O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

A regeneração óssea é um processo fisiológico que promove a neoformação de tecido ósseo saudável e funcional com características idênticas antes da lesão. Entretanto, frente a defeitos críticos, o osso é incapaz de se regenerar espontaneamente. Diante destas deficiências, a bioengenharia de tecidos ósseos (BTO) é uma opção promissora para a regeneração deste tipo de defeito. A maioria das abordagens de BTO utiliza as células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSC), porém, a coleta de BMSC dos pacientes é um processo bastante invasivo e doloroso. Por estas desvantagens, a busca por abordagens acessíveis e menos invasivas de novas fontes de células-tronco (CT) se tornou necessária. Neste contexto, as células-tronco de polpa de dentes decíduos (SHED) foram identificadas e sua aplicação na BTO, desde então, vem sendo amplamente estudada devido ao seu potencial osteogênico e por se tratar de uma fonte não invasiva. A obtenção de células-tronco do músculo orbicular do lábio (OOMDSC) também não causa dor adicional aos indivíduos, pois os fragmentos deste tecido são rotineiramente descartados durante as cirurgias de reconstrução do lábio. No presente trabalho investigamos o potencial de diferenciação osteoblástico in vitro e in vivo das OOMDSC e comparamos com as SHED, além disto, associamos estas células a biomateriais de HA/&beta;-TCP e investigamos a sua contribuição na neoformação óssea in vivo. O imunofenótipo de cada amostra de SHED e OOMDSC foi verificado para certificar a identidade de CT mesenquimais. Em seguida, as células em cultura foram submetidas à diferenciação osteoblástica in vitro. Em 9 e 14 dias de diferenciação as OOMDSC apresentaram menor atividade de fosfatase alcalina (p<0,0001) e menor marcação de matriz extracelular mineralizada, comparado às SHED (p<0,001), enquanto que em 21 dias estas diferenças não foram mais observadas. Quando associadas a biomateriais e implantadas em defeitos críticos calvariais bilaterais em ratos Wistar, tanto OOMDSC e SHED foram capazes de induzir neoformação óssea após 50 dias de cirurgia, conforme evidenciado pela análise morfológica e por micro-CT. Todavia, as células ósseas encontradas nos sítios da neoformação óssea não eram de origem humana. A avaliação da neoformação óssea in vivo induzida por SHED assim como a sua distribuição no enxerto foi verificada também em 07, 15 e 30 dias pós-cirúrgicos. Nestes períodos não há evidência de neoformação óssea, entretanto, as SHED estão localizadas no tecido conjuntivo que se forma e preenche o enxerto. Além disto, os dados sugerem que estas células estão relacionadas à modificações na microarquitetura do biomaterial e ainda à modulação dos números dos osteoclastos, também verificada nestas amostras. Portanto, podemos concluir que as OOMDSC são tão capazes de se diferenciar em osteoblastos quanto às SHED in vitro, porém esta diferenciação é mais lenta. Os experimentos in vivo indicam que as SHED possuem maior capacidade de indução à neoformação óssea quando comparadas às OOMDSC e que, em nosso modelo, as CT humanas não se diferenciam em osteoblastos in vivo. De qualquer forma a adição das CT ao biomaterial favorece a neoformação óssea, variações de microarquitetura e modulação dos osteoclastos. O fato de as ilhas ósseas não serem de origem humana indica que as células-tronco possam estar secretando fatores de indução à osteogênese, estimulando a neoformação óssea a partir das células do hospedeiro. / Bone regeneration is a physiological process, which promotes the growth of tissue at the site of injury, with the same characteristics of the original bone. However, when faced with critical defects the bone is unable to regenerate spontaneously. Bone tissue engineering (BTE) is a promising option for regenerating this type of defect. The majority of the approaches in BTE use Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells (BMSC); however, the aspiration of bone marrow is a very invasive and painful procedure. Due to these disadvantages, the search for new, affordable and less invasive sources of stem cells (SC) has become necessary. In this context, stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) have been identified and their application in BTE, since then, has been widely studied because they can be obtained non-invasively and due to their osteogenic potential. Stem cells from the orbicularis oris muscle (OOMDSC) are also obtained non-invasively and do not cause additional pain to individuals, because the fragments of this tissue are routinely discarded during lip reconstruction surgeries. In the present work we investigated, in vitro and in vivo, the osteoblastic differentiation potential of OOMDSC and compared with SHED; furthermore, we associated these cells with HA/&beta;-TCP scaffolds and investigate its contribution in the bone formation in vivo. The immunophenotype of each OOMDSC and SHED sample was verified to attest their mesenchymal stem cell identity. Then, cell cultures were submitted to osteoblastic differentiation in vitro. In 