the studies on the immunogenicity of MSCs. Thus, this study aimed to evaluate the safety of administration of allogeneic mesenchymal stem cells in horses. For such a possible inflammation reaction to the implantation was analysed through physical examination, ultrasound, thermography, histopathology and gene expression of IL 1beta and TNF-alpha. The results showed that the implantation of allogeneic MSCs is a safe process since there were no significant clinical changes in the animals, but a second application of allogeneic MSCs from the same donor led to significant increase in gene expression of TNF-alpha, which can characterize a cellular immune response. Our results contribute to future research on treatment of musculoskeletal injuries in horses using MSCs, by creating banks of cells derived ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.

Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição protéica compromete órgãos linfo-hematopoéticos e modifica a resposta imune. Sabendo que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos hematopoéticos e que o microambiente medular apresenta distintos moduladores que atuam sinergicamente para influenciar a sobrevivência, proliferação e o desenvolvimento das células hematopoéticas em todos os seus níveis de diferenciação, avaliamos em um modelo de desnutrição, alguns aspectos da complexa regulação do microambiente medular avaliando a expressão de fatores de transcrição envolvidos no processo de diferenciação da Célula Tronco Mesenquimal (CTM) e capacidade de produção de citocinas importantes para o controle da hematopoese. Camundongos Balb/C machos, adultos, adaptados em gaioleiros metabólicos foram separados nos grupos controles e desnutridos recebendo, respectivamente, ração normoprotéica (12% de proteínas) e hipoprotéicas (2% de proteínas). Após o grupo desnutrido perder cerca de 20% do peso inicial, os animais foram sacrificados para a avaliação nutricional e hematológica caracterizando a desnutrição. As células mesenquimais foram isoladas da medula óssea (MO) e caracterizadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo mostrando populações de células em ambos os grupos com marcação positiva para CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, baixa marcação para CD34 e negativa para CD14, CD45. Na quantificação de fatores de transcrição por Western Blot verificou-se que células mesenquimais medulares de animais desnutridos apresentaram maior expressão de PPAR&#947; e RUNX2, fato este que pode ser explicado, em parte, pelo remodelamento microambiental observado nesses animais. Sobrenadantes de células mesenquimais de animais desnutridos quantificados por Elisa apresentaram uma maior concentração de SCF e uma redução na concentração de G-CSF e GM-CSF. As alterações encontradas nos permitem concluir que a desnutrição compromete as células mesenquimais tanto no aspecto regulatório de fatores de transcrição, bem como na capacidade de produção de citocinas, contribuindo para o comprometimento do microambiente hematopoético e induzindo a falência medular comumente observada em situações de desnutrição protéica. / Data from literature and our group showed that protein malnutrition compromises lympho-hematopoietic organs and modifies the immune response. Knowing that malnourished animals show severe hypoplasia of hematopoietic organs and the bone marrow microenvironment has distinct modulators that act synergistically to influence survival, proliferation and development of hematopoietic cells in all levels of differentiation, we evaluated in a model of protein malnutrition, some aspects of the complex regulation of bone marrow microenvironment evaluating the expression of transcription factors involved in the differentiation of Mesenchymal Stem Cells, and the production capacity of cytokines which are important in the regulation of the hematopoiesis. BALB/c mice, males, adults adapted in metabolic cages were separated in two groups: control and malnourished groups receiving, respectively, normal protein diet (12% protein) and low protein (2% protein). After the malnourished group lost about 20% of initial weight, the animals were sacrificed and evaluated the nutrition status, as well as hematological parameters. Mesenchymal Stem Cells were isolated from bone marrow and immunophenotypically characterized by flow cytometry showing cells populations in both groups stained positive for CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, low marking for CD34 and negative for CD14, CD45. In the measurement of transcription factors by Western Blot found that Mesenchymal Cells of bone marrow malnourished animals showed higher expression of RUNX2 and PPAR&#947;. This fact can be explained, in part, by microenvironmental remodeling observed in these animals. Mesenchymal stem cells supernatants of malnourished mice quantified by Elisa presented a higher concentration of SCF and a reduced concentration of G-CSF and GM-CSF. The alterations found in malnourished animals allow us to conclude that malnutrition commits Mesenchymal Stem Cells on the expression of transcription factors involved in the regulatory aspects of the differentiation process, as well as at the capacity of cytokine production, contributing to an impaired hematopoietic microenvironment and inducing the bone marrow failure commonly observed in protein malnutrition states.

