Orientador: Noeme Souza Rocha / Orientador: Maria de Fátima Gartner / Coorientador: Rafael Malagoli Rocha / Coorientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Marcela Marcondes Pinto Rodrigues / Banca: Paulo Ricardo de Oliveira Bersano / Banca: Enio Ferreira / Banca: Gabriel D. Carvalho / Resumo: Os tumores mamários constituem a neoplasia mais comum das cadelas, sendo que mais da metade são consideradas malignas e com muitos animais apresentando morte associada à doença. Estes tumores geralmente são tratados cirurgicamente por meio de mastectomia, porém os resultados frequentemente não são satisfatórios. Visto que novas abordagens terapêuticas são necessárias nos tumores mamários caninos, especialmente no que diz respeito ao tratamento adjuvante e à terapia alvo, o conhecimento acerca de possíveis componentes relacionados com a resistência à fármacos e que funcionem como possíveis alvos moleculares para a terapia deve ser garantido. Em vista disso, o objetivo da pesquisa descrita nesta tese foi caracterizar o papel da família de receptores do fator de crescimento epidermal (EGFR) e da superfamília de transportadores ligadores de ATP (ABC) nos tumores mamários caninos como biomarcadores do câncer e sua relação com o desfecho da doença para caracterizar sua patobiologia. Neste estudo, os receptores tirosina cinase EGFR/HER1, HER2, HER3 e HER4, assim como as proteínas da família ABC glicoproteína-P/MDR1, MRP1 e MRP2 foram avaliadas por meio de imunoistoquímica, sendo os resultados relacionados com características clinicopatológicas em 43 tumores. A expressão simultânea de todos os membros da família e a coexpressão de EGFR/HER1, HER2 e HER4 se mostraram associadas com um desfecho desfavorável para a doença. A expressão de glicoproteína-P e MRP1 se apresentaram relacionadas com características clinicopatológicas nos tumores estudados, ao passo que a expressão de MRP1 foi caracterizada como um indicador prognóstico independente nestes tumores. Em síntese, esta tese fornece novas informações acerca da expressão da família EGFR nos tumores mamários caninos e associa os transportadores ABC com um desfecho desfavorável para a doença, consequentemente sugerindo que eles também podem estar... / Abstract: Mammary tumors comprise the most common neoplasms in female dogs with more than half with malignat characteristics. Such tumors are usually treated using surgical mastecty, but results are frequently not satisfying. Since new therapeutical approaches are needed in canine mammary tumors, especially regarding adjuvant therapy and targeted therapy, an understanding regarding possible cellular components related to drug resistance and that work as possible targets for therapy is straightforward to achieve. Accordingly, the aim of the research described in this thesis was to study the possible role of epidermal growth factor receptor family (EGFR) and ATP-binding cassete (ABC) superfamily members in canine mammary tumors as cancer biomarkers and its relation with disease outcome in order to better characterize their pathobiology looking forward the future improve in canine mammary cancer treatment. In this study, tyrosine kinase receptors EGFR/HER1, HER2, HER3, and HER4, as well ABC transporters P-glycoprotein/MDR1, MRP1, and MRP2 were immunohistochemically evaluated and results were related with clinicopathologic characteristics and overall survival in 43 tumors. Expression of all family members and simultaneous expression of EGFR/HER1, HER2, and HER4 were related with a poor disease outcome. P-glycoprotein and MRP1 expression showed to be related with clinicopathologic features and MRP1 was characterized as a independent prognostic indicator in such tumors. In summary, this thesis provides new information about EGFR family expression in canine mammary tumors and associates ABC transporters with a poor disease outcome, consequently suggesting that they may also be related to prognosis in patients with mammary cancer / Doutor

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AnaCarolinaSantosde_D.pdf: 3901394 bytes, checksum: ef9ac69de23f7f2b15590ee29a931c8f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Produtos naturais têm originado muitos dos compostos biologicamente ativos usados clinicamente, destacando-se como importantes fontes de novos agentes terapêuticos utilizados no tratamento das mais variadas patologias incluindo câncer, HIV/AIDS, Alzheimer e malária. O desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos naturais, especialmente os derivados de plantas, tem desempenhado importante papel na prevenção e tratamento do câncer sendo que, de todos os antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, aproximadamente 40% eram caracterizados como produtos naturais ou derivados destes, com outros 8% sendo considerados agentes mimetizantes de produtos naturais. No presente trabalho, fisetin (flavonóide de origem vegetal) e a vitamina riboflavina foram avaliados como potenciais agentes antitumorais. Para este propósito, as linhagens de células leucêmicas HL60 e de câncer prostático PC3 foram tratadas com riboflavina irradiada ou fisetin por 24 horas e seus efeitos sobre vias de transdução de sinais responsáveis pela sobrevivência e morte celular foram avaliados. Os resultados obtidos demonstram que riboflavina e fisetin apresentam expressiva atividade antiproliferativa, induzindo a morte das células tumorais em concentrações na ordem de µM. A investigação do mecanismo molecular da ação citotóxica da riboflavina demonstrou que o tratamento de HL60 e PC3 com a vitamina irradiada induz morte celular através da via extrínseca de indução de apoptose, mediada pela ativação do sistema Fas/FasL e aumento na síntese de ceramida. Como conseqüência da ativação do receptor de morte Fas, uma seqüência ordenada de eventos leva à modulação de cascatas de sinalização através da alteração da atividade/expressão de moléculas-chave associadas a proliferação, sobrevivência, migração e morte celular. Assim como a riboflavina, fisetin também mostra-se eficiente indutor de morte por apoptose em células HL60, modulando cascatas de proteínas quinases e fosfatases e levando a alterações na expressão de NF?B, atividade de MAPKs, níveis de fosfoproteínas e, também, à inibição de enzimas envolvidas na manutenção do estado redox. