O objetivo deste estudo foi caracterizar as respostas das células mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal (PDLSCs) ao extrato proteico total de Porphyromonas gingivalis (PgPE) e avaliar seu impacto nas propriedades biológicas das células leucêmicas promielocíticas humanas HL-60. PDLSCs enriquecidas com CD105 foram semeadas em placas de 6 poços durante 24h. Em seguida, as células foram desafiadas com PgPE (0 e 2 mg/ml) durante 3h (período de exposição). Os sobrenadantes foram então descartados; PDLSCs foram lavadas com PBS e cultivadas por 18h adicionais. Por fim, os sobrenadantes foram coletados. Os níveis de citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes foram avaliados por ensaios multiplex. Na sequência, o efeito dos sobrenadantes derivados de PDLSCs (tratadas ou não com PgPE) sobre a ativação, o recrutamento e a resposta inflamatória de HL-60 foi avaliado. PDLSCs responderam ao tratamento com PgPE. RANTES, eotaxina e IP-10 (proteína produzida por IFN-?) foram detectados apenas em sobrenadantes de PDLSCs/PgPE. Além disso, PgPE induziu maior secreção de proteína quimiotática de neutrófilos (MCP)-1, intérferon (IFN)-?, interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1ra (p> 0,05). O recrutamento de HL-60D aumentou 4,7 vezes quando estas células foram expostas a sobrenadantes PDLSCs/PgPE, enquanto que os sobrenadantes de PDLSCs não afetaram a quimiotaxia de HL-60D. Sobrenadantes PDLSCs promoveram uma redução de 16% na produção de espécies de oxigênio reativo (ROS) por HL-60D estimuladas por PMA (p=0,013). Em contraste, sobrenadantes PDLSCs/PgPE promoveram um aumento de 1,78±1,04 vezes (p=0,046) na produção de ROS. Finalmente, tanto sobrenadantes PDLSCs, como sobrenadantes PDLSCs/PgPE, não influenciaram a produção de fator de necrose tumoral (TNF)-? e IL-1? pelas HL-60D em resposta ao lipopolissacarídeo (LPS). Esses achados sugerem um importante papel das PDLSCs no reconhecimento de P. gingivalis, recrutamento de células imunes inatas e ativação de mecanismos antimicrobianos. / The aim of this study was to characterize periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells (PDLSCs) responses to Porphyromonas gingivalis total protein extract (PgPE) and its impact on human leucocyte promyelocyte cells HL-60 biological properties. CD105-enriched PDLSCs were seeded in 6-well plates for 24h. Next, cells were challenged with PgPE (0 and 2mg/ml) for 3h (exposure period). Supernatants were then discarded, cells were washed with PBS, and cultured further for 18h before supernatants were collected. Supernatants\' cytokine and chemokine levels were assessed by bead-based multiplex assays. The effect of supernatants collected from untreated and PgPE-treated PDLSCs on HL-60D activation, recruitment and inflammatory responses was determined. PDLSCs were responsive to PgPE treatment. RANTES, eotaxin, and interferon-inducible protein (IP)-10 were detected only in supernatants collected from PgPE treated cells. Moreover, PgPE induced higher monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, interferon (IFN)-?, interleukin (IL)-6, IL-8 and IL-1ra secretion (p > 0.05). HL-60D recruitment was increased by 4.7 fold when exposed to PDLSCs/PgPE supernatants, whereas PDLSCs supernatants did not affect HL-60D chemotaxis. PDLSCs supernatants promoted a 16% reduction in radical oxygen species (ROS) production by PMA-stimulated HL-60D (p=0.013). On the contrary, PDLSCs/PgPE supernatants promoted a 1.78 ± 1.04 fold increase (p=0.046) in ROS production. Finally, both PDLSCs and PDLSCs/PgPE supernatants had no effect on HL-60D tumor necrosis factor (TNF)-? and IL-1? responses to lipopolysaccharide (LPS). These findings strongly suggest an important role of PDLSCs in the recognition of P gingivalis, recruitment of innate immune cells and activation of antimicrobial mechanisms.