Fissura de lábio com ou sem fissura de palato não-sindrômica (FL/P NS) é uma malformação craniofacial frequente, com modelo de herança multifatorial, onde fatores de risco genéticos e ambientais atuam na manifestação da doença. Variações nos níveis de expressão gênica têm sido apontadas como um importante mecanismo de susceptibilidade a doenças complexas, e variantes no DNA que regulam esses níveis de expressão (eQTL) têm sido combinadas a estudos de associação para auxiliar no entendimento da etiologia de algumas doenças. No presente trabalho, integramos eQTLs e estudo de associação para 1) verificar se variantes já associadas com FL/P NS possuem um papel regulatório em células-tronco de músculo orbicular do lábio (OOMMSC, um tecido afetado em FL/P NS), e 2) verificar se eQTLs mapeados em OOMMSC teriam associação com a mesma. Para o primeiro objetivo, verificamos a correlação entre os genótipos das variantes rs642961 e rs590223 e os níveis de expressão de IRF6, e também entre rs987525 e os níveis de expressão de MYC. Não encontramos correlação para nenhuma das três variantes testadas. É possível que essas variantes possuam um papel funcional em algum momento específico da embriogênese, ou mesmo que não tenhamos detectado essa correlação devido ao número amostral analisado (N=46). Para o segundo objetivo, realizamos um estudo de associação do tipo caso-controle dos eQTLs rs5011163, rs1505443, rs4793213, rs4793229 e rs1242500. Não encontramos associação entre nenhuma das cinco variantes e FL/P NS. Uma possível explicação para a associação negativa seria a significância marginal dessas variantes como eQTLs em OOMMSC. Além disso, estudos com baixo poder, como o mapeamento de eQTLs em OOMMSC realizado em outro projeto pelo nosso grupo, geralmente detectam os eQTLs de maior efeito, sendo esses frequentemente compartilhados entre tecidos, e, assim, podem não ter relevância para a doença em si. Outros eQTLs de OOMMSC, selecionados por critérios diferentes do presente estudo, estão sendo testados para associação com FL/P NS, o que nos permitirá avaliar a relevância dessa abordagem para detectar variantes de susceptibilidade a FL/P NS / Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) is a frequent craniofacial malformation, with a multifactorial model of inheritance, in which genetic and environmental risk factors act in disease manifestation. Variation of gene expression has been pointed as an important susceptibility mechanism to complex diseases, and DNA variants that regulate expression levels (eQTLs) have been combined with association studies to help elucidate the etiology of some diseases. In the present work, we integrate eQTL and association studies to 1) verify if variants associated with NSCL/P have a regulatory role in orbicularis oris muscle mesenchymal stem cells (OOMMSC, a tissue affected by NSCL/P); and 2) verify if eQTLs mapped in OOMMSC are associated with the disease. For the first goal, we verified the correlation of the rs642961 and rs590223 genotype variants with IRF6 expression levels, and also between the rs987525 genotype and MYC expression levels. We did not find correlation for any of the three variants tested. Possibly, these variants have a functional role in specific moments of embryogenesis, or sample size (N=46) was insufficient to detect correlation. For the second goal, we did a case-control association study for eQTLs rs5011163, rs1505443, rs4793213, rs4793229 and rs1242500. We did not find association between these variants and NSCL/P. The negative association could be explained by the marginal significance of these variants as eQTLs in OOMMSC. Besides, low-power studies, as the OOMMSC eQTL mapping performed in another project by our group, usually detect eQTLs of larger effect, which are frequently shared among tissues; therefore, they may not be relevant for the disease itself. Other eQTLs, selected under different criteria, are currently being tested for association with NSCL/P, which will enable us to evaluate the relevance of this approach to detect susceptibility variants for NSCL/P