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um maior conhecimento sobre a atividade/função biológica de algumas moléculas envolvidas na sobrevivência e morte de células leucêmicas e prostáticas, sugerindo potenciais alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no combate a doenças neoplásicas. Além disso, os resultados obtidos demonstram que a riboflavina irradiada e fisetin são potentes indutores de apoptose e promissores agentes antitumorais, capazes de modular importantes vias de sinalização intracelular através de ação específica sobre moléculas-chaves relacionadas a proliferação, resistência e invasividade de células tumorais / Abstract: Natural products have been providing numerous clinically used medicines and remain as essential components in the search for new drugs against various pharmacological targets including cancer, HIV/AIDS, Alzheimer¿s, malaria, and pain. Drug discovery from natural products, especially from medicinal plants, has played an important role in the chemoprevention and treatment of cancer and, off all available anticancer drugs between 1940 and 2002, about 40% were natural products per se or natural product-derived, with another 8% considered natural product mimics. In the present work, the plant flavonoid fisetin and the vitamin riboflavin are evaluated as potential anticancer agents. For this purpose, the leukemic cell line HL60 and the human prostate cancer cell PC3 were treated for 24h with irradiated riboflavin or fisetin and their effects on signal transduction pathways related to the cell survival and proliferation were evaluated. The results obtained demonstrated that riboflavin and fisetin have strong anti-proliferative activity, inducing tumoral cell death at µM concentrations. The investigation of the molecular death mechanism triggered by riboflavin demonstrated that the treatment of HL60 and PC3 with the irradiated vitamin induces apoptotic cell death through induction of the extrinsic pathway mediated by the activation of Fas/FasL system via a ceramide-dependent pathway. As a consequence of the activation of the death receptor Fas, an orderly sequence of signaling events leads to the modulation of signaling cascades through alterations in the activity/expression of key targets molecules related to proliferation, survival, migration and cell death. As well as riboflavin, fisetin also showed strong apoptotic activity, inducing HL60 cell death through modulation of protein kinase and phosphatase signaling cascades, leading to alterations in the NF?B expression, MAPKs activities, phosphoprotein levels and also inhibition of enzymes involved in the redox status maintenance. The results obtained in this work bring out information about the biologic activity of some molecules involved in the survival and death of leukemic and prostate cancer cells, indicating among then potential targets for the development of rational therapeutic strategies. Moreover, the data obtained demonstrated that irradiated riboflavin and fisetin have potential proapoptotic activity, pointing out these bioactive compounds as promising antitumoral agents, since they can affect important molecular targets related to proliferation, resistance and invasibility of cancer cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer ovárico epitelial (COE) representa el 90% de los cánceres de ovario. Esta enfermedad presenta un transcurso silencioso y por lo tanto una detección tardía; es altamente angiogénico y tiene una pobre respuesta a la terapia con una baja sobrevida. Existen varias hipótesis sobre la etiología del COE, una de ellas postula que los andrógenos estimulan la proliferación de células epiteliales del ovario dentro de los quiste de inclusión y también del epitelio transformado. Con el fin de dilucidar el mecanismo molecular por el cual los andrógenos contribuyen al desarrollo del carcinoma ovárico, se realizaron estudios relacionando los andrógenos con vías de señalización de moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), el cual es un inhibidor de la proliferación celular. Además, existen reportes sobre el efecto de los andrógenos sobre factores pro-angiogénicos como NGF y VEGF. Estos antecedentes, sugieren que los andrógenos podrían estar participando de la génesis del cáncer y podrían ser responsables de cambios importantes en los niveles de expresión de moléculas como TGF-β1, NGF y VEGF. Por este motivo, se planteó la siguiente hipótesis; el andrógeno dihidrotestosterona (DHT) inhibe el efecto antiproliferativo de TGF-β1 e induce la expresión de factores angiogénicos, favoreciendo la proliferación celular y la angiogénesis en células de cáncer ovárico epitelial. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de DHT en la vía de señalización de TGF-β1 y en la expresión de factores angiogénicos en células de cáncer de ovárico epitelial. Para abordar este objetivo, la metodología fue diseñada en dos partes: 1.- experimentos ex-vivo, para lo cual se trabajó con muestras de ovario normal inactivo (OI) y cáncer ovárico epitelial pobremente diferenciado (COE) en donde se evaluó por IHQ los niveles de AR y de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 por IHQ y W-B. 2.