Em busca de novas estratégias para o reparo de tecidos pulpares com células-tronco faz-se necessário compreender melhor o nicho em que elas se encontram. Uma forma é observar o mecanismo de ativação sobre estas células durante o reparo de tecidos pulpares após sofrer uma injúria. Assim, foi proposto estudar a localização e composição do nicho das célulastronco da polpa dental através da exposição pulpar induzida in vitro em dentes humanos e in vivo em dentes de ratos, através da incorporação de Bromodeoxiuridina (BrdU) e Iododeoxiuridina (IdU) e co-expressão com proteínas de células-tronco. Para o ensaio in vitro, 33 terceiros molares humanos com rizogênese incompleta foram divididos em 3 grupos: dentes com exposição pulpar induzida e mantidos em cultivo (GCE, grupo cultura exposição) (n=15); dentes sem injúria e mantidos em cultivo (GCC, grupo cultura controle) (n=15); dentes hígidos apenas (GH, grupo hígido) (n=3). Os grupos GCE e GCC, foram cultivados com BrdU (10 l/ml) por 24h e posteriormente analisados após 2, 5 e 14 dias. Para o ensaio in vivo, 12 ratos Wistar receberam IdU (1mg/ml) diluído na água por 30 dias. Após 45 dias foram divididos em 2 grupos: grupo in vivo com exposição pulpar (GIVE) (n=17 dentes) e grupo in vivo controle (GIVC) (n=16 dentes). No GIVE foi realizada a exposição pulpar no primeiro molar e em seguida restaurado com Coltosol. Após 2, 4 e 8 dias pós-operatórios as amostras foram coletadas e processadas para análise histológica e imuno-histoquímica. As proteínas CD90, CD146, PDGFr e BrdU foram analisadas em duas áreas: lesão e centro em molares humanos enquanto, as proteínas CD90, NG2 e IdU foram analisadas em uma área única, em molares de rato. As análises estatísticas foram efetuadas pelos testes de Mann- Whitney e Kruskal-Wallis, p 5%. Em dentes humanos, na área de lesão do grupo GCE, células BrdU positivas foram encontradas nos três períodos, sendo presentes em maior número células PDGFr positivas nos dias 2 e 5 e células CD90 positivas no 14º dia; no centro pulpar, no 2º dia pós injúria houve um número semelhante de células CD90, CD146 e PDGFr positivas, sendo encontradas em maior porcentagem no 5º dia células PDGFr e CD90 positivas e 14º dia células CD90 positivas. No grupo GCC na área equivalente à lesão, células CD90 (2 e 5 dias) e PDGFr (14 dias) positivas foram encontradas em maior percentual; no centro pulpar, o número de células positivas para CD90, CD146 e PDGFr foi semelhante em todos os períodos, sendo encontradas células BrdU positivas no 2º dia. Em molares de ratos, no GIVE houveram mais células NG2 positivas no 2º dia, IdU no 4º dia e CD90 no 8º dia. No GIVC, o CD90 foi altamente expresso em todos os períodos analisados, a proteína NG2 também foi expressa em odontoblastos e CD90 na camada subodontoblástica em molares de rato. Todas as proteínas mencionadas coexistem no tecido pulpar humano e animal formando populações celulares heterogêneas perivasculares e perineurais encontradas em maior concentração em regiões próximas à área de injúria, sugerindo que nichos perivasculares e perineurais participam em conjunto na homeostase pulpar em resposta à injúria. / In pursuit of new strategies for pulp tissue repair with stem cells, it is necessary to better understand the niche in which they are found. One way is to observe the mechanism of these cells activation during the repair of pulp tissues after suffering an injury. Thus, it was proposed to study the location and composition of the dental pulp stem cell niche through induced dental pulp exposure in vitro in human teeth and in vivo in rat teeth by incorporating Bromodeoxyuridine (BrdU) and Iododeoxyuridine (IdU) and co-expression with stem cell proteins. For the in vitro assay, 33 human third molars with incomplete rhizogenesis were divided into 3 groups: teeth with induced pulp exposure and maintained in culture (GCE, group cultured with pulp exposure) (n = 15); healthy teeth maintained in culture (GCC, control cultured group) (n = 15); healthy teeth only (GH, healthy group) (n = 3). GCE and GCC groups were cultured with BrdU (10 l / ml) for 24 h and subsequently analyzed after 2, 5 and 14 days. For the in vivo assay, 12 Wistar rats received IdU (1mg / ml) diluted in water for 30 days. After 45 days were divided into 2 groups: in vivo group with pulp exposure (GIVE) (n = 17 teeth) and in vivo control group (GIVC) (n = 16 teeth). In GIVE, the pulp exposure was performed on the first molar and then restored with Coltosol. After 2, 4 and 8 postoperative days the samples were collected and processed for histological and immunohistochemical analysis. CD90, CD146, PDGFr and BrdU proteins were analyzed in two areas: injury and center in human molars whereas, CD90, NG2 and IdU were analysed in a single area in rat molars. Statistical analyzes were performed by the Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, p 5%. In human teeth, in the lesion area of the GCE group, BrdU positive cells were found in the three periods, while a greater number of PDGFr positive cells on days 2 and 5 and CD90 positive cells on the 14th day was found; in the pulp center, on the second day after injury there were a similar number of CD90, CD146 and PDGFr positive cells, and found in greater percentage in the 5th day PDGFr and CD90 positive cells and in 14th day CD90 positive cells. In the GCC group, in the area equivalent to injury site, CD90 (2 and 5 days) and PDGFr (14 days) positive cells were found in a higher percentage; in the pulp center, the number of cells positive for CD90, CD146 and PDGFr was similar in all periods, and BrdU positive cells were found on day 2. In rat molars, GIVE presented more positive cells for NG2 on day 2, for IdU on day 4 and CD90 on day 8. In the GIVC, CD90 was highly expressed in all periods analysed, the NG2 protein was also expressed in odontoblasts and CD90 in the subodontoblastic layer in rat molars. All mentioned proteins coexist in the human and animal pulp tissue forming heterogeneous perivascular and perineural cellular populations found in greater concentration in regions near the area of injury, suggesting that perivascular and perineural niches participate together in pulpal homeostasis in response to injury.