O câncer de mama é uma doença heterogênea que é caracterizada por células epiteliais de mama malignas. As células-tronco cancerígenas (CST) no câncer de mama podem aumentar o potencial de agressividade através do tumor. O objetivo deste estudo é avaliar a expansão clonal do microambiente tumoral e a diferenciação celular após o estímulo com células estaminais mesenquimais. As células MSC derivadas da geléia de Wharton foram co-cultivadas com MCF- 7 em proporções de 1%, 10%, 30%. A co-cultura de MCF-7 com MSC mostrou alteração na localização da e-caderina para o citoplasma e, de preferência, o núcleo. Para a n-caderina, a co-localização foi predominantemente na membrana após a exposição do MSC. As células MCF-7 apresentaram colocalização do citoplasma e do núcleo no biomarcador de ?-catenina. Este fenômeno é confirmado à WB com o aumento dos níveis de proteínas de ecaderina no citoplasma no MCF-7 após o estímulo do MSC. A morfologia das transições amênico-mesenquimatosas foi mostrada no ensaio 3D em algumas colônias, no entanto esta morfologia não é predominante. A co-cultura de MCF- 7 com MSCs aumenta o número de mammosferes e influencia o aumento de CD44 + / CD24-, esse fenômeno foi possível sob estimulação de 30% das células MSC. A linhagem celular de câncer de mama MCF-7 em associação com MSC pode aumentar o potencial de agressividade através do tumor. Essa interação no microambiente do tumor é determinante para a expansão clonal e diferenciação celular, que são mecanismos relevantes no processo de disseminação metastática. / Breast cancer is a heterogeneous disease that is characterized by malignant breast epithelial cells. Cancer stem cells (CST) in breast cancer can boost a potential for aggressiveness trough the tumor. The goal for this study is to evaluated the tumor microenvironment clonal expansion and cellular differentiation after stimulus with mesenchymal stem cells. MSC cells derived from Wharton\'s jelly were co-cultured with MCF-7 in proportions 1%,10%,30%. The co-culture of MCF-7 with MSC showed alteration on localization of ecadherin to the cytoplasm and preferably nucleus. For n-cadherin, the colocalization were predominantly in membrane after MSC exposition. MCF-7 cells showed cytoplasm and nucleus co-localization on ?-catenin biomarker. This phenomenon is confirmed to WB with increasing the proteins levels of ecadherin on cytoplasm in MCF-7 after MSC stimulus. Amoeboid to mesenchymal transitions morphology were showed on 3D assay in some colonies, however this morphology is not predominant. The co-culture of MCF-7 with MSCs increase in the number of mammospheres and influence the increase of CD44+/CD24-, this phenomenon was possible under stimulation of 30% of MSC cells. The breast cancer cell line MCF-7 in association with MSC can boost a potential for aggressiveness trough the tumor. This interaction on tumor microenvironment is determinant for the clonal expansion and cellular differentiation, which are relevant mechanisms in the process of metastatic dissemination.

A engenharia de tecido ósseo associando células-tronco mesenquimais (CTMs) a biomateriais tem sido proposta como tratamento potencial para o reparo de defeitos ósseos, constituindo uma abordagem nova na área da medicina regenerativa e de amplo interesse para as áreas de cirurgia buco-maxilo-facial e ortopedia. A seleção das CTMs mais adequadas e o método utilizado para carreá-las nos sítios de defeitos ósseos são fatores importantes para o sucesso do tratamento. Como a osteoporose reduz a capacidade de regeneração dos ossos, seria de grande importância que a engenharia do tecido ósseo pudesse ser aplicada com sucesso nessa patologia. Assim, foi avaliado o potencial das CTMs de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) associadas ao arcabouço de vitrocerâmica BioS-2P ou a membrana de P(VDF-TrFE)/BT no reparo de defeitos ósseos em ratas osteoporóticas. A osteoporose foi induzida por ovariectomia e comprovada pela análise microtomográfica dos fêmures. Nas ratas osteoporóticas foram criados defeitos ósseos nas calvárias que foram tratados com implantação de BioS-2P associado à CTMs-MO e CTMs-TA ou com a implantação de membrana de P(VDF-TrFE)/BT combinada com a injeção de CTMs-MO e CTMs-TA. Ao final de 4 semanas, as análises microtomográficas e histológica mostraram que não houve formação óssea nos defeitos sem qualquer tratamento, mas nos defeitos tratados com implantação de BioS-2P ou membrana de P(VDF-TrFE)/BT houve formação óssea independente da presença de CTMs. Apenas os defeitos tratados com membrana de P(VDF-TrFE)/BT e injeção de CTMs-MO apresentaram maior formação óssea, mas não ocorreu a regeneração. / Bone tissue engineering based on the combination of mesenchymal stem cells (MSCs) and biomaterials, has been proposed as a potential treatment for the repair of bone defects, constituting a new approach in the field of regenerative medicine and of interest to the areas of oral and maxillofacial surgery and orthopedics. To select the most suitable MSCs and an efficient method to carry them to the bone defects are the key for the successful treatment. Considering that osteoporosis represents a challenge situation, it would be of the utmost importance that bone tissue engineering could be used in this pathological condition. