O transplante intrauterino de células-tronco (TIUCT) é um método de tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas em um feto durante a gestação. Em pesquisa básica este modelo permite o estudo da dinâmica de migração, enxertia e estado funcional de diferentes tipos de células-tronco (CT). Estas células podem ser transplantadas em diferentes momentos do período gestacional, que pode ser dividido em três momentos do desenvolvimento fetal, sendo estes, diferentes funcionalmente. A escolha deste momento para o transplante influenciará tanto no comportamento celular quanto no resultado. Para o TIUCT são utilizadas as CT mesenquimais derivadas da medula óssea ou fetais ou hematopoiéticas. Para esta pesquisa utilizamos células-tronco derivadas da polpa dentária imatura humana (CTIPDh) as quais apresentam potencial pluripotente e propriedades imunomodulatórias. Nosso principal objetivo foi avaliar a capacidade migratória, bem como de proliferação e endereçamento (homing) das CTIPDh durante o terceiro período gestacional do desenvolvimento fetal no modelo canino. Todos os procedimentos experimentais foram elaborados sob protocolo anestésico apropriado e aprovados pelo comitê de ética da FMVZ da USP. Foram transplantadas via intraperitoneal (IP) 1x106 CTIPDh GFP+ em cada feto, durante procedimento cirúrgico de laparotomia exploratória com ultrassonografia guiada intraoperatóriamente em quatro fetos com idade gestacional aproximada de 45 dias, e outros dois fetos os quais não receberam o transplante, utilizados como controle. Avaliamos os fetos pré e pós-transplante através do ultrasson. Após sete dias, realizamos a ovário-salpingo-histerectomia (OSH) para a colheita dos fetos. Em seguida coletamos seus órgãos e tecidos os quais foram fixados em paraformoldeído a 4% e criopreservados a temperatura de -80oC. Analisamos a biodistribuição das CTIPDh dentro dos órgãos e tecidos em criocortes de 5µm sob microscopia Confocal. Constatamos o homing das CTIPDh nos órgãos derivados das linhas germinativas endodermais, ectodermais e mesodermais. No estômago e intestinos as CTIPD/GFP+ foram identificadas tanto no espaço intraglandular, como na camada muscular da mucosa; no fígado no parenquima hepático; no coração especialmente no tecido muscular do miocárdio; no cérebro nos vasos da substância branca, e cerebelo entre células de Purkinje. Na placenta estas células foram encontradas especialmente junto aos vasos. Quantificamos as CTIPD GFP+ utilizando a citometria de fluxo. Comparativamente dentre os órgãos analisados, obtivemos resultados expressivos do homing celular no miocárdio (~50%), no baço e fígado. Nossos resultados foram confirmados através das análises de imunohistoquímica e imunofluorescência utilizando os anticorpos Anti-núcleo (HuNu), Anti-CTIPD e Anti-GFP humanos. Concluímos que as CTIPDh apresentam grande potencial migratório e proliferativo após o TIUCT em fetos caninos. Estas células indiferenciadas demonstraram homing, especialmente nos tecidos: hematopoiéticos fetais (placenta, fígado e baço), tecido epitelial e glandular de órgãos, bem como de nichos perivasculares de CT. Estes dados sugerem que as CTIPD através do TIU, é uma alternativa viável, segura e promissora para o tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas. / Intra-uterine stem cells transplantation (IUSCT) is a method for the treatment of genetic, congenital, hematological, and immunological diseases. In basic research it provides a model for studying the dynamics of migration, graft and functional status of different types of stem cells. The cells can be transplanted in different moments of gestational period, which can be divided into quarters that are not functionally equivalent. The choice of the cells and quarter where the stem cells will be applied can influence cells behavior and results of transplantation. Fetal and adult hematopoietic or bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) were mainly used for IUSCT. We previously obtained human immature dental pulp stem cell (IDPSCs), which showed pluripotent potential and immune-compatible properties. The goal of our study was to evaluate migration capacity, proliferation and homing of IDPSCs after IUSCT during the third fetal period in dogs. All experimental procedures were approved by the Ethical Committee of the School of Veterinary Medicine and Animal Science of São Paulo University and were performed under appropriate anesthesia. 1x106 of undifferentiated GFP-positive human IDPSCs were transplanted following laparotomy and intraperitoneal injection under intra-operative ultrasound control into 5 fetuses at the 45 days of gestation. Five fetuses, which did not receive IDPSCs, were used as a control. Ultrasound analyses were performed daily before collection of the fetuses. After 7 days ovarian hysterectomy was performed, fetuses were collected; organs and tissues were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde or cryopreserved. Biodistribution of IDPSCs within the organs and tissues were analyzed on cryosections (5µm) under Confocal Microscopy. Homing of IDPSCs was observed in organs derived from three germ lines, endoderm, ectoderm and mesoderm. In stomach and in intestine GFP IDPSCs were found in intraglandular space as well as in muscularis mucosae. In liver they appeared in hepatic parenchyma; in heart in myocardium and in brain in bold vessels, in cerebellum within Purkinje cells. Using Flow cytometry assay GFP IDPSCs graft was quantified. Among the different organs an expressive homing was observed in myocardium of heart (~50%), in spleen and liver. The IDPSCs were also found in canine placenta, especially in blood vessels. These data were confirmed using anti-human nucleus (HuNu), anti-GFP and anti-IDPSCs anti-bodies. Human IDPSCs showed high migration and proliferation potential after IUSCT in dog fetuses. Undifferentiated IDPSCs demonstrated homing in fetal hematopoietic (placenta), epithelial (gastric glands) and perivascular stem cells niches. Our data suggest that IDPSCs is a new promising source for genetic, congenital, hematological, and immunological treatment for those diseases through IUSCT.