A osseointegração de implantes de titânio (Ti) é dependente da interação entre a superfície de Ti e células, a qual é modulada por diversas vias de sinalização intracelular. Sabe-se que as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs), membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), atuam tanto na osteogênese, quanto na adipogênese e, portanto, podem estar envolvidas no processo de osseointegração de Ti. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a interação entre células-tronco mesenquimais (CTMs) e superfícies de Ti usinada e com nanotopografia é modulada, ao menos em parte, por ERK1/2 e o consequente efeito da inibição dessas ERKs na diferenciação osteoblástica e adipocítica. Para isso, CTMs derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre discos de Ti usinados e com nanotopografia em condições osteogênicas e adipogênicas, na presença ou não do inibidor de ERK1/2, PD98059, em concentração previamente determinada (25 μM) e foram avaliados parâmetros relacionados à diferenciação osteoblástica e adipocítica. Os resultados mostraram que a expressão gênica dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC) foi aumentada pela inibição da via de sinalização de ERK1/2 nas células crescidas sobre Ti usinado e apenas ALP e OC, naquelas crescidas sobre Ti com nanotopografia. A expressão proteica de RUNX2 foi discretamente maior nas células crescidas sobre Ti usinado, mas não sobre Ti com nanotopografia, quando ERK1/2 foram inibidas e essa inibição não afetou a formação de matriz extracelular mineralizada, independentemente da superfície de Ti avaliada. Com relação à diferenciação adipocítica, a inibição da via de sinalização de ERK1/2 aumentou a expressão gênica dos marcadores adipocíticos PPARγ, adiponectina (ADIPOQ) e proteína ligadora de ácido graxo do adipócito ( AP2) nas células crescidas sobre ambas as superfícies de Ti, com efeito mais acentuado na superfície usinada, sem afetar a formação de acúmulo lípidico. Em conclusão, os resultados mostraram que a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação osteoblástica de CTMs crescidas sobre a superfície de Ti usinada, mas não sobre Ti com nanotopografia. Além disso, a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação adipocítica de CTMs crescidas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e usinada, sendo o efeito mais acentuado na usinada. Considerando aplicações terapêuticas, esses resultados são relevantes para direcionar o desenvolvimento de superfícies de biomateriais que atuem em vias de sinalização que sabidamente modulam o processo de osteogênese. / Osseointegration of titanium (Ti) implants depends on interaction between Ti surface and cells, which is modulated by several intracellular signaling pathways. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) are members of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) family and act on both osteogenesis and adipogenesis and, therefore, may be involved in the process of Ti osseointegration. In this context, the aim of this study was to evaluate if the interaction between mesenchymal stem cells (MSCs) and Ti surfaces, either machined or with nanotopography, is modulated, at least in part, by ERK1/2 and the effect of ERK1/2 inhibition on osteoblast and adipocyte differentiation. Rat bone marrow MSCs were cultured on Ti discs either machined or with nanotopography under osteogenic and adipogenic conditions, in presence or not of the ERK1/2 inhibitor, PD98059, at a concentration previously determined (25 μM) and it was evaluated parameters related to osteoblast and adipocyte differentiation. The results showed that gene expression of the bone markers RUNX2, osterix (OSX), alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) was increased by ERK1/2 signaling inhibition in cells grown on machined Ti and only ALP and OC in cells grown on Ti with nanotopography. RUNX2 protein expression was slightly higher in cells grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography, when ERK1/2 signaling was inhibited and such inhibition did not affect extracellular matrix mineralization, irrespective of the evaluated Ti surface. Regarding adipocyte differentiation, ERK1/2 signaling inhibition increased gene expression of the adipose tissue markers PPARγ, adiponectin (ADIPOQ) and adipocyte fatty acid-binding protein (AP2) in cells grown on both Ti surfaces, with more prominet effect on machined one, without affecting lipid accumulation. In conclusion, our results showed that ERK1/2 signaling inhibition favored osteoblast differentiation of MSCs grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography. In addition, ERK1/2 signaling inhibition favored adipocyte differentiation of MSCs grown on both Ti surfaces, being more noticeable on machined one. Considering therapeutical applications, these results are relevant to drive the development of biomaterial surfaces to act on signaling pathways that regulate the process of osteogenesis.

A caracterização fenotípica e o isolamento de células-tronco hematopoiéticas (CTH) podem fornecer informações relevantes quanto ao desenvolvimento biológico do sistema hematopoiético. A habilidade em detectar e purificar essas células implica no desenvolvimento de condições para manutenção e expansão dessas células em culturas in vitro. Na medicina veterinária, a purificação de células-tronco hematopoiéticas caninas (CTHc) vem de encontro com interesses em estabelecer métodos para o desenvolvimento de terapias celulares, principalmente em doenças que levam à aplasia medular ou anemia aplástica nesta espécie animal. Neste cenário, a escassez de informação acerca da caracterização fenotípica bem como sobre a capacidade de proliferação e pluripotência celular de CTHc precisa ser superada. O presente projeto visou o isolamento, a caracterização e a expansão, por meio da análise imunofenotípica e de ensaios CFU de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas provenientes da fração estromal vascular (FEV) do tecido adiposo de cães. Os resultados demonstraram que o painel de imunofenotipagem CD45-/CD117+/CD34+constitui uma melhor estratégia de isolamento destas células em comparação ao painel CD45-/CD38-/low/CD34+. Além disso, a detecção da atividade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) também pode representar uma grande aliada no enriquecimento desta fração celular. Por meio das técnicas empregadas no presente projeto foi possível verificar que a freqüência de CTH é baixa em tecido adiposo canino. / Phenotypic characterization and isolation of hematopoietic stem cells (HSC) provide relevant information to allow us to elucidate the biological development of the hematopoietic system. The ability to detect and purify these cells involves the development of conditions for maintenance and expansion of these cells in in vitro cultures. In veterinary medicine, purification of canine hematopoietic stem cells (CTHc) is of interesting to provide methods for the development of cell-based therapies, particularly in diseases causing bone marrow aplasia or aplastic anemia in this species. In this scenario, the lack of information about the phenotypic characterization as well as on the ability of cell proliferation and pluripotency of CTHc needs to be overcome. The present study aimed at the isolation, characterization, and expansion, by means of immunophenotyping and CFU assays of stem cells/ progenitor hematopoietic from stromal vascular fraction (SVF) from adipose tissue of dogs. The results showed that immunophenotyping panel CD45-/CD117+/CD34+ is a better strategy for isolation of these cells compared to CD45-/CD38&#X2d/low/CD34+. Furthermore, the detection of the enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity may also represent a great enrichment coupled to this cell fraction. By the techniques employed in this project we found that the frequency of CTH is low in canine adipose tissue.