9 and 14 days of differentiation, OOMDSC exhibited lower alkaline phosphatase activity (p <0.0001) and lower mineralized extracellular matrix staining compared to SHED (p <0.001), whereas at 21 days, these differences were no longer observed. When associated with scaffolds and implanted into bilateral critical-sized calvarial defects in Wistar rats, both OOMDSC and SHED were able to induce bone formation after 50 days of surgery, as evidenced by morphological analysis and micro-CT. However, bone cells found at sites of bone formation were not of human origin. The evaluation of new bone formation in vivo induced by SHED as well as its distribution in the graft was performed at 07, 15 and 30 days after surgery. During these periods there was no evidence of new bone formation, however, SHED were located in the connective tissue that formed and filled the graft. Furthermore, our results suggest that these cells are related to changes in the microarchitecture of the scaffold and also to the modulation of the number of osteoclasts observed in these samples. In summary, our results suggest that OOMDSC are as capable to differentiate into osteoblasts as SHED in vitro, but this differentiation is slower. In vivo experiments indicate that SHED has a greater ability to induce bone formation when compared with OOMDSC, and that in our model, the human stem cells do not differentiate into osteoblasts in vivo. Nonetheless, the addition of SC to the scaffolds promotes bone formation, as well as variations in microarchitecture and modulation of osteoclasts. The fact that the bone islands are not of human origin indicates that the stem cells may be secreting osteogenesis-inducing factors, stimulating the host\'s cells to regenerate the defects.

Os tecidos da polpa dentária e vibrissa são dois microambientes celulares que compartilham a mesma origem embrionária. Ambos possuem o seu nicho especifico pós-natal que abrigam células tronco adultas (CTA). O objetivo do trabalho foi investigar a expressão diferencial dos marcadores de células pluripotentes, mesenquimais e neuroepiteliais nas populações de células tronco isoladas das vibrissas (CTV) e polpa de dente (CTPD) de camundongos C57BL-6. Resultados obtidos no presente trabalho, utilizando o método de imunofluorescência, revelaram que as CTA de ambos tecidos expressam um amplo painel de marcadores de pluripotência (Oct4, Nanog e Sox2), mesenquimais (CD73, CD90 e CD105), hematopoiético (CD34), crista neural (CKit), neuronal (Nestina) e epitelial (Integrina &#945;6, LGR5 e LGR6) e indica possível potencial destas células em diversas linhagens celulares. Desta forma, células isoladas destes tecidos podem ser interessantes para serem aplicadas em diversos tratamentos na medicina regenerativa. Portanto, o estudo comparativo da expressão de um amplo painel de marcadores de células tronco em CTV e CTPD pode vir a aumentar o leque de possibilidades de sua utilização na terapia celular. Com isso, as células isoladas de polpa dentária foram submetidas à análise de expressão de marcadores já citados e a outros conhecidamente positivos e específicos para os folículos piloso como Citoqueratina 15 (CK15), LRig1 e Blimp1. Foram realizados ensaios de imunofluorescência, imunohistoquímica, citometria de fluxo e RT-PCR. Os dados obtidos nos permitiram concluir, que as CTA isoladas das ambas as fontes são bastante semelhantes em relação ao seu imunofenótipo, porém as características da sua diferenciação precisam ainda ser analisadas. / The tissues of the dental pulp and vibrissae are two cellular microenvironments that share the same embryonic origin. Both have their postnatal specific niche that keep adult stem cells (ASC). The objective of this study was to investigate the differential expression of pluripotent markers, mesenchymal and neuroepithelial in populations of stem cells isolated from whiskers (WSC) and dental pulp (DPSC) C57BL-6 mice. Results obtained in this study, using immunofluorescence, revealed that the ASC both tissues express a broad panel of pluripotency markers (Oct4, Nanog and Sox2), mesenchymal cells (CD73, CD90 and CD105), hematopoietic (CD34), crest neural (cKIT), neuronal (Nestin) and epithelial (Integrin &#945;6, LGR5 and LGR6) and indicates possible potential of these cells in several cell lines. Thus, isolated cells of these tissues may be interesting for application in various treatments in regenerative medicine. Therefore, the comparative study of the expression of a broad panel of stem cell markers in WSC and DPSC could increase the range of possibilities for their use in cell therapy. Thus, the isolated cells were subjected to the dental pulp marker expression analysis cited above and others known to be positive and specific to hair follicles as Cytokeratin 15 (CK15), and LRig1 Blimp1. Immunofluorescence assays were performed, immunohistochemistry, flow cytometry and RT-PCR. The data allowed us to conclude that the ASC isolated from both sources are quite similar with respect to their immunophenotype, but the characteristics of differentiation remain to be analyzed.