O transplante intrauterino de células-tronco (TIUCT) é um método de tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas em um feto durante a gestação. Em pesquisa básica este modelo permite o estudo da dinâmica de migração, enxertia e estado funcional de diferentes tipos de células-tronco (CT). Estas células podem ser transplantadas em diferentes momentos do período gestacional, que pode ser dividido em três momentos do desenvolvimento fetal, sendo estes, diferentes funcionalmente. A escolha deste momento para o transplante influenciará tanto no comportamento celular quanto no resultado. Para o TIUCT são utilizadas as CT mesenquimais derivadas da medula óssea ou fetais ou hematopoiéticas. Para esta pesquisa utilizamos células-tronco derivadas da polpa dentária imatura humana (CTIPDh) as quais apresentam potencial pluripotente e propriedades imunomodulatórias. Nosso principal objetivo foi avaliar a capacidade migratória, bem como de proliferação e endereçamento (homing) das CTIPDh durante o terceiro período gestacional do desenvolvimento fetal no modelo canino. Todos os procedimentos experimentais foram elaborados sob protocolo anestésico apropriado e aprovados pelo comitê de ética da FMVZ da USP. Foram transplantadas via intraperitoneal (IP) 1x106 CTIPDh GFP+ em cada feto, durante procedimento cirúrgico de laparotomia exploratória com ultrassonografia guiada intraoperatóriamente em quatro fetos com idade gestacional aproximada de 45 dias, e outros dois fetos os quais não receberam o transplante, utilizados como controle. Avaliamos os fetos pré e pós-transplante através do ultrasson. Após sete dias, realizamos a ovário-salpingo-histerectomia (OSH) para a colheita dos fetos. Em seguida coletamos seus órgãos e tecidos os quais foram fixados em paraformoldeído a 4% e criopreservados a temperatura de -80oC. Analisamos a biodistribuição das CTIPDh dentro dos órgãos e tecidos em criocortes de 5µm sob microscopia Confocal. Constatamos o homing das CTIPDh nos órgãos derivados das linhas germinativas endodermais, ectodermais e mesodermais. No estômago e intestinos as CTIPD/GFP+ foram identificadas tanto no espaço intraglandular, como na camada muscular da mucosa; no fígado no parenquima hepático; no coração especialmente no tecido muscular do miocárdio; no cérebro nos vasos da substância branca, e cerebelo entre células de Purkinje. Na placenta estas células foram encontradas especialmente junto aos vasos. Quantificamos as CTIPD GFP+ utilizando a citometria de fluxo. Comparativamente dentre os órgãos analisados, obtivemos resultados expressivos do homing celular no miocárdio (~50%), no baço e fígado. Nossos resultados foram confirmados através das análises de imunohistoquímica e imunofluorescência utilizando os anticorpos Anti-núcleo (HuNu), Anti-CTIPD e Anti-GFP humanos. Concluímos que as CTIPDh apresentam grande potencial migratório e proliferativo após o TIUCT em fetos caninos. Estas células indiferenciadas demonstraram homing, especialmente nos tecidos: hematopoiéticos fetais (placenta, fígado e baço), tecido epitelial e glandular de órgãos, bem como de nichos perivasculares de CT. Estes dados sugerem que as CTIPD através do TIU, é uma alternativa viável, segura e promissora para o tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas. / Intra-uterine stem cells transplantation (IUSCT) is a method for the treatment of genetic, congenital, hematological, and immunological diseases. In basic research it provides a model for studying the dynamics of migration, graft and functional status of different types of stem cells. The cells can be transplanted in different moments of gestational period, which can be divided into quarters that are not functionally equivalent. The choice of the cells and quarter where the stem cells will be applied can influence cells behavior and results of transplantation. Fetal and adult hematopoietic or bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) were mainly used for IUSCT. We previously obtained human immature dental pulp stem cell (IDPSCs), which showed pluripotent potential and immune-compatible properties. The goal of our study was to evaluate migration capacity, proliferation and homing of IDPSCs after IUSCT during the third fetal period in dogs. All experimental procedures were approved by the Ethical Committee of the School of Veterinary Medicine and Animal Science of São Paulo University and were performed under appropriate anesthesia. 