- experimentos in-vitro con dos líneas celulares, HOSE (células epiteliales de la superficie ovárica) y A2780 (células de cáncer ovárico epitelial), las cuales fueron estimuladas con 0, 10 y 100 nM de DHT, por 48 y 72 h para evaluar las mismas proteínas que se evaluaron en tejidos por las técnicas de ICQ y W-B. Además, se realizaron experimentos con siRNA del receptor de andrógenospara confirmar la acción de los andrógenos en cáncer ovárico epitelial. Adicionalmente, se evaluó el ciclo celular por citometría de flujo, así como también, se evaluó los niveles de p21 por WB Resultados de nuestro trabajo, indicarían un aumento de los niveles del AR y una disminución de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 en COE versus OI. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las líneas celulares, donde también encontramos un aumento de los AR y una disminución de estas proteínas (TGFBR1 y TGFBR2) en la línea celular de cáncer ovárico epitelial A2780 versus la línea celular de epitelio normal de la superficie ovárica HOSE. Por otra parte, cuando estimulamos las células A2780 con DHT, observamos que los niveles de mRNA de TGF-β1 no fueron modificados por este andrógeno, sin embargo, los niveles de los receptores I y II de TGF-β1 disminuyeron significativamente (*p<0,05) a las 72 h con 100 nM de DHT. Estos resultados sugieren que el AR y TGF-β1 podrían participar en la regulación de la homeostasis tisular en el COE. Además, la disminución en los niveles de los receptores de TGF-β1 por efecto de DHT, sugiere que los andrógenos alterarían la vía de señalización de TGF-β1, lo que podría explicar el aumento en la proliferación celular de esta patología. El estudio del ciclo celular indicó que hay un aumento del porcentaje de células en fase S en las líneas celulares A2780, sin embargo, no se logró relacionar el efecto de DHT y TGF- β1 en la proliferación, probablemente por la cantidad de factores que están involucrados en este proceso. Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de p21 y se encontró que el tratamiento con DHT provocó una disminución en los niveles de p21, lo que podría relacionarse con una falla en la regulación del ciclo celular en células A2780, sin embargo, este efecto no se observó en las células HOSE. Finalmente, se analizó el efecto de DHT sobre los niveles de expresión de NGF y VEGF sin encontrar cambios en los niveles de mRNA y proteína de NGF en ninguna de las líneas celulares en estudio. Por otro lado cuando se analizó la secreción de VEGF, se observó una mayor secreción de este factor en células A2780 tratadas con DHT en comparación con las células HOSE en las mismas condiciones. En conclusión, los resultados obtenidos en tejido de COE y en la línea celular A2780 sugieren que la vía de señalización canónica de TGF-β estaría alterada en COE, donde los andrógenos podrían desempeñar un papel importante regulando negativamente la expresión de sus receptores (TGFBR1) lo que significaría que DHT al bloquear la vía de señalización canónica de TGF-β podría estar involucrado en la disminución de los niveles de p21. También es importante destacar que DHT tendría una participación importante en el proceso de angiogénesis, aumentando los niveles de VEGF, según lo encontrado en este trabajo. Estas fallas, entre otras, podrían contribuir a la progresión del cáncer de ovárico epitelial, siendo interesante dilucidar los mecanismos implicados en futuros estudios para contribuir con nuevas y efectivas terapias anti-carcinogénicas / Epithelial ovarian cancer (EOC) represents 90% of ovarian cancers. This disease has a silent course, a late detection. It is highly angiogenic and has a poor response to therapy, therefore a low survival. There are several hypotheses about the etiology of the EOC, one of them postulates that androgens stimulate the proliferation of epithelial cells within the ovary inclusion cyst and epithelium transformed. To elucidate the molecular mechanism by which androgens contribute to the development of ovarian cancer, studies were related the androgen with signaling pathway, such as transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is a cell proliferation inhibitor. In addition, there are reports on the effect of androgens on pro-angiogenic factors such as VEGF and NGF. These facts suggest that androgens could be involved in the genesis of cancer and could be responsible for significant changes in expression levels of molecules such as TGF-β1, NGF and VEGF. For these reasons, the following hypothesis is raised; the androgen dihydrotestosterone (DHT) inhibits the antiproliferative effect of TGF-β1 and induces the expression of angiogenic factors promoting cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian cancer cells. The objective of this study was to evaluate the participation of DHT in the signaling pathway of TGF-β1 and expression of angiogenic factors in cells of epithelial ovarian cancer. To address this goal, the methodology was designed in two parts: 1. ex-vivo experiments with samples of inactive normal ovary (IO) and poorly differentiated epithelial ovarian cancer (EOC) and 2. Experiments in vitro with two cell lines, HOSE (ovarian epithelial cell surface) and A2780 (epithelial ovarian cancer cells), which were stimulated with 0, 10 and 100 nM DHT for 48 and/or 72 h. To answer each of the objectives, conventional RTPCR, qPCR, blot, immunocytochemistry, immunohistochemistry and western were used. The results indicate an increase of AR levels and a decreased of TGF-β1 receptors I and II (TGFBR2 and TGFBR1) in EOC versus IO. These results are in agreement with those obtained in cell lines, where we also found an increase in AR and a decrease in TGF-β1 receptors (TGFBR1 and TGFBR2) in epithelial ovarian cancer cells A2780 versus HOSE cells. Moreover, when stimulate A2780 cells with DHT, the mRNA levels of TGF-β1 were not modified by this androgen, however, the levels of TGF-β1 receptors I and II decreased significantly (* p <0.05) at 72 h with 100 nM DHT. These results suggest that AR and TGF-β1 may be involved in regulating tissue homeostasis in the EOC. Furthermore, decreased levels of TGF-β1 receptors and the effect of DHT in TGF-β1 canonical sinaling