Estudos clínicos tem mostrado resultados satisfatórios na aplicação da matriz derivada de esmalte (MDE) nas superfícies radiculares. Porém, a completa regeneração de todos os tecidos periodontais perdidos permanece como um desafio. Na tentativa de alcançar esse objetivo o uso de células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (CTM-MO) em um veículo apropriado na engenharia tecidual vem sendo bastante estudada. Uma interessante aplicação da MDE seria como um mediador biológico específico para CTMMO no intuito de promover a diferenciação e proliferação celular e auxiliar nos processos de regeneração periodontal. Sendo assim, o objetivo do presente estudo é avaliar a influência do Emdogain (EMD) e seu veículo alginato de propileno glicol (APG) na proliferação, diferenciação e mineralização de CTM-MO CD 45-90+. Células estromais de medula óssea (CE-MO) foram coletadas da crista ilíaca de ratos Wistar-Kyoto, isoladas pelo método Ficoll e separadas em CTM-MO CD 45-90+ por citometria de fluxo. A caracterização dessas células como células tronco se deu por meio de análise da presença de marcadores de células tronco (gene REX-1 e antígeno de superfície CD 90), habilidade de formação de colônias e capacidade de expressar fenótipo osteogênico e adipogênico. Após a caracterização, as CTM-MO CD 45-90+ foram plaqueadas com um dos seguintes tratamentos: Grupo Controle Positivo - meio contendo 10% de soro fetal bovino (SFB); Grupo Controle Negativo - meio contendo 2% de SFB; Grupo APG meio contendo 2% de SFB associado a 25 μg/ml de APG; Grupo EMD meio contendo 2% de SFB associado a 25 μg/ml de EMD. A avaliação da proliferação celular foi realizada por ensaio de MTT em 3, 7, 10 e 14 dias. Após diferenciação osteoblástica, a atividade de fosfatase alcalina (ALP) e a avaliação da capacidade de diferenciação celular feita por análise genética (PCR) dos genes osterix (OSX), osteopontina (OPN), ALP e RUNX2 foram mensuradas em 7, 10 e 14 dias. A mineralização de matriz extracelular foi avaliada qualitativamente por meio de ensaios de Von Kossa e Alizarina Red e quantitativamente pela mensuração do teor de cálcio. CTM-MO CD 45-90+ apresentaram maior expressão de REX-1, maior quantidade de antígeno de superfície CD 90, e mais unidades formadoras de colônia do que CE-MO. Além disso, foram capazes de expressar fenótipos osteoblástico e adipogênico. EMD e APG não influenciaram a proliferação de CTM-MO CD 45-90+. A atividade de ALP não foi influenciada pelo EMD e foi reduzida no grupo APG. Ambos EMD e APG não influenciaram a expressão dos genes OSX e RUNX2 em 7 e 10 dias e reduziram em 14 dias. O EMD não influenciou a expressão gênica de ALP e OPN, mas a presença do gel de alginato de propileno glicol pareceu prover melhores resultados, com maiores expressões de OPN e ALP. Os grupo EMD e APG apresentaram menor mineralização de matriz extracelular em 28 dias comparados aos grupos controles. Conclui-se que o EMD não influenciou a proliferação, atividade de ALP e diferenciação de CTM-MO CD 45-90+, mas a presença do gel (APG) parece otimizar a diferenciação dessas células. Ambos, APG e EMD reduziram a mineralização de matriz extracelular. / Clinical studies have shown satisfactory results in the application of the enamel matrix derivate (EMD) on root surfaces. However, the complete regeneration of all lost periodontal tissues remains a challenge. To achieve this aim the use of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) in an appropriate vehicle in tissue engineering has been extensively studied. An interesting application of the EMD would be like a specific biological agent for BM-MSCs in order to promote cell differentiation and proliferation and assist in periodontal regeneration processes. Therefore, the aim of this study is evaluate the influence of Emdogain (EMD) and its vehicle (Propylene Glycol Alginate - PGA) in proliferation, differentiation and mineralization of CD 45-90+ bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs). Rat bone marrow stromal cells (BMSCs) were colleted from iliac crest of rat Wistar-Kyoto, isolated by Ficoll method and separated into CD 45-90+ BM-MSCs by flow cytometer. For cellular characterization the presence of stem cells markers (Rex-1 gen and surface antigen CD 90), capacity to form colonies (CFU) and to express osteoblast and adipogenic phenotype was assessed. Four experimental groups was plated with CD 45-90+ BM-MSCs: Positive Control group: media containing 10% of fetal bovine serum (FBS); (2) Negative Control Group: media containing 2% FBS; (3) EMD Group: 25 μg/ml EMD in 2% FBS media; (4) PGA Group: 25 μg/ml PGA in 2% FBS media. Cellular proliferation was assed in 3, 7, 10 and 14 days with MTT assay. After osteogenic induction, alkaline phosphatase (ALP) activity and gene expression of osterix (OSX), osteopontin (OPN), ALP and RUNX2 by RT-PCR was assessed at 7, 10 and 14 days. Extracellular matrix mineralization was evaluated at 21 and 28 days qualitatively by Von-kossa and Alizarina Red staining, and quantitatively by calcium content. CD 45-90+ BM-MSCs presented higher Rex-1 gen expression, more surface antigen CD 90 and more CFU/well than BMSCs, and expressed osteoblast and adipogenic phenotype. EMD and PGA not influenced proliferation of CD45-90+ BM13 MSCs. ALP activity was not influenced by EMD and was reduced in PGA group. EMD and PGA not influenced expression of OSX and RUNX2 in 7 and 10 days and reduced in 14 days. EMD not influenced ALP and OPN expression, but the presence of the gel provided better results, with higher expressions of ALP and OPN genes. Both PGA and EMD groups presented less mineralized ECM in 28 days. It concludes that EMD not influenced the proliferation, differentiation and ALP activity of CD 45-90+ BM-MSCs, but the presence of the gel (PGA) seems optimize the differentiation of these cells. Both reduced ECM mineralization.