1x106 of undifferentiated GFP-positive human IDPSCs were transplanted following laparotomy and intraperitoneal injection under intra-operative ultrasound control into 5 fetuses at the 45 days of gestation. Five fetuses, which did not receive IDPSCs, were used as a control. Ultrasound analyses were performed daily before collection of the fetuses. After 7 days ovarian hysterectomy was performed, fetuses were collected; organs and tissues were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde or cryopreserved. Biodistribution of IDPSCs within the organs and tissues were analyzed on cryosections (5µm) under Confocal Microscopy. Homing of IDPSCs was observed in organs derived from three germ lines, endoderm, ectoderm and mesoderm. In stomach and in intestine GFP IDPSCs were found in intraglandular space as well as in muscularis mucosae. In liver they appeared in hepatic parenchyma; in heart in myocardium and in brain in bold vessels, in cerebellum within Purkinje cells. Using Flow cytometry assay GFP IDPSCs graft was quantified. Among the different organs an expressive homing was observed in myocardium of heart (~50%), in spleen and liver. The IDPSCs were also found in canine placenta, especially in blood vessels. These data were confirmed using anti-human nucleus (HuNu), anti-GFP and anti-IDPSCs anti-bodies. Human IDPSCs showed high migration and proliferation potential after IUSCT in dog fetuses. Undifferentiated IDPSCs demonstrated homing in fetal hematopoietic (placenta), epithelial (gastric glands) and perivascular stem cells niches. Our data suggest that IDPSCs is a new promising source for genetic, congenital, hematological, and immunological treatment for those diseases through IUSCT.

Orientador: Fausto Viterbo de Oliveira Neto / Resumo: As deformidades craniofaciais decorrentes de traumas, ressecções de tumores ou malformações congênitas são freqüentes na prática médica e o tratamento destas necessitam de cirurgia reparadora, com técnicas especializadas e profissionais qualificados para corrigir os defeitos e proporcionar melhor qualidade de vida, aprimorar a fala, respiração, mastigação e deglutição. Há diversas técnicas descritas para corrigir os defeitos ósseos, cada uma com vantagens e desvantages, escolhidas de acordo com o tipo de deformidade. Este estudo avaliou a formação óssea em um retalho tubular vascularizado, gáleo-periostal, enriquecido com o uso de pó de osso, plasma rico em plaquetas, células-tronco mesenquimais e ácido hialurônico, em coelhos, que tenha capacidade de substituir o enxerto ósseo nas reconstruções, principalmente nos defeitos faciais. No estudo, utilizou-se 98 coelhos divididos em doze grupos, submetidos à cirurgia para confecção do retalho em calota craniana. Foram realizados retalhos tubulares com o periósteo voltado para dentro e preenchidos com pó de osso, plasma rico em plaquetas (PRP), células-tronco mesenquimais (CTM) e ácido hialurônico. O Grupo 1 não foi manipulado. No Grupo 2 foi realizado o retalho tubular e mantido vazio. O Grupo 3 teve o retalho preenchido com pó de osso, no Grupo 4 o retalho foi mantido vazio. O Grupo 5 teve o retalho preenchido com PRP. No Grupo 6 o retalho foi preenchido com PRP e pó de osso. O Grupo 7 foi preenchido com CTM. O Grupo 8 teve o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Ryane Schmidt Brock null (ryanesbrock@gmail.com) on 2017-02-07T11:09:28Z No. of bitstreams: 1 Tese doutorado final 2017.pdf: 138052465 bytes, checksum: f5b517e489dbadd6cf6b83fbef881ecd (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-09T20:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brock_rs_dr_bot.pdf: 138052465 bytes, checksum: f5b517e489dbadd6cf6b83fbef881ecd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-09T20:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brock_rs_dr_bot.pdf: 138052465 bytes, checksum: f5b517e489dbadd6cf6b83fbef881ecd (MD5) Previous issue date: 2017-01-31 / As deformidades craniofaciais decorrentes de traumas, ressecções de tumores ou malformações congênitas são freqüentes na prática médica e o tratamento destas necessitam de cirurgia reparadora, com técnicas especializadas e profissionais qualificados para corrigir os defeitos e proporcionar melhor qualidade de vida, aprimorar a fala, respiração, mastigação e deglutição. Há diversas técnicas descritas para corrigir os defeitos ósseos, cada uma com vantagens e desvantages, escolhidas de acordo com o tipo de deformidade. Este estudo avaliou a formação óssea em um retalho tubular vascularizado, gáleo-periostal, enriquecido com o uso de pó de osso, plasma rico em plaquetas, células-tronco mesenquimais e ácido hialurônico, em