pathway, suggests that androgen could increase cell proliferation in this pathology. The cell cycle studies indicated that there is an increase in the percentage of cells in S phase in the cell lines A2780, however, failed to relate the effect of DHT and TGF-β1 in proliferation, probably because the number of factors are involved in this process. Moreover, the protein levels of p21 were analyzed and was found that the DHT treatment caused a decrease in p21 levels, which could be related to a failure in cell cycle regulation in A2780 cells, this effect was not observed in the HOSE cells. Finally, the effect of DHT on NGF and VEGF expression levels was analyzed. No changes were observed in mRNA levels or of NGF protein levels in both cells lines studied. Furthermore when VEGF protein levels were analyzed, it was found that the secretion of this factor was greater in A2780 cells treated with DHT compared to HOSE cells under the same conditions. In conclusion, these results of tissue and cell line A2780 suggest that the TGF-β canonical signaling pathway would be altered in EOC where androgens may play a role downregulating expression of its receptors (TGFBR1) and this could potentially be involved in the reduction of p21 levels. Is also important highlight as found in this investigation, androgens have an important role in the angiogenesis process, increasing the levels of VEGF. These failures, among others, could contribute to the progression of epithelial ovarian cancer, it is interesting to elucidate the mechanisms involved in future studies to contribute with new and effective anti-carcinogenic therapies / Fondecyt; Fondap

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La neoplasia mamaria es una enfermedad que afecta comúnmente a hembras caninas. En el microambiente tumoral existe una subpoblación de células tumorales que exhiben características de troncalidad (CSC), que pueden formar esferas in vitro, resistir tratamientos antitumorales, explicando en parte la recurrencia de algunas neoplasias. Previamente, se ha descrito que esferas derivadas de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg exhiben características de troncalidad. Melatonina ha mostrado efectos antitumorales sobre células tumorales mamarias; sin embargo, sus efectos han sido pobremente evaluados en CSC mamarias caninas. Melatonina modula la expresión de proteínas relacionadas con transición epitelio-mesénquima en CSC mamarias, como E-cadherina y OCT-4. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de melatonina sobre la proliferación, migración e invasión de células CF41.Mg y esferas derivadas de ellas. Se cultivaron células CF41.Mg en DMEM alto en glucosa suplementado con suero fetal bovino y L-glutamina. Las esferas se cultivaron en placas de ultra-baja adherencia con DMEM/F12 en presencia de EGF, bFGF, insulina, B27 y heparina. La proliferación (reducción de MTS) y los ensayos de migración/invasión (transwell) celular se realizaron en presencia de melatonina (0,01, 0,1 o 1 mM). Melatonina indujo un efecto antiproliferativo a 1 mM (P<0.05), sin embargo, el efecto sobre las esferas fue mayor (P<0.0001). La migración/invasión celular fue inhibida en respuesta a concentraciones no citotóxicas de melatonina (P<0.05) en ambos tipos celulares. Estos resultados indican que melatonina juega un papel en la actividad proliferativa e invasiva de células CF41.Mg, siendo un potencial agente contra CSC mamarias. / Mammary cancer is a common disease affecting female dogs. In the tumor microenvironment there is a subpopulation of cancer cells with stem cell-like features (CSC), that can form in vitro spheres and resist conventional antitumor treatments explaining in part the recurrence of some cancers. It has been previously reported that spheres derived from CF41.Mg canine mammary carcinoma cells exhibit some stemness features. Melatonin has shown antitumor effects on cancer mammary cells; nevertheless, its effects has been poorly evaluated on canine mammary CSC. Recent reports have showed that melatonin modulates the expression of proteins related to epithelial-mesenchymal transition in breast CSC, such as E-cadherin, vimentin and OCT-4. The aim of this study was to determine the effects of melatonin on proliferation, migration and invasion of canine mammary carcinoma CF41.Mg cells and spheres derived from them. CF41.Mg cells were grown in DMEM high glucose supplemented with FBS and L-glutamine. CF41.Mg-spheres were cultured in ultra-low attachment plates with serum-free DMEM/F12 in presence of EGF, bFGF, insulin, B27 and heparin. Cell proliferation (MTS reduction) and migration/invasion (transwell) assays were conducted in presence of melatonin (0.01, 0.1 or 1 mM). Melatonin induced an antiproliferative effect at 1 mM (P<0.05), however the effect on spheres was higher (P<0.0001) than in parental cells. Cell migration/invasion was inhibited in response to non-cytotoxic concentrations of melatonin (P<0.05) both in spheres and in parental cells. These results indicate that melatonin plays a role in the proliferative and invasive activity of CF41.Mg cells, representing a valuable potential agent against mammary CSC.