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential of MSCs harvested from bone marrow (MSCs-BM) and from adipose tissue (MSCs-AT) associated to a vitreous scaffold (BioS-2P) or to a membrane of P(VDF-TrFE)/BT in regenerate bone defects created in osteoporotic rats. Osteoporosis was induced by ovariectomy and confirmed by microtomography of the femurs. Defects created in calvaria of osteoporotic rats were implanted with either Bios-2P seeded with MSCs-BM and MSCs-AT or a membrane of P(VDF-TrFE)/BT combined with injection of MSCs-BM and MSCs-AT. After 4 weeks, microtomography and histological analyses showed that there was no bone formation in untreated defects but in those treated with BioS-2P or membrane of P(VDF-TrFE)/BT there was bone formation irrespective of the presence of MSCs. Only defects treated with membrane of P(VDF-TrFE)/BT and MSCs-BM injection resulted in greater bone formation but there was not full bone regeneration.

Na espécie equina, as enfermidades osteoarticulares causam prejuízo econômico e impacto negativo no desempenho atlético, devido aos danos causados na cartilagem articular. A regeneração da cartilagem hialina e a manutenção da integridade das estruturas que a compõe norteiam a busca do tratamento ideal. Neste contexto, este estudo foi delineado com o objetivo de investigar a presença de células-tronco mesenquimais (CTMs) no líquido sinovial (LS) e na membrana sinovial (MS) de equinos com articulações hígidas, com osteocondrite dissecante (OCD) e com osteoartrite (OA) e compará-las, visando estabelecer qual fonte celular possui melhor característica fenotípica e capacidade de diferenciação celular, mais especificamente, aquela que seja superior em relação à capacidade condrogênica. Foram utilizados equinos machos e fêmeas de diferentes idades, totalizando 97 articulações. O LS e MS foram coletados durante artroscopia e as células foram cultivadas, e avaliadas por citometria de fluxo com os anticorpos CD44, CD90, CD105, CD34; e por imunocitoquímica com os anticorpos nanog, oct4, PGP 9.5, lisozima, vimentina e citoqueratina. Adicionalmente, o potencial de diferenciação das células foi avaliado para as linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica. Foi realizado teste de tumorigenicidade em camundongos Balb-Cnu/nu, para comprovar aplicabilidade clínica, e posteriormente, as CTMs provenientes de LS de articulações hígidas foram aplicadas em articulações de equinos. A identidade das células foi comprovada durante o cultivo demonstrando características de adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. A média percentual das populações positivas para CD90 foi de 64,9% (LS-H), 48,3% (LS-OCD), 48,1% (LS-OA), 66,6% (MS-H), 40,2% (MS-OCD) e 40,3% (MS-OA). A porcentagem de células positivas para CD44 foi de 1,18% (LS-H), 3,98% (LS-OCD), 14,2% (LS-OA), 1,9% (MS-H), 2,17% (MS-OCD) 8,56% (MS-OA). Não foi observada expressão dos anticorpos CD34 e CD105. Na análise imunocitoquímica foi detectada expressão positiva para os anticorpos: lisozima, PGP 9.5, PCNA e vimentina, e negativa para nanog, oct4 e citoqueratina. A multipotência (osteogênica, condrogênica e adipogênica) das células foi confirmada através da coloração Alizarin Red para detecção de matriz de cálcio, Oil Red O para detecção de gotículas de gordura e azul de toluidina, alcian blue e hematoxilina eosina para detecção de matriz de proteoglicanos. Com relação aos resultados do teste tumorigênico, nenhum órgão dos camundongos foi afetado, assegurando a aplicabilidade das células estudadas. Ainda, as articulações de equinos tratadas, não apresentaram quaisquer sinais de reação inflamatória após aplicação de células alogênicas. Por fim, concluímos que, a fenotipagem positiva de CD44 e CD90 somada à capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e condrogênica confirma a presença de CTMs nas populações celulares obtidas de LS e MS de equinos. Também foi observado que as células de LS provenientes de articulações hígidas, são as de melhor utilização clínica, uma vez que apresentaram maior expressão de CD90 e demonstraram melhor capacidade de diferenciação celular em relação às células derivadas de articulações