Neste trabalho verificou-se o potencial terapêutico de células tronco murinas mesenquimais e embrionárias no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne. A sua capacidade de regenerar o músculo distrófico foi averiguada in vitro e in vivo, no modelo murino mdx. Em cultura, constatou-se que as células tronco mesenquimais de medula óssea (MSC) têm a capacidade de fusão e diferenciação espontânea em fibras musculares, independentemente de estímulo de outros tipos celulares ou de indução in vitro à miogênese. Quando injetadas no músculo afetado, células MSC expressando a proteína GFP só foram detectadas, no máximo, após 3 dias, sugerindo a sua eliminação após este período. Quando injetadas via sistêmica, as células MSC eGFP não foram direcionadas corretamente para o músculo distrófico. Estas células também foram eliminadas em camundongos selvagens da linhagem FVB, sugerindo que a proteína GFP poderia ser a responsável pela sua rejeição. As células tronco embrionárias (ES-linhagem 129) também demonstraram capacidade miogênica in vitro. Quando injetadas no músculo de camundongos mdx imunossuprimidos, provocaram reação inflamatória muito intensa e grande aumento local da massa muscular. Essa nova estrutura, no entanto, não continha células com características de fibras musculares. Nos camundongos injetados sistemicamente, as células ES permaneceram na região de sua introdução na cauda, demonstrando pouca distribuição e disseminação para o músculo lesado. A análise de marcadores polimórficos específicos da linhagem das células ES permitiu a identificação das mesmas na concentração mínima de 30%. Este resultado indica que a hipertrofia observada no músculo do camundongo injetado foi causada, pelo menos, por esta quantidade de células. Estudos adicionais são necessários para aumentar o potencial terapêutico destas células em modelos distróficos murinos. / We investigated therapeutic potential of murine mesenchymal and embryonic stem cells in the treatment of Duchenne Muscular Dystrophy. Their ability to regenerate the dystrophic muscle was studied in vitro and in vivo, in the murine mdx model. In culture, bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) showed the capacity to fuse and to spontaneously differentiate into muscle fibers, independently of stimulation by contact with other cell types or exposure to miogenic factors in vitro. When injected into affected muscles, MSC expressing GFP protein were detected after 3 days at most, suggesting their elimination after this period. When injected in the systemic via, MSC eGFP were not properly directed to the dystrophic muscle. These cells were also eliminated in the wild strain FVB mice, suggesting that GFP protein could be responsible for this rejection. The embryonic stem cells (ES-line 129) also showed a good miogenic capacity in vitro. When injected into the muscle of immunosuppressed mdx mice, they caused very intense inflammatory reaction and a significant increase of its leg muscle mass. However, this new tissue did not contain cells with muscle fibers characteristics. In systemically injected mice, the ES cells remained in the region of introduction in the tail, showing poor distribution and dissemination into the injured muscle. Specific ES cell line polymorphic markers analysis identified a concentration of at least 30%. This result indicates that muscle hypertrophy observed in injected mice was caused by at least this amount of cells. Additional studies are necessary to increase the therapeutic potential of these cells in dystrophic murine models.