Orientador: Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari / Banca: Bruno Cogliati / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Resumo: Câncer de mama representa a mais comum das neoplasias no sexo feminino, respondendo por 22% dos novos casos de câncer a cada ano. As neoplasias mamárias são ainda mais freqüentes na espécie canina, representando aproximadamente 52% de todas as neoplasias nas cadelas. A identificação de agentes terapêuticos que possam ser utilizados no tratamento alternativo para este tipo tumoral têm se revelado extremamente útil. A melatonina, um hormônio natural, parece exercer efeito oncostático em diferentes tipos de neoplasias. Considera-se como provável mecanismo de ação, sua interação com receptores estrogênicos e com os receptores MT1 e MT2 das células epiteliais, inibindo a proliferação das células neoplásicas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial valor terapêutico da melatonina em linhagens de câncer de mama e em tumores mamários caninos estrógeno-positivo e estrógeno-negativo, além de relacionar sua ação com a expressão dos receptores MT1 e MT2. A identificação de tumores mamários estrógeno-positivo e negativo foi realizada por meio de imuno-histoquímica e a expressão dos genes MT1 e MT2 nas amostras foi analisada por PCR em tempo real. As células cultivadas, provenientes dos tumores e das linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 foram tratadas com melatonina e a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio MTT. Observou-se 40% de redução na viabilidade celular nos tumores RE+ e RE- quando tratados, respectivamente, com 1mM e 10mM de melatonina (p<0,05). Além disso, os tumores RE+ apresentaram alta expressão dos receptores de melatonina MT1 e MT2 quando comparados aos tumores RE-. Com relação às linhagens, a linhagem MCF-7 (RE+) reduziu em 63% a viabilidade celular quando tratada com 10mM de melatonina (p<0,05) e para a linhagem MDA-MB-23 (RE-), esta mesma... (Resumo completo, clicar acesso eletrONico abaixo) / Abstract: Breast cancer is the most common cancer in women, accounting for 22% of new cancer cases each year. The mammary neoplasias are also common in canine species, representing about 52% of all cancers in female dogs. The identification of therapeutic agents that can be used as an alternative treatment for this tumor type has proven to be extremely useful. Melatonin, a natural hormone, can exercise oncostatic effects in several types of neoplasias. It is considered as a probable mechanism of action, their interaction with estrogenic receptors and with MT1 and MT2 receptors of the epithelial cells by inhibiting the proliferation of neoplastic cells. In this context, the objective of this study was to evaluate the potential therapeutic value of melatonin in breast cancer cell lines and canine mammary tumors estrogen-positive and estrogen-negative, also establishing relationship of its action to the MT1 and MT2 receptor. Identification of canine mammary tumors ER+ and negative was performed by immunohistochemistry and gene expression MT1 and MT2 in the samples was analyzed by real-time PCR. Cells cultured from the tumors and cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were treated with melatonin and cell viability was analyzed by MTT assay. We observed 40% reduction in cell viability in ER+ tumors and ER- when treated, respectively, with 1mM and 10mM melatonin (p <0.05). Furthermore, the ER+ tumors showed high expression of melatonin receptors MT1 and MT2 when compared to ER- tumors. Regarding cell lines, the cell line MCF-7 (ER+) showed 63% reduction in cell viability when treated with 10mM of melatonin (p <0.05) for the cell line MDA-MB-23 (ER-), this same concentration reduced 50% cell viability (p <0.05). The results suggest that melatonin decreases the viability of neoplastic cells, being more effective for RE-positive tumors... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Las células tumorales presentan alteraciones metabólicas. Una de las diferencias con las células no transformadas es que los tumores usan más glucosa incluso en condiciones de normoxia, lo que se utiliza actualmente para visualizar tumores mediante la técnica de PET. Ultimamente se están desarrollando terapias basadas en estas particularidades metabólicas de las células tumorales, que las hacen más sensibles a inhibición del metabolismo glicolítico. Aquí estudiamos la muerte producida por la falta de glucosa en sarcomas y otros tipos tumorales. La privación de glucosa induce apoptosis o necrosis dependiendo de la línea celular. Mostramos cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes de Bax/Bak, mientras que en las líneas de rabdomiosarcoma induce necrosis. Además la caspasa-8 está implicada en la muerte por ausencia de glucosa en estas células deficientes en Bax/Bak y también en células humanas HeLa. Investigamos el uso de 2-deoxiglucosa como inductor de muerte celular frente a líneas de rabdomiosarcoma alveolar y embrional. La 2-deoxiglucosa promueve muerte celular en líneas de rabdomiosarcoma alveolar. También induce diferenciación acompañada por una bajada de PAX3/FOXO1a, una proteína surgida de la translocación cromosómica en las células de rabdomiosarcoma alveolar y crítica en el desarrollo oncogénico de las mismas. Caracterizamos la muerte celular apoptótica inducida por 2-deoxiglucosa en líneas de sarcoma, in vitro. Estudiamos las moléculas de las rutas de apoptosis que determinan la sensibilidad de estas células a la 2-deoxiglucosa, con especial interés en las proteínas de la familia del oncogén Bcl-2. La muerte celular inducida por el tratamiento está asociada a la activación de Bax y Bak. Observamos que la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como Bcl-xL y de Mcl-1 previene la apoptosis, indicando que la muerte sucede a través de la ruta mitocondrial. Enseñamos que la bajada de Mcl-1 y la subida de Noxa son críticos en la muerte por 2-DG. Además, la 2-DG promueve estrés reticular acompañado de la inducción de ATF4 y chaperonas. Al bajar los niveles de ATF4, protegemos a las células de la muerte inducida por 2-DG y prevenimos la pérdida de Mcl-1. Incubamos células en presencia de manosa, que revierte el estrés inducido por la 2-DG y previnimos la muerte sin subir los niveles de ATP. Así, el estrés energético causado por la 2-DG no es la principal causa de muerte celular. También la 2-DG promueve la fosforilación de eIF2α, un inductor de ATF4, y la inactivación de mTOR. Nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores glicolíticos como la 2-DG pueden ser efectivos en el tratamiento de los rabdomiosarcoma alveolares