As células-tronco processam e são sensíveis a múltiplos sinais dentro de seu microambiente, os quais podem exercer influências que regulam seu destino e sua função de forma espaço temporal. Neste contexto, células podem exercer seu papel biológico por transferir informação genética e alterar expressão gênica de alvos celulares através de vesículas extracelulares (VEs). MicroRNAs (miRNAs), uma classe de pequenos RNAs não codificantes, podem ser encontrados nestas vesículas e são considerados moléculas efetivas no controle do neurodesenvolvimento por regular genes chaves em tempo controlado. Pouco se sabe sobre como a diferenciação influencia o conteúdo de miRNAs liberados via VEs revelando o papel dos mesmos no microambiente de cada etapa do comprometimento neural. Assim, a proposta deste estudo foi analisar o perfil de miRNAs intracelulares e presentes em VEs envolvidos na diferenciação neural dopaminérgica de células-tronco pluripotentes e identificar os possíveis alvos regulados pelos mesmos como mecanismo de estabelecimento de um destino neural específico. / Stem cells sense and process multiple signals in their microenvironment, which can exert influences that regulate cell fate and function in a time spatial manner. In this context, the stem cells can exert their biological role transferring genetic information and altering the genetic expression of target cells through extracellular vesicles (EVs). MicroRNAs (miRNAs), a class of small non coding RNAs, can be found in those EVs and are considered effective molecules in the control of neurodevelopment and differentiation by regulating key genes in a time specific manner. However, little is known about how the cell differentiation influences the miRNAs content released through EVs, and how these molecules function in the microenvironment of each phase of neural commitment. Thus, the purpose of this study was to analyze the intracellular and EVs miRNAs profiles involved in the dopaminergic differentiation of pluripotent stem cells in attempt to identify possible targets regulated by miRNAs as a mechanism of specific neural fate decision.