enfermas. Além disso, possuem método mais fácil de colheita em relação à colheita de MS, visando futura terapia celular na rotina clínica / In the equine species, osteoarticular diseases cause significant economic losses and negative impact on equine athletic performance. The hyaline cartilage regeneration and the maintenance of integrity of its components guide the search for the ideal treatment. In this scenario, this study aimed to investigate the presence of mesenchymal stem cell (MSCs) in the synovial fluid (SF) and in the synovial membrane (SM) of healthy equine joints, osteoarthritic (OA) and osteochondritic joints (OCD), comparing their potential as cellular sources, according to their differentiation ability, in particular with superior chondrogenic potential and the phenotypic characteristics of the MSCs. Ninety-seven equine joints from males and females of different ages were used to harvest cells. SF and SM were obtained during arthroscopy and the cells SF and SM were cultured and assessed for CD90, CD44, CD105 and CD34 markers by flow cytometry, and nanog, oct4, PGP 9.5, lyzozyme, vimentin and cytokeratin were assessed by immunocytochemistry. Additionally, cells were evaluated in vitro for their osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation potential. The tumorigenicity test was carried in Balb-C nu/nu mice, to verify the safety of cell sources and, later, mesenchymal stem cells harvested from healthy equine joints were injected into equine joints. The identity of these cells was confirmed during cell growth, through properties of plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The mean percentage of CD90 positive cells was 64.9% (SF-H), 48.3% (SF-OCD), 48.1% (SF-OA), 66.6% (SM-H), 40.2% (SM- OCD) and 40.3% (SM-OA). The percentage of CD44 positive cells was 1.18 % (SF-H), 3.98% (SF-OCD), 14.2% (SF-OA), 1.9% (SM-H), 2.17% (SM-OCD) and 8.56% (SM-OA). The expression of CD34 and CD105 antibodies was not observed. Through immunocytochemical analysis, expression for lysozyme, PGP9.5, PCNA e vimentin antibodies was detected and negative expression for nanog, oct4 e cytokeratin was observed. The multipotent capacity of mesenchymal stromal cells for lineage differentiation (osteogenic, chondrogenoic and adipogenic) was confirmed with different staining techniques: Alizarin Red enabled detection of the calcium matrix, Oil Red O enabled the detection of fat droplets and Toluidin Blue, Alcian Blue and haematoxylin eosin enabled detection of proteoglycan matrix. Results of tumorigenic tests in mice showed no compromise of any internal organ, assuring applicability of the studied cells. Furthermore, equine joints treated with MSC harvested from healthy joints did not show any signs of an inflammatory reaction after injection of the allogeneic cells. The presence of cells with positive CD44 and CD90 phenotypes and with the ability to differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages confirms the presence of MSCs in equine SF and SM. Cells obtained from healthy SF were more suitable for clinical application, for they presented higher CD90 expression and demonstrated greater differentiation capabilities, when compared to that of cells retrieved from compromised joints. In addition to that, SF derived cells are easier to obtain when compared to SM cells, aiming their future application clinical

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 &micro;m) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 &micro;m) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

A desnutrição proteico-energética (DPE) altera a hemopoese e, portanto, a geração de células imunológicas, bem como compromete o sistema imune. Desta forma, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. As células tronco mesenquimais (CTMs) possuem propriedades imunomodulatórias e são importantes na formação do estroma medular que sustenta a hemopoese. Visto que a L-glutamina (GLUT) é o aminoácido condicionalmente essencial mais consumido por CTMs, e que também apresenta capacidade imunomoduladora, investigou-se, neste trabalho, se a GLUT exerceria efeito sobre aspectos imunomodulatórios das CTMs em um modelo experimental de DPE. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c, os quais receberam rações normoproteica ou hipoproteica isocalóricas contendo, respectivamente, 12% e 2% de proteína por um período de 5 semanas. Após o isolamento e a caracterização de CTMs provenientes dos grupos controle (CTMct) e desnutrido (CTMdesn), cultivou-se essas células em 0, 0,6, 2 e 10mM GLUT, a fim de determinar a influência deste aminoácido sobre a expressão de fatores de transcrição e produção de citocinas por CTMct e CTMdesn. Adicionalmente, avaliou-se o efeito dos sobrenadantes das culturas de CTMct e CTMdesn sobre a proliferação e produção de citocinas por macrófagos e linfócitos esplênicos. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração de proteínas séricas, albumina e préa-lbumina. A DPE não modificou a morfologia e o fenótipo das CTMs, bem como não alterou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular. Por outro lado, a expressão de NFkB e STAT-3 e a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e TGF-&#946; por CTMs foram alteradas pela DPE e variaram de acordo com as concentrações de GLUT testadas. O aumento na concentração de GLUT diminuiu a expressão de NFkB e induziu a expressão de STAT-3 por CTMs obtidas de ambos os grupos. Quanto a produção de citocinas por essas células, observou-se uma diminuição nos níveis de IL-&#946; e IL-6 e uma elevação nos níveis de IL-10 e TGF-&#946; com o aumento na concentração de GLUT. Variações na concentração desse aminoácido não alteraram a produção de IL-17 ou IFN-&#947; por CTMct e CTMdesn. Ademais, a concentração de GLUT alterou, de forma diretamente proporcional, a taxa de proliferação das CTMs. Os meios condicionados de CTMct e CTMdesn diminuíram a proliferação de macrófagos e linfócitos esplênicos estimulados com LPS, induziram aumento na produção da citocina antiinflamatória IL-10 por ambos os tipos celulares e diminuíram a produção das citocinas pró-inflamatórias IL-12 e TNF-&#945; por macrófagos e IL-17 por linfócitos. Portanto, conclui-se que a GLUT possui efeito sobre a proliferação das CTMs, bem como a capacidade de imunomodular estas células. / Protein-energy malnutrition (PEM) alters hemopoiesis and, therefore, the generation of immune cells, and compromises the immune system. In this way, malnourished individuals are more susceptible to infections. Mesenchymal stem cells (MSCs) have immunomodulatory properties and are important in the formation of bone marrow stroma that supports hemopoiesis. Since L-glutamine (GLUT) is a conditionally essential amino acid, which is most consumed by MSCs, and present immunomodulatory capacity, this work investigated whether GLUT would have an effect on immunomodulatory aspects of MSCs in a PEM experimental model. For this purpose, BALB/c mice were used, which received isocaloric normoproteic or hypoproteic diets, containing respectively, 12% and 2% of protein for a period of 5 weeks. After isolation and characterization of MSCs from control (MSCct) and malnourished (MSCmaln) groups, these cells were cultured with 0, 0.6, 2 and GLUT 10mM in order to determine the influence of this amino acid on the expression of transcription factors and cytokine production by MSCct and MSCmaln. Besides that, the effect of MSCct and MSCmaln culture supernatants on proliferation and cytokine production by macrophages and splenic lymphocytes was evaluated. Malnourished animals presented anemia, leucopenia, marrow hypoplasia and decreased concentration of serum proteins, albumin and prealbumin. PEM did not change morphology and phenotype of MSCs or altered the expression of cell cycle regulatory proteins. On the other hand, the expression of NFkB and STAT-3 and the production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and TGF-&#946; by MSCs were modified by PEM and varied according to the tested GLUT concentrations. An increase in GLUT concentration decreased NFkB expression and induced STAT-3 expression by MSCs obtained from both groups. Regarding the production of cytokines by these cells, an increase in GLUT concentration resulted in decreased IL-1&#946; and IL-6 levels and increased IL- 10 and TGF-&#946; levels. Changes in the concentration of this aminoacid did not alter IL- 17 or IFN-&#947; production by MSCct and MSCmaln. Furthermore, the concentration of GLUT changed, in direct proportion, the proliferation of MSCs. The conditioned media MSCct and MSCmaln decreased the proliferation of macrophages and splenic lymphocytes stimulated with LPS, induced an increase in the production of the antiinflammatory cytokine IL-10 by both cell types, and decreased the production of proinflammatory cytokines IL-12 and TNF-&#945; by macrophages and IL-17 by lymphocytes. Therefore, it can be concluded that GLUT has an effect on the proliferation of MSCs and it has the capacity to immunomodulate these cells.