y que Noxa podría ser un marcador pronóstico de la eficiencia de estas drogas. Por otro lado, caracterizamos las respuestas a la falta de glucosa y 2-DG, en particular la respuesta autofágica que puede determinar que las células mueran o no en respuesta a la falta de nutrientes. Observamos que las células están sensibilizadas al tratamiento con 2-DG tras el uso de cloroquina. Sin embargo, la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. Intentamos clarificar si la falta de glucosa está induciendo macroautofagia. El flujo de LC3 por western blot nos indica que no hay más macroautofagia ni en células DKO ni en las Rh4 en ausencia de glucosa. Por microscopía confocal y analizando células HeLa y Rh4, tampoco vemos mayores acúmulos de GFP-LC3 tras la retirada de glucosa comparando con tratamientos clásicos de inducción de autofagía como la retirada de aminoácidos o con rapamicina. Estos datos sugieren que la combinación de 2-DG con inhibidores de la autofagia podría ser útil en el tratamiento contra rabdomiosarcomas y que la falta de glucosa no induce autofagia. / Characterization of cell death induced by inhibition of glucose metabolism Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft-tissue tumor of childhood characterized by high malignancy, local invasiveness and a marked predisposition to metastasize. Recently, a number of therapies targeting tumor cell metabolism are being developed, since oncogenic changes make tumors more sensitive to inhibition of glycolytic metabolism. We observed that the glycolytic inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG) can efficiently promote cell death in p53-deficient alveolar rhabdomyosarcoma (the rhabdomyosarcoma subtype with poorer prognosis), but not in embryonal rhabdomyosarcoma. Differential expression of HIF-1 could not explain the different sensitivity of tumor subtypes. 2-deoxyglucose induced nuclear chromatin condensation, cleavage of caspase substrates and DNA degradation which was inhibited by caspase inhibitors. Cell death triggered by 2-DG was associated with its ability to activate Bax and Bak and was prevented by overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 homologs Bcl-xL and Mcl-1. Conversely, siRNA against Bcl-xL or Mcl-1 accelerated death. 2-DG promoted downregulation of the anti-apoptotic protein Mcl-1 and accumulation of two BH3-only proteins, Noxa and Bim. siRNA against these proteins indicated that Noxa mediates 2-DG-induced cell death. Addition of different carbon/energy sources indicated that apoptosis is not associated with loss of ATP but rather with endoplasmic reticulum stress and the eIF2-alpha-ATF4 pathway. 2-DG promoted Mcl-1 loss, probably due to general inhibition of translation, since both eIF2-alpha phosphorylation and inactivation of the mTOR pathway were observed. All these events (ER stress, energetic stress and inhibition of the mTOR pathway) are known to induce autophagy. Indeed, 2-DG induces autophagy, and inhibition of autophagy at different levels sensitizes cells to 2-DG. Together, our findings suggest that glycolysis inhibitors such as 2-DG may be effective in treating alveolar rhabdomyosarcoma.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:54:03Z : No. of bitstreams: 1 lopes_jr_me_sjrp.pdf: 325435 bytes, checksum: 90136719a8eb0c15c4ae524dada45238 (MD5) / Câncer de mama representa a mais comum das neoplasias no sexo feminino, respondendo por 22% dos novos casos de câncer a cada ano. As neoplasias mamárias são ainda mais freqüentes na espécie canina, representando aproximadamente 52% de todas as neoplasias nas cadelas. A identificação de agentes terapêuticos que possam ser utilizados no tratamento alternativo para este tipo tumoral têm se revelado extremamente útil. A melatonina, um hormônio natural, parece exercer efeito oncostático em diferentes tipos de neoplasias. Considera-se como provável mecanismo de ação, sua interação com receptores estrogênicos e com os receptores MT1 e MT2 das células epiteliais, inibindo a proliferação das células neoplásicas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial valor terapêutico da melatonina em linhagens de câncer de mama e em tumores mamários caninos estrógeno-positivo e estrógeno-negativo, além de relacionar sua ação com a expressão dos receptores MT1 e MT2. A identificação de tumores mamários estrógeno-positivo e negativo foi realizada por meio de imuno-histoquímica e a expressão dos genes MT1 e MT2 nas amostras foi analisada por PCR em tempo real. As células cultivadas, provenientes dos tumores e das linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 foram tratadas com melatonina e a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio MTT. Observou-se 40% de redução na viabilidade celular nos tumores RE+ e RE- quando tratados, respectivamente, com 1mM e 10mM de melatonina (p<0,05). Além disso, os tumores RE+ apresentaram alta expressão dos receptores de melatonina MT1 e MT2 quando comparados aos tumores RE-. Com relação às linhagens, a linhagem MCF-7 (RE+) reduziu em 63% a viabilidade celular quando tratada com 10mM de melatonina (p<0,05) e para a linhagem MDA-MB-23 (RE-), esta mesma... / Breast cancer is the most common cancer in women, accounting for 22% of new cancer cases each year. The mammary neoplasias are also common in canine species, representing about 52% of all cancers in female dogs. The identification of therapeutic agents that can be used as an alternative treatment for this tumor type has proven to be extremely useful. Melatonin, a natural hormone, can exercise oncostatic effects in several types of neoplasias. It is considered as a probable mechanism of action, their interaction with estrogenic receptors and with MT1 and MT2 receptors of the epithelial cells by inhibiting the proliferation of neoplastic cells. In this context, the objective of this study was to evaluate the potential therapeutic value of melatonin