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo de terapia celular mais usada atualmente. As células-tronco da medula óssea humana, do sangue periférico mobilizado e do sangue do cordão umbilical (SCU) são as únicas fontes de células utilizadas clinicamente para a recuperação hematopoética, mas elas têm uma disponibilidade limitada e apenas um terço dos pacientes apresentam um doador compatível. Uma fonte alternativa para suprir esta demanda seriam as células hematopoéticas derivadas a partir de células-tronco pluripotentes. Célulastronco embrionárias (CTE) são um tipo de células pulripotentes caracterizadas por sua capacidade ilimitada de autorrenovação e diferenciação em todas as células especializadas do indivíduo adulto. A alta capacidade de diferenciação dessas células em linhagens específicas por métodos de indução in vitro faz delas grandes promessas para o desenvolvimento de novas tecnologias aplicáveis à medicina regenerativa e terapia celular. Entretanto, ainda é necessário determinar se células-tronco hematopoéticas (CTH) geradas a partir de células pluripotentes são funcionais in vivo. Assim, o objetivo desse estudo consistiu no desenvolvimento de um modelo animal para o transplante de células hematopoéticas humanas provenientes de células pluripotentes e utilizamos CTH de sangue de cordão umbilical como controle. Para tanto, realizamos a padronização da dose de irradiação subletal nos camundongos NOD / SCID IL2R ? null (NSG) e utilizamos duas concentrações de células, 1x106 e 0,75x106 de células hematopoéticas diferenciadas a partir de CTE e células do cordão umbilical. Os animais que receberam as células do SCU apresentaram uma taxa mais elevada de enxertia em comparação aos que receberam ás células diferenciadas a partir de CTE humanas. Foi confirmado que após quinze dias do transplante, a hematopoese é restabelecida e que células CD45+ humanas estavam presentes, porém em baixas quantidades. Sobretudo, os resultados aqui apresentados enfatizaram o descrito na literatura, porém não ultrapassando a 1,5% de enxertia na medula óssea. Estes dados indicaram que os camundongos NSG proporcionaram um microambiente hematopoético favorável para as CTE humanas porém, essas células precisam ser investigadas no que tange aos fatores que aumentem de sua duração in vivo, otimizando a enxertia. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSC) is the most widely used type of cell therapy nowadays. Human bone marrow, mobilized peripheral blood, and stem cells in the umbilical cord (UC) are the only sources of cells used clinically for hematopoietic recovery, but they have limited availability and only a third of patients have a matching donor. An alternative source to supply this demand would be hematopoietic cells derived from pluripotent stem cells. Embryonic stem cells (ESC) are a type of pulp-like cells characterized by their unlimited capacity for self-renewal and differentiation in all specialized cells of the adult individual. The high differentiation capacity of these cells in specific strains by in vitro induction methods makes great promises for the development of new technologies applicable to regenerative medicine and cell therapy. However, it remains to be determined whether hematopoietic stem cells (HTC) generated from pluripotent cells are functional in vivo. Thus, the objective of this study was to develop an animal model for the transplantation of human hematopoietic cells from pluripotent cells and to use HTC in the umbilical cord blood as a control. To do so, we performed standardization of the sublethal irradiation dose on the NOD / SCID IL2R ? null (NSG) mice and used two concentrations of cells, 1x106 and 0.75x106 hematopoietic cells differentiated from ESC and umbilical cord cells. The animals that received UC cells had a higher rate of grafting compared to those that received the differentiated cells from the human ESC. It was confirmed that after fifteen days of transplantation, hematopoiesis restored and that human CD45+ cells were present, but in low amounts. Above all, the results presented here emphasize the described in the literature, but not exceeding 1.5% of grafting in bone marrow. These data indicated that the NSG mice provided a hematopoietic microenvironment favorable to the human ESC, however, these cells need to be investigated with regard to factors that increase their duration in vivo, optimizing grafting.

Introdução: A neutropenia febril (NF) é um evento adverso intrínseco ao transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH), decorrente da mielossupressão ocasionada pelo procedimento, que impacta de modo importante na morbidade e na mortalidade do paciente. Objetivos: Analisar os pacientes submetidos ao TCTH quanto a ocorrência de NF. Método: Coorte retrospectiva conduzida com 61 pacientes submetidos ao TCTH no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. Foram extraídos dados relativos a características basais dos pacientes, procedimento de TCTH, tempo de internação e desfecho clínico para determinar os fatores associados à NF. As variáveis independentes foram idade, sexo, comorbidades, diagnóstico, tipo de transplante, regime de condicionamento, fonte das células, nº de CD34, tempo de enxertia, escore de risco pré-TCTH do EBMT, SAPSII. A NF foi definida de acordo com o Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTC/AE) v4.0, considerando o desfecho dicotômico, a duração em dias, a data da ocorrência, o grau e a análise de sobrevida. Os dados foram analisados por meio de testes paramétricos e não paramétricos, dependendo do nível de mensuração das variáveis e utilizaram-se Kaplan-Meier e regressão logística. Para todas as análises considerou-se nível de significância de 5%. Resultados: A incidência de NF nos pacientes submetidos ao TCTH foi de 78,7%, com duração média de 8,3 dias, sem diferença significativa entre os