Nos últimos anos, as células-tronco, devido a sua capacidade de originar diversos tecidos corporais e pelo poder de auto-renovação, impulsionaram os estudos de engenharia tecidual, sobretudo em medicina regenerativa. Nesse aspecto, o tecido adiposo vem se mostrando como fonte ideal para obtenção de tais células, devido à facilidade de captação, à baixa morbidade associada ao procedimento e ao elevado rendimento celular. Com o objetivo de estabelecer um modelo experimental versátil e que satisfizesse várias áreas de interesse, propôs-se o coelho Oryctolagus cuniculus como fonte de tecido adiposo. Esse animal apresenta bolsa adiposa interescapular com peso médio de 17,2g, o que corresponde a cerca de 6,6 g/Kg em machos adultos (peso corporal médio de 2590g). A coleta do material foi por meio de lipoaspiração a seco, com cânula de 3,5mm; levou-se em média, 11 minutos para o procedimento, obtendo-se aproximadamente 10 ml de gordura. Após o processamento pela técnica enzimática, em cada mililitro de gordura encontrou-se em média 1x105 células-tronco. O estudo constatou ainda que, por meio da criopreservação em nitrogênio líquido, as células mantinham suas características citométricas após períodos de congelamento que variaram de uma semana a 13 meses. As células apresentaram características de sua indiferenciação, como a expressão dos marcadores de superfície: CD90, 80,6%; HLA-DR, 2,8% e caspase 3, 10,5%. A análise do ciclo celular com 100% de confluência mostrou que 70,8% das células encontravamse quiescentes; 22,1% apoptóticas. As células com alta capacidade replicativa, que corresponde à fase S do ciclo celular, 1,4% e 0,9% encontravam-se em replicação, mostrando que as células-tronco do tecido adiposo, em cultura, não apresentam uma proliferação descontrolada, tendendo a se estabilizar, principalmente quando atingem confluência máxima em monocamada. Todas essas vantagens fazem com que o modelo proposto possa ser facilmente reprodutível, contribuindo para o estudo das células-tronco do tecido adiposo. / In the latest years, the study on tissue engineering, mainly in the area of regenerative medicine, has advanced because the medical community is highly interested in stem cells. This is due to both the potential of these cells to originate any body tissue and their power of self-renewal. Adipose tissue has been used as an ideal source of such cells, due to the simplicity of their collection, high cellular yield, and low morbidity associated with the procedure. In order to establish a versatile experimental model, which could meet the needs of researchers from various areas, the rabbit Oryctolagus cuniculus was proposed as a source of adipose tissue. This animal has an adipose pad in the interscapular region with an average weight of 17.2g, which corresponds to about 6.6g of fat material per kilogram of an adult male animal (mean body weight = 2.6kg). The material was collected by means of a liposuction procedure. Using a 3.5- mm diameter tube, a volume of nearly 10ml of fat material was obtained in a mean time of 11min. After processing the fat tissue by enzymatic technique, about 1x105 stem cells were found per milliliter of fat material. Using cryopreservation of the cells by freezing them in liquid nitrogen, it was observed that the cytometric characteristics were maintained after a period of time ranging from 1 week to 13 months. The cells presented evident characteristics of undifferentiation, such as expression of the surface markers CD90, HLA-DR, and Caspase-3 (80.6, 2.8, and 10.5 %, respectively). Analysis of the cellular cycle with 100% confluence allowed us to show that 70.8% of the cells were quiescent, 22.1% were apoptotic, 1.4% had high replication capacity (phase S of the cellular cycle) and 0.9% were already in replication (phase G2/M), indicating that stem cells from adipose tissue did not show uncontrolled proliferation, tending to stabilize, mainly when they reach maximal confluence in monolayer. These advantages make this model easily reproducible, facilitating the study of adipose tissue stem cells.

Diversos biomateriais podem ser aplicados na engenharia de tecidos, mas poucos são utilizados em contato direto com células-tronco na forma de suportes de micropartículas, devido à falta de adesão, espalhamento e toxicidade do material, de forma que os tornam inviáveis junto ao cultivo celular. Um biomaterial promissor para bioengenharia é a fibroína, proteína fibrosa presente no casulo do bicho da seda (Bombyx mori), devido à sua resistência mecânica, biocompatibilidade e mínima reação inflamatória, porém, suas caracteristicas são pouco conhecidas na literatura. O mesmo não ocorre com o colágeno que já é bastante estudado por pesquisadores e, assim como a fibroína, apresenta propriedades naturais que incluem baixa resposta imunológica, baixa toxicidade e habilidade de promover o crescimento celular, porém o uso do colágeno em sua maior parte é em forma de filmes, esponjas e membranas. Como existem poucos métodos relacionados para preparação e caracterização de micropartículas em formatos esféricos e porosos, este trabalho teve por objetivo desenvolver e caracterizar micropartículas à base de colágeno ou fibroína, tratadas ou não com glutaraldeído (GA), para ser utilizado como suporte para células-tronco mesenquimais e avaliar a citotoxicidade destes materiais em cultura celular.Nos resultados de Calorimetria Exploratória Diferencial para ambos os materiais, colágeno e fibroína quando submetidas a tratamento com GA, a temperatura de desnaturação e degradação aumenta, respectivamente. Na microscopia ótica, eletrônica de varredura e birrefringência, observa-se o aparecimento de rugosidade e poros e/ou bolhas de ar no interior das micropartículas em maior quantidade quando tratadas com GA, o que pode ser um fator positivo para aderência celular no suporte. A porcentagem de água absorvida é maior no colágeno devido às estruturas hidrofóbicas em maior quantidade na fibroína, porém, quando tratadas com GA, a absorção é estabilizada em um curto tempo em ambos os materiais. Os picos nos espectros de FTIR mostram as bandas amidas I, II e III dos materiais e as alterações sofridas quando em contato com GA e os testes de citotoxicidade que ambos materiais tratados ou não, são atóxicos, mas o desenvolvimento celular nas micropartículas de fibroína é mais lento e diminui quando tratados com GA, por possuir mais estruturas ordenadas na forma de -folha quando se necessita de um crescimento mais controlado das células nas micropartículas. / There are several biomaterials can that be used in tissue engineering, but few are used in direct contact with stem cells like scaffold in the microparticle form, because of the lack of adhesion, spreading and toxicity of the biomaterial, in order to make them nonviable in the cell culture. A promising biomaterial for bioengineering is fibroin, a fibrous protein present in the fibers of silkworm (Bombyx mori) cocoon, because of its mechanical strength, biocompatibility and minimal inflammatory reaction; however, little is still described in the literature. Not so with the collagen that is already well studied by researchers and as the fibroin, has natural properties that include low immune response, low toxicity and ability to promote cell growth, but the use of collagen is mostly in form of films, sponges and membranes. As there are few methods reported for preparation and characterization of microparticles in spherical shapes and porous, this study aimed to develop and characterize microparticles based on collagen or fibroin, treated or not with glutaraldehyde (GA), to be used as a support for cells mesenchymal stem cells and evaluating the cytotoxicity of these materials in cell culture.In the results of Differential Scanning Calorimetry (DSC) curves for both materials, collagen and fibroin when subjected to treatment with GA, the denaturation and degradation temperatures increases, respectively. In Optical Microscopy, MSCanning electronic Microscopy and Birefringence results, it is observed the onset of surface roughness and porosity and or air pockets within the microparticles in greater quantity when treated with GA, which may be a positive factor for cell attachment on the support. The percentage of water absorbed is greater in the collagen structures due to more hydrophobic structure than silk fibroin, but when in treated with GA, absorption is stabilized in a shorter time in both materials. The peaks in FTIR spectra show bands amide I, II and III of the materials and the changes suffered when in contact with GA and cytotoxicity tests are non-toxic to both biomaterials treated or not, however, in the growth of cells, the fibroin microparticles is slower and decreases when treated with GA, due to its more ordered structure in the form of -sheet and more spherical than collagen due to its more ordered -sheet structures, which may be very interesting when it needs a more controlled growth of cells on microspheres.