coelhos, que tenha capacidade de substituir o enxerto ósseo nas reconstruções, principalmente nos defeitos faciais. No estudo, utilizou-se 98 coelhos divididos em doze grupos, submetidos à cirurgia para confecção do retalho em calota craniana. Foram realizados retalhos tubulares com o periósteo voltado para dentro e preenchidos com pó de osso, plasma rico em plaquetas (PRP), células-tronco mesenquimais (CTM) e ácido hialurônico. O Grupo 1 não foi manipulado. No Grupo 2 foi realizado o retalho tubular e mantido vazio. O Grupo 3 teve o retalho preenchido com pó de osso, no Grupo 4 o retalho foi mantido vazio. O Grupo 5 teve o retalho preenchido com PRP. No Grupo 6 o retalho foi preenchido com PRP e pó de osso. O Grupo 7 foi preenchido com CTM. O Grupo 8 teve o retalho preenchido com CTM e pó de osso. O Grupo 9 teve o retalho preenchido com CTM e PRP. No Grupo 10, o retalho tubular foi preenchido com PRP, CTM e pó de osso. O Grupo 11 foi mantido vazio e o Grupo 12 foi preenchido com ácido hialurônico. Os resultados foram avaliados através de métodos de imagem e avaliação histológica. Os resultados demonstraram que, no modelo experimental utilizado, os grupos com apenas periósteo, isto é, retalho tubular vazio, apresentaram formação óssea pequena e irregular. No grupo com PRP também houve a formação óssea irregular e imatura. Quando o PRP foi associado ao pó de osso houve uma formação mais regular e organizada. O grupo com célula-tronco mesenquimal também apresentou formação óssea, com características teciduais organizadas, próprias do tecido ósseo maduro. Quando associada ao pó de osso e ao PRP, as características histológicas apresentaram-se com tecido organizado, regular, maduro com células bem formadas e organizadas. O uso de materiais com fatores de crescimento celular ósseo melhoram a qualidade e organização do tecido neoformado. Quanto maior o número de fatores de enriquecimento usados, melhores foram os resultados quanto a qualidade tecidual neoformada. / Craniofacial deformities caused by traumas, tumor ressections or congenital malformation are frequent in medical practice, and their treatment with reconstructive surgeries are common, especially in plastic surgery, which aim to provide the patients with better quality of life and functional improvement of speach, breathing, chewing and swallowing. Many different techniques are described to correct bone defects. They have advantages and disadvantages, chosen according to the type of deformity. This study evaluated a vascularized galeal and periosteum flap filled with bone fragments, platelet rich plasma, mesenchymal stem cells and hyaluronic acid, using rabbits, which could possibily substitute the bone graft in reconstructive surgery, especially for facial defects. It was an experimental study, with 98 rabbits divided into twelve groups, submitted to a surgical procedure to construct a calvaria flap. A tubular flap with the periosteum inside was constructed and filled with bone fragments, platelet rich plasma (PRP), mesenchymal stem cells (MSC) and hyaluronic acid. Group 1 was not manipulated. In Group 2, the tubular flap was maintained empty. Group 3 had the flap filled with bone fragments, in Grupo 4 the flap was maintained empty. Group 5 had the flap filled with PRP. In Group 6 the flap was filled with PRP and bone fragments. The Group 7 was filled with MSC. Group 8 had the flap filled with MSC and bone fragments. The Group 9 had the flap filled with MSC and PRP. In Group 10, the tubular flap was filled with PRP, MSC and bone fragments.The Group 11 was maintained empty and Group 12 was filled with hyaluronic acid. The results were evaluated using image methods and histological analysis. The results demonstrated that, in the experimental model used, the groups with only periosteum, this is the empty tubular flap, presented small and irregular bone formation. In the group with PRP, it also had irregular and imature bone formation. When the PRP was associated to bone fragments it had a more regular and organized formation. The group with mesenchymal stem cell also presented bone formation, with organized tissue characteristics, proper of mature osseous tissue. When associated to bone fragments and PRP, the histological characteristics presented organized, regular, mature tissue with organized and well formed cells. The use of materials with osseous cellular growth factors improves the quality and organization of the neoformed tissue. The more enrichment factor used, the better the neoformed tissue quality result was.