tipos de transplantes (p=0,176). Não foram encontrados fatores de risco para a NF, porém, os pacientes submetidos ao transplante autólogo (p=0,022) e ao regime de condicionamento mieloablativo (p=0,026) apresentaram menor sobrevida para este evento adverso. Os pacientes que utilizaram ventilação mecânica (p=0,052), que necessitaram do uso de drogas vasoativas (p=0,012) e que foram a óbito (OR=9,66; p=0,052), apresentaram NF em sua totalidade. Conclusão: A incidência de NF foi expressiva e, ainda que não tenham sido identificados fatores associados a ela, os pacientes submetidos ao regime NMA e TCTH alogênico apresentaram maior sobrevida para o surgimento de NF. Estes achados relativos a sobrevida podem subsidiar o enfermeiro na proposição de intervenções, visando evitar complicações infecciosas decorrentes da NF. / Introduction: Febrile neutropenia (FN) is an intrinsic adverse event to hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), due to the myelosuppression caused by the procedure, which has an important impact on patient morbidity and mortality. Objectives: To analyze the patients submitted to HSCT regarding the occurrence of FN. Method: Retrospective cohort with 61 patients submitted to HSCT at Hospital de Clínicas, State University of Campinas. Data were extracted on the baseline information of patients, HSCT procedure, time of hospitalization and clinical outcome to determine the factors associated with FN. The independent variables were age, gender, comorbidities, diagnosis, type of transplantation, conditioning regime, cell source, CD34 number, grafting time, pre-HSCT risk score of EBMT, SAPSII. The FN was defined according to the Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTC / AE) v4.0, considering the dichotomous outcome, duration in days, date of occurrence, degree and survival analysis. Data were analyzed using parametric and non-parametric tests, depending on the level of measurement of the variables and Kaplan-Meier and logistic regression were used. A significance level of 5% was considered for all analyzes. Results: The incidence of FN in patients submitted to HSCT was 78.7%, with an average duration of 8.3 days, with no significant difference between the types of transplants (p = 0.176). No risk factors were found for FN, however, patients submitted to autologous transplantation (p = 0.022) and myeloablative conditioning (p = 0.026) presented lower survival rates for this adverse event. Patients who used mechanical ventilation (p = 0.052), who required the use of vasoactive drugs (p = 0.012) and who died (OR = 9.66, p = 0.052) presented FN in their entirety. In addition, the occurrence of FN had an association with longer hospitalization time (p = 0.003). Conclusion: The incidence of FN was significant. Although no associated factors were identified, patients submitted to NMA and allogeneic HSCT presented a higher survival rate for the onset of FN. These findings regarding survival can subsidize the nurse in proposing interventions, in order to avoid infectious complications due to FN.

Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.

O câncer de pulmão está entre os tipos de câncer com maiores índices de mortalidade no mundo. Na década de 90, houve a descoberta de populações de células tumorais com características de células-tronco e implicou na hipótese das células-tronco cancerosas (CTCs). Se a hipótese das CTCs for correta, a recorrência/recidiva dos cânceres é gerada por uma porcentagem de células (CTCs) que prolifera pouco e é resistente a quimioterapia convencional. Desta forma, a busca por novos alvos terapêuticos que tenham como alvo estas CTCs tem enorme implicação no desenvolvimento de novos fármacos ou modalidades terapêuticas contra o câncer. O guaraná (Paullinia cupana Mart var. sorbilis) tem demonstrado efeitos promissores sobre o câncer, em especial efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos. Portanto, objetivando-se neste projeto avaliar a presença de CTCs a partir de células tumorais de pulmão de camundongo, onde se possa conseguir rapidamente uma alta porcentagem deste tipo celular para posteriores estudos, além de avaliar os efeitos do extrato etanólico do guaraná e de suas frações butanólica e aquosa, sobre as células tumorais e em especial verificar os efeitos sobre a população rica em CTCs, onde foi possível observar a presença de possíveis CTCs, a partir de cultivo de células tumorais de pulmão de camundongo, como também que o guaraná apresentou um efeito sobre estas possíveis CTCs devido a diminuição da expressão dos genes ABCG2 e ALDH1a1. / Lung cancer is among the cancers with the highest mortality rates in the world. In the 90\'s, there was the discovery of tumor cell populations with stem cell characteristics implied in the case of cancer stem cells (CSCs). If the hypothesis is correct CSCs of the recurrence / relapse of cancers is generated by a percentage of cells (CSCs) that growth low and are more resistant to conventional chemotherapy. Thus, the search for new therapeutic targets that target these CSCs has huge implications in developing new drugs or therapeutic approaches against cancer. Guarana (Paullinia cupana Mart var. Sorbilis) has shown promising effects on cancer, especially chemopreventive and anticancer effects. Therefore, the objective in this project is to evaluate the presence of CSCs from tumor cells of mouse lung, where it can quickly get a high percentage of this cell type for further studies and to evaluate the effects of ethanol extract of guarana and its butanol and aqueous fractions on tumor cells and in particular to verify the effect on the population rich in CSCs, where it was possible to observe the possible presence of CSCs from cultivation of tumor cells from mouse lung, as well as guarana presented an effect on these CSCs possible to decreased expression of ABCG2 and ALDH1a1 genes.