in breast cancer cell lines and canine mammary tumors estrogen-positive and estrogen-negative, also establishing relationship of its action to the MT1 and MT2 receptor. Identification of canine mammary tumors ER+ and negative was performed by immunohistochemistry and gene expression MT1 and MT2 in the samples was analyzed by real-time PCR. Cells cultured from the tumors and cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were treated with melatonin and cell viability was analyzed by MTT assay. We observed 40% reduction in cell viability in ER+ tumors and ER- when treated, respectively, with 1mM and 10mM melatonin (p <0.05). Furthermore, the ER+ tumors showed high expression of melatonin receptors MT1 and MT2 when compared to ER- tumors. Regarding cell lines, the cell line MCF-7 (ER+) showed 63% reduction in cell viability when treated with 10mM of melatonin (p <0.05) for the cell line MDA-MB-23 (ER-), this same concentration reduced 50% cell viability (p <0.05). The results suggest that melatonin decreases the viability of neoplastic cells, being more effective for RE-positive tumors... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:50:53Z : No. of bitstreams: 1 souza_fo_me_arafcf.pdf: 544783 bytes, checksum: b3fed971745dc3f334fa44491c3bbfe9 (MD5) / Atualmente, o câncer cervical é considerado a segunda causa mais comum entre as mulheres e encontra-se associado ao Papilomavírus Humano (HPV), que infecta células epiteliais escamosas, dando origem a grandes lesões. Em face da necessidade de se encontrar novos fármacos com atividade antineoplásica, têm-se procurado identificar substâncias isoladas de plantas brasileiras capazes de impedir a proliferação de células neoplásicas infectadas por HPV. A nitensidina B é um alcalóide guanidínico isolado de Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), que possui atividade citotóxica e antifúngica. O presente estudo teve por objetivo, verificar a atividade citotóxica, pró-apoptótica, genotóxica e mutagênica de nitensidina B, por meio de experimentos in vitro, utilizando células de carcinoma cervical infectadas por HPV-16 (SiHa) e não infectadas pelo vírus (C-33A). Para avaliar a citotoxicidade da nitensidina B o teste MTT foi realizado, sendo possível observar um efeito concentração-resposta nas duas linhagens testadas SiHa e C-33A, CI50 = 28,95 µM e 25,78 µM, respectivamente por 24 horas de tratamento e SiHa e C-33A, CI50 = 20,77 µM e 20,96 µM, respectivamente por 48 horas de exposição a nitensidina B. Com o intuito de avaliar a ação pró-apoptótica, foi realizado o ensaio de anexina V por citometria de fluxo e o ensaio do Hoechst-Iodeto de propídio, na qual pode-se verificar que a nitensidina B apresentou morte celular por apoptose tardia na linhagem de células infectadas por HPV-16 (SiHa) e baixa porcentagem de células apoptóticas nas células não infectadas pelo HPV-16 (C-33A), tanto por apoptose precoce, quanto na apoptose tardia/necrose, em todas as concentrações. Para o ensaio de genotoxicidade foi realizado o ensaio do... / Nowadays, cervical cancer is considered the second most common among women, and have been associated with human papillomavirus (HPV), which infects squamous epithelial cells resulting in major injuries. Given the need to find new drugs with antineoplastic activity, have sought to identify compounds antineoplastic from plants, wich are capable of preventing the proliferation of neoplastic cells infected by HPV. Nitensidine B is a guanidine alkaloid isolated from Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), which has cytotoxic and antifungical activies. This study aimed verify by cytotoxic, pro-apoptotic, genotoxic and mutagenic of nitensidine B through in vitro experiments, using cervical carcinoma cells infected by HPV-16 (SiHa) and not infected (C -33A). To evaluate the cytotoxicity of nitensidine B, by MTT assay, it being possible to observe an effect concentration response in both strains tested SiHa and C-33A, IC50 = 28.95 µM and 25.78 µM, respectively, by 24 hours of treatment and SiHa and C-33A, IC50 = 20.77 µM and 20.96 µM, respectively, by 48 hours. In order, to investigate pro-apoptotic activity, it was carried out annexin V flow cytometric and Hoechst-propidium iodide assay, which it could be seen that the nitensidine B showed apoptotic cell death late in the lineage of cells infected by HPV-16 (SiHa) and lower percentages of apoptotic cells in the cells not infected by HPV-16 (C-33A), both early apoptotic, late apoptotic and in necrosis at all concentrations used. For the genotoxicity assay was performed comet assay, where there was a high percentage of DNA in the tail of the cells studied. In SiHa cell line was observed significant genotoxicity at all concentrations tested in treatment for 6 hours and the concentration of DNA in the tail at 5.00 µM to 16.0 µM on exposing cells for 24 hours with nitensidine B. For the line... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Christiane Pienna Soares / Banca: Luís Octávio Regasini / Banca: Eliana Aparecida Varanda / Resumo: Atualmente, o câncer cervical é considerado a segunda causa mais comum entre as mulheres e encontra-se associado ao Papilomavírus Humano (HPV), que infecta células epiteliais escamosas, dando origem a grandes lesões. Em face da necessidade de se encontrar novos fármacos com atividade antineoplásica, têm-se procurado identificar substâncias isoladas de plantas brasileiras capazes de impedir a proliferação de células neoplásicas infectadas por HPV. A nitensidina B é um alcalóide guanidínico isolado de Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), que possui atividade citotóxica e antifúngica. O presente estudo teve por objetivo, verificar a atividade citotóxica, pró-apoptótica, genotóxica e mutagênica de nitensidina B, por meio de experimentos in vitro, utilizando células de carcinoma cervical infectadas por HPV-16 (SiHa) e não infectadas