Revascularização é uma técnica utilizada em dentes jovens, que apresentem rizogênese incompleta e danos irreversíveis ao tecido pulpar, necessitando de tratamento endodôntico, para formar novo tecido em lugar da polpa perdida. Clinicamente os resultados mostram a continuidade da rizogênese e a devolução da vitalidade dental. Porém, pouco se sabe sobre o novo tecido formado e não está estabelecido se este é capaz de desempenhar todas as funções da polpa dentária. Para melhorar as características do tecido formado pela técnica da revascularização, podemos utilizar ferramentas de engenharia tecidual, como célulastronco, fatores de crescimento e arcabouços de sustentação celular (scaffolds). As célulastronco (CTs) já estão presentes quando o sangue invade o canal radicular, e utilizar essa reserva de CTs que o hospedeiro possui, procedimento conhecido como homing, é uma vantagem em comparação com outras técnicas que injetam CTs obtidas por cultivo em laboratório. Entretanto os aspectos físicos do coágulo sanguíneo formado no interior do canal radicular podem ser melhorados com a adição de hidrogel de quitosana, que interage quimicamente com o sangue e forma um scaffold híbrido mais estável. Então, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que o scaffold híbrido, composto por hidrogel de quitosana e sangue, ofereceria maior estabilidade física estrutural, bem como condições favoráveis à adesão e proliferação de células-tronco da papila apical humana (SCAPs; do inglês, Stem Cell from Apical Papila). Para isso, investigamos in vitro se a incorporação do sangue ao hidrogel de quitosana gera um scaffold mais estável, se este é favorável à adesão e proliferação de células-tronco da papila apical e se a fotobiomodulação potencializa essas características celulares. Para isso, SCAPs foram isoladas e caracterizadas por citometria de fluxo, tempo de dobra populacional, e contagem de unidades formadoras de colônias fibroblásticas (CFU-F; do inglês, Colony Forming Units - Fibroblastic). Ensaios de incorporação sanguínea, dissolução e embebição foram realizados para determinar o comportamento dos scaffolds híbridos. A adesão celular foi observada pela coloração PHK26® (do inglês, Red Fluorescent Cell Linker) e por microscopias eletrônicas de varredura (MEV); e a proliferação foi investigada pelo ensaio de alamarBlue®. Adicionalmente, a sobrevivência das SCAPs após a degradação do scaffold híbrido foi avaliada pela coloração Live/Dead®. A população celular estudada apresentou características de células tronco. O scaffold híbrido, constituído de densa rede alveolar com poros interconectados, embebeu e dissolveu rapidamente. De acordo com o PKH26® e alamarBlue® SCAPs aderiram e proliferaram no scaffold híbrido. SCAPs fotobiomoduladas exibiram maior taxa de proliferação e o ensaio Live/Dead® mostrou células vivas após 12 dias de cultivo. Concluiu-se que o scaffold híbrido apresenta biocompatibilidade e condições favoráveis de sobrevivência para SCAPs, que são potencializadas pela fotobiomodulação. / Revascularization is a technique used to form a new tissue, replacing the lost pulp, in young permanent teeth presenting incomplete rhizogenesis and irreversible damage, where endodontic treatment is needed. Clinically, the results show the continuity of the root formation and the return of dental vitality. However, little is known about the newly formed tissue and it has not been established if it is able to perform all functions of the dental pulp. To improve the characteristics of the newly formed tissue by the technique of revascularization, tissue engineering tools can be used, represented by stem cells, growth factors and scaffolds for cell supportting. Stem cells (SCs) are already present when the blood invades the root canal, and to use this SCs reserve that the host possesses, procedure known as homing, is an advantage compared with other techniques that inject SCs obtained by cultivation in the laboratory. However the physical aspects of blood clot in the root canal can be improved with the addition of chitosan hydrogel that chemically interacts with the blood and forms a more stable hybrid scaffold. So the aim of this study was to test the hypothesis that the hybrid scaffold, composed of hydrogel chitosan and blood clot, provides greater structural physical stability as well as favorable conditions for adhesion and proliferation of Stem Cells from Apical Papilla (SCAPs). For this, we investigated in vitro if the incorporation of blood to chitosan hydrogel, generates a more stable scaffold and if it supports the stem cell adhesion and proliferation, in addition, if photobiomodulation potentiates these cell characteristics. For this, SCAPs were isolated and characterized by flow cytometry, population doubling time, and counting colony forming units - fibroblastic (CFUF). Blood incorporation assays, dissolution and swelling were conducted to determine the behavior of hybrid scaffolds. Cell adhesion was observed by PHK26® (Red Fluorescent Cell Linker) and scanning electron microscopy (SEM); and proliferation was investigated by alamarBlue® assay. In addition, the survival of SCAPs after degradation of the scaffold was assessed by Live/Dead® staining. The cell population showed stem cell characteristics. The hybrid scaffold, constituted of dense cellular network with interconnected pores, soaked and dissolved quickly. According to PKH26® and alamarBlue® assays, the SCAPs adhered and proliferated in the hybrid scaffold. Photobiomodulation leads to SCAPs higher proliferation rate and the Live/Dead® test showed live cells after 12 days of cultivation. It was concluded that the hybrid scaffold is biocompatible and favors survival of SCAPs, which was enhanced by photobiomodulation.