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular / Mesenchymal stem cells (MSC) display tropism to tumors, being recruited to its microenvironment where they comprise the tumor stroma. In brain, perivascular niche is a substantial source of MSC. Although mechanisms involved are poorly understood, MSC may directly and/or indirectly contribute to tumor development. Herein, the influence of MSC on the proliferation, invasiveness and tumorigenicity of human glioblastoma cells (GBM) was investigated. Moreover, since MSC releases TGFB1, a multifunctional cytokine with roles in immunomodulation, proliferation, migration and epithelial-mesenchymal transition of tumor cells, we analyzed if MSC-secreted TGFB1 affects GBM behavior. In vitro studies performed in the presence of conditioned media from human umbilical cord MSC with a stable TGFB1 gene expression knockdown showed that MSC-secreted TGFB1 is able to significantly increase the proliferation and viability of a GBM cell line (U87FP635). These results revealed an important paracrine effect of this regulatory cytokine when secreted by other cell types in tumor microenvironment. However, under experimental conditions that better mimic the tumor microenvironment, it was found that MSC also affect tumor cell behavior by an alternative mechanism dependent on cell-cell contact, but independent of TGFB1 levels secreted by MSC. The cell-cell contact between MSC and GBM U87FP635 significantly enhaced tumor viable cells. Additionally, the spheroid tumor cell culture with MSC cell contact increased the invasiveness of U87FP635 cells. Finally, in vivo ectopic implantation model showed more developed tumors when GBM U87FP635 cells were coinjected with MSC. These pro-tumorigenic effects were found both in cell-cell contact with control MSC, as with MSC containing TGFB1 gene expression knockdown. Thus, these findings indicate that MSC can exert pro-tumorigenic effects by two alternative and independent mechanisms: paracrine action of TGFB1 secreted by MSC and action mediated by cell-cell contact. In the present experimental conditions, the cell-cell contact-dependent mechanism was predominant. The secretome proteomic study of those cells identified 126 differentially expressed proteins as well as 10 proteins exclusively detected in conditioned media from GBM U87FP635 cell cocultures with MSC. About 80% of proteins uniquely secreted by cell-cell contact are exosomes components and are involved in cell proliferation and tissue development. These results indicate a dynamic interaction of communication between MSC and tumor cells and reveal some interesting proteins potentially involved in a MSC pro-tumorigenic action mediated by cell contact

Em fêmeas de mamíferos, um dos cromossomos X é inativado proporcionando compensação de dose entre os produtos gênicos de machos e fêmeas. A inativação do cromossomo X (ICX) ocorre no embrião em desenvolvimento, e se caracteriza pela aquisição de marcas heterocromáticas no cromossomo X inativado (Xi), que são mantidas nas células somáticas ao longo das divisões celulares. O melhor modelo para estudo do início da ICX são as células-tronco embrionárias femininas. Provenientes da massa celular interna de blastocistos, elas representam um embrião em desenvolvimento e possuem os dois X ativos; a diferenciação das células promove a ICX in vitro, o que permite a identificação dos fatores e mecanismos moleculares envolvidos. A derivação de linhagens de célulastronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells - hESCs) em 1998 permitiu novas possibilidades de estudo da ICX, pois a maioria dos trabalhos procurou esclarecer o mecanismo da ICX no modelo murino. Tradicionalmente, a manutenção da ICX em humanos tem sido investigada em células somáticas híbridas ou transformadas; porém, sabe-se que estas não representam um contexto celular natural. Assim, o presente trabalho teve como objetivos principais explorar