Protein malnutrition (PM) causes anemia and leukopenia by reduction of hematopoietic precursors and impaired production of mediators that induce hematopoiesis, as well as structural and ultrastructural changes in the bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in the bone marrow (BM) in distinct regions called niches, which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of the hematopoietic stem cell (HSC). The perivascular niche, composed mainly by mesenchymal stem cells (MSC) and endothelial cells (EC), is the major modulator of HSC and its function extends to the migration of mature hematopoietic cells into the peripheral blood through the production of cytokines and growth factors. Thus, our hypothesis is that PM changes the perivascular niche and our objective is to evaluate whether PM affects the modulatory capacity of MSC and EC on hematopoiesis. C57BL/6 male mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PM. We performed leukemic myelo-monoblasts cells transplantation and observed that these cells have a lower proliferation rate and are rather in the cell cycle G0/G1 phases in malnourished mice, indicating that the BM microenvironment is compromised in PM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC cells, which were evidenced by CD31 and CD144 markers. We performed the quantification of HSC and hematopoietic progenitors, as well as some regulators of proliferation and differentiation, ex vivo and after cultures with MSC or EC. We observed that PM reduces HSC and hematopoietic progenitors ex vivo. In PM, MSC promote increase in HSC and suppress hematopoietic differentiation, whereas ECs induce cell cycle arrest. Additionally, we verified that PM affects granulopoesis by decreasing the expression of G-CSFr in granule-monocytic progenitors. Thus, we conclude that PD compromises hematopoiesis due to intrinsic alterations in HSC, as well as alterations in the medullary perivascular niche. / A desnutrição proteica (DP) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese. A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões distintas chamadas de nichos, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto renovação da célula tronco hematopoiética (CTH). O microambiente perivascular, composto principalmente por células tronco mesenquimais (CTM) e células endoteliais (CE), é o principal modulador das CTH e sua função se estende até a migração das células hematopoiéticas maduras para o sangue periférico, através da produção de citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, nossa hipótese é que a DP altera o microambiente perivascular e objetivamos avaliar se a DP afeta a capacidade modulatória das CTM e CE sobre a hematopoese. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoproteica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoproteica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DP. Realizamos transplantes de mielomonoblastos leucêmicos e observamos que estas células apresentam menor taxa de proliferação e se encontram em maior quantidade nas fases G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos, indicando que o microambiente medular está comprometido. Isolamos CTM, que foram caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE, o que foi evidenciado pelos marcadores CD31 e CD144. Quantificamos CTH e progenitores hematopoéticos, bem como reguladores de proliferação e diferenciação, ex vivo e após culturas com CTM ou CE. Observamos que a DP reduz CTH e progenitores hematopoéticos ex vivo. Na DP, as CTM promovem incremento de CTH e suprimem a diferenciação hematopoética, enquanto que as CE induzem parada no ciclo celular. Adicionalmente, observamos que a DP afeta a granulopoese por diminuição da expressão de G-CSFr nos progenitores grânulo-monocíticos. Dessa forma, concluímos que a DP compromete a hematopoese por alterações intrínsecas na CTH, como também por alterações ocasionadas no microambiente perivascular medular.