A busca por um material de enxertia que se adapte às necessidades do cirurgião bucomaxilofacial e também que proporcione ao paciente retorno de sua função com menores danos possíveis, tem sido incessante. O enxerto autógeno é ainda hoje considerado padrão ouro devido suas propriedades, porém, ele apresenta algumas desvantagens, sendo que as maiorias de suas complicações estão associadas ao leito doador. Atualmente, a engenharia de biomateriais trabalha com o desenvolvimento de novos materiais e recursos principalmente na área de regeneração tecidual. Neste contexto, scaffolds de origem natural ou sintética com o propósito de promover a regeneração de tecidos tem sido amplamente estudados. O objetivo desse estudo foi avaliar in vitro o comportamento biológico quanto à viabilidade, proliferação celular, adesão e potencial de diferenciação de células tronco de polpa dentária humana cultivadas sobre amostras de scaffold composto por uma nova blenda de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano). Células tronco de polpa dentária de molares humanos (hDPSCs) foram cultivadas a partir de amostras congeladas e re-caracterizadas. As células foram semeadas sobre amostras dos scaffolds e sob lamínulas de vidro e cultivadas em diferentes meios: clonogênico, mineralizante e condicionado pelo extrato do biomaterial por 1,3,7,14 e 21 dias. Foram avaliadas as curvas de crescimento e viabilidade celulares, a atividade de fosfatase alcalina, a formação de nódulos de mineralização. A adesão celular foi observada por microscopia eletrônica de varredura até o cultivo de 7 dias. Os scaffolds eram lisos, flexíveis e mostraram-se anfifílicos com características físicas de fibras dispostas aleatoriamente e poros interconectados com diâmetro médio de 13,5?m e abertura com área média de 87,14µm2. As hDPSCs expressaram níveis típicos de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais. Não houve inibição de crescimento celular na interface com o biomaterial. As curvas de crescimento e viabilidade mostraram-se mais significativas (p<0.01), especialmente em 7 dias, para as culturas sobre os scaffolds em meio clonogênico. Resultados semelhantes foram observados com o meio mineralizante (p<0.05). Houve maior formação de nódulos de mineralização nas culturas com a presença dos scaffolds, ou seja, o biomaterial estimulou a diferenciação celular. Em microscopia eletrônica de varredura as células mostraram-se aderidas até o período de 7 dias com formação de lençóis sobre os scaffolds. A blenda de poli £-caprolactona/poli (rotaxano) apresentou biocompatibilidade in vitro, revelando aspectos promissores de serem funcionalizadas por células tronco derivadas de polpa dentária humana com potencial de uso como biomaterial bioativo para bioengenharia de tecido ósseo. / The search for a graft material that provides patient with rehabilitation with little damage and also suits maxillofacial surgeon needs has been incessant. Autogenous bone is still considered the gold standard for grafting because of its properties, although it has some disadvantages and the majority of its complications are associated with the donor site. Currently, bioengineering develops new materials and resources primarily for tissue regeneration area. In this context, scaffolds of natural or synthetic origin with the purpose of promoting tissue regeneration have been widely studied. The aim of this study was to evaluate in vitro biological behavior as viability, cell proliferation, adhesion and potential of stem cell differentiation of human dental pulp grown on scaffold samples composed of a new blend of poly £-caprolactone/poly(rotaxano). Dental pulp stem cells obtained from human molars (hDPSCs) were grown from frozen samples and re-characterized. Cells were seeded onto scaffolds samples or glass coverslips and cultured in different media: clonogenic, mineralizing and conditioned by the biomaterial extract per 1,3,7,14 and 21 days. Cells growth curves and viability, alkaline phosphatase activity, formation of mineralized nodules were assessed. Cell adhesion was observed by scanning electron microscopy up to 7 days cultures. Scaffolds were flat, flexible and proved to be amphiphilic with physical characteristics of randomly arranged fibers and pores interconnected with an average diameter of 13,5?m and aperture average area of 87,14µm2. The hDPSCs expressed typical levels of mesenchymal stem cell surface markers. There was no inhibition of cell growth at the biomaterial interface. The growth rates and viability were more significant (p <0.01), especially in 7 days, to cultures over scaffolds in clonogenic medium. Similar results were observed with the mineralizing medium (p <0.05). There formation of mineralized nodules was increased in the cultures in the presence of scaffolds, in other words, the biomaterial stimulated cell differentiation. In scanning electron microscopy the cells were shown to be attached until 7-day period with formation of sheets over the scaffolds. The blend of poly ?-caprolactone/poly(rotaxano) shows biocompatibility in vitro, revealing promising aspects to be functionalized by stem cells derived from human dental pulp with potential to be used as bioactive biomaterials for bone tissue bioengineering.