a potencialidade de hESCs no estudo do início da ICX, e ainda investigar a função de três fatores na manutenção da ICX em células humanas imortalizadas: DNMT1 (enzima responsável pela manutenção da metilação do DNA), SMCHD1 (proteína da família de coesinas/condensinas), e XIST (um RNA não-codificador que inicia o processo de heterocromatinização do futuro Xi) foram selecionados para este estudo, uma vez que todos participam da manutenção da ICX em camundongos. Até o momento foram derivadas em nosso laboratório quatro linhagens de hESCs, as primeiras da América Latina. A caracterização das linhagens mostrou que, apesar de se manterem indiferenciadas, as hESCs femininas encontram-se em estágio pós-ICX, pois mesmo indiferenciadas já apresentam um dos X inativado. Nossos dados indicam que, submetidas às atuais condições de cultivo, as hESCs não são bons modelos para o estudo do início da ICX, e é possível que a inativação de um cromossomo X durante o cultivo confira alguma vantagem seletiva às células. A estratégia utilizada no estudo da manutenção da ICX foi o silenciamento dos três genes por interferência de RNA (RNAi). Não foi possível diminuir significativamente a expressão dos genes XIST e SMCHD1. Porém, o silenciamento de DNMT1 foi expressivo, e em resposta foi observada reativação do gene MAOA, localizado no cromossomo X e submetido à inativação. Apesar de nossas análises mostrarem que os efeitos da diminuição de DNMT1 foram restritos ao gene MAOA, estes resultados sugerem a existência de diferentes hierarquias de controle epigenético dos genes submetidos à ICX em células humanas / In female mammals, one of the X chromosomes is inactivated to achieve dosage compensation between males and females. The X chromosome inactivation (XCI) occurs early during embryogenesis and is characterized by the acquisition of heterochromatic features on the inactive X (Xi), which are maintained during all the subsequent cell divisions. Embryonic stem cells are the most suitable cells to study the establishment of XCI. They are obtained from the inner cell mass (ICM) of blastocysts, and can represent a developing female embryo, possessing two active X-chromosomes; when differentiated, these cells recapitulate XCI in vitro, and thus one can identify XCI regulators and factors involved. The derivation of human embryonic stem cells (hESCs) in 1998 offered new possibilities to study XCI, since most of the mechanistic studies of XCI have so far been investigated in the mouse model system. Traditionally, maintenance of XCI in humans has been addressed in somatic cell hybrids or transformed cells; however, they do not represent a natural cellular context. The main goals of the present work were to verify the potential of hESCs as models of XCI, and also to study the function of three important factors in XCI maintenance in immortalized human cells. DNMT1 (DNA-methyltransferase 1), SMCHD1 (a cohesin/condensin protein family member) and the XIST gene (a non-coding RNA which triggers XCI and promotes X heterochromatin formation on the future Xi) were selected, as they are key factors in XCI maintenance in the mouse. Until now four hESCs lines were derived in our lab. Their characterization showed that, in spite of been undifferentiated, the female hESCs have already undergone XCI. Our data suggest that, under the actual culture conditions, hESCs are not good models to study XCI, and it is also possible that X inactivation confers selective advantage to hESCs. Knockdown by RNA interference was used to study the roles of three genes in XCI maintenance. We could not efficiently knockdown XIST or SMCHD1. However, the DNMT1 silencing was substantial, and led to the reactivation of MAOA, an X-linked gene subjected to XCI. Although the effect of DNMT1 silencing was restricted to MAOA, our data suggest that there are different epigenetic hierarchies to control the expression of the genes subjected to XCI in human cells.