pelo vírus (C-33A). Para avaliar a citotoxicidade da nitensidina B o teste MTT foi realizado, sendo possível observar um efeito concentração-resposta nas duas linhagens testadas SiHa e C-33A, CI50 = 28,95 µM e 25,78 µM, respectivamente por 24 horas de tratamento e SiHa e C-33A, CI50 = 20,77 µM e 20,96 µM, respectivamente por 48 horas de exposição a nitensidina B. Com o intuito de avaliar a ação pró-apoptótica, foi realizado o ensaio de anexina V por citometria de fluxo e o ensaio do Hoechst-Iodeto de propídio, na qual pode-se verificar que a nitensidina B apresentou morte celular por apoptose tardia na linhagem de células infectadas por HPV-16 (SiHa) e baixa porcentagem de células apoptóticas nas células não infectadas pelo HPV-16 (C-33A), tanto por apoptose precoce, quanto na apoptose tardia/necrose, em todas as concentrações. Para o ensaio de genotoxicidade foi realizado o ensaio do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, cervical cancer is considered the second most common among women, and have been associated with human papillomavirus (HPV), which infects squamous epithelial cells resulting in major injuries. Given the need to find new drugs with antineoplastic activity, have sought to identify compounds antineoplastic from plants, wich are capable of preventing the proliferation of neoplastic cells infected by HPV. Nitensidine B is a guanidine alkaloid isolated from Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), which has cytotoxic and antifungical activies. This study aimed verify by cytotoxic, pro-apoptotic, genotoxic and mutagenic of nitensidine B through in vitro experiments, using cervical carcinoma cells infected by HPV-16 (SiHa) and not infected (C -33A). To evaluate the cytotoxicity of nitensidine B, by MTT assay, it being possible to observe an effect concentration response in both strains tested SiHa and C-33A, IC50 = 28.95 µM and 25.78 µM, respectively, by 24 hours of treatment and SiHa and C-33A, IC50 = 20.77 µM and 20.96 µM, respectively, by 48 hours. In order, to investigate pro-apoptotic activity, it was carried out annexin V flow cytometric and Hoechst-propidium iodide assay, which it could be seen that the nitensidine B showed apoptotic cell death late in the lineage of cells infected by HPV-16 (SiHa) and lower percentages of apoptotic cells in the cells not infected by HPV-16 (C-33A), both early apoptotic, late apoptotic and in necrosis at all concentrations used. For the genotoxicity assay was performed comet assay, where there was a high percentage of DNA in the tail of the cells studied. In SiHa cell line was observed significant genotoxicity at all concentrations tested in treatment for 6 hours and the concentration of DNA in the tail at 5.00 µM to 16.0 µM on exposing cells for 24 hours with nitensidine B. For the line... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T14:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ziegler_FabianeLaFlor_D.pdf: 4176640 bytes, checksum: fccef651838684499cf4cf698073b39e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo geral da presente pesquisa foi avaliar o efeito de um concentrado de proteínas do soro do leite bovino (WPC) enriquecido com o fator de crescimento e transformação beta (TGF-?) e lactoferrina, em pacientes pediátricos com Leucemia Mieloide Aguda - LMA (Capítulo 2); desenvolver um modelo de mucosite gastrointestinal induzida por quimioterápicos, em ratos Wistar, para posterior avaliação da eficácia das proteínas lácteas na proteção da mucosa (Capítulo 3); avaliar os efeitos pelo WPC e por uma caseína comercial, in vivo e in vitro sobre células leucêmicas humanas transplantadas em camundongos imunodeficientes (NOD/SCID) e em cultura de células (Capítulo 4). Para todos os estudos foi utilizado WPC enriquecido com TGF-??e lactoferrina doado pela empresa Hilmar Cheese Company (Cal, USA). No capítulo 2 realizou-se estudo de intervenção nutricional, prospectivo, duplo cego com placebo controlado, onde foram avaliados 21 pacientes, entre 0 a 19 anos, virgens de terapia, admitidos no Centro Infantil Boldrini, Campinas - SP. Foram avaliados quanto à adequação da ingestão alimentar, estado nutricional (EN), dosagem de glutationa (GSH) eritrocitária, hemograma, produção de citocinas no plasma e em cultura de células, imunoglobulina A salivar e evolução da mucosite. Foram comparados os resultados bioquímicos dos pacientes com um grupo controle de indivíduos saudáveis da mesma faixa etária. Utilizou-se o software SPSS para as análises estatísticas (p<0,05). O protocolo de pesquisa foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com registro 14097. Tomados em conjunto os resultados indicaram que o WPC apresentou efeito positivo sobre o EN dos pacientes, porém não influenciou na composição corporal. A distribuição % dos macronutrientes estava adequada em todos os tempos para os grupos WPC e maltodextrina (placebo), mas o % de adequação dos micronutrientes não atendia às recomendações em sua maioria. As análises bioquímicas não evidenciaram superioridade do WPC em relação ao placebo. Não houve diferença significativa entre os grupos sobre a avaliação clínica da mucosite oral. Na comparação dos pacientes com LMA e indivíduos saudáveis (controle) pode-se constatar níveis estatisticamente superiores do controle nos parâmetros bioquímicos de albumina, pré-albumina, eritrócitos, hematócrito, hemoglobina, plaquetas, produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) e interferon gama (IFN-?) quando estimuladas pela vacina BCG liofilizada e produção de IL-6 quando estimulada por fitohemaglutinina (PHA). No entanto, para a concentração de GSH eritrocitária e produção espontânea das citocinas TNF-??e IFN-??verificou-se que os pacientes com LMA apresentaram níveis estatisticamente superiores em relação ao controle saudável. No capítulo 3 foi elaborado um protocolo de indução de mucosite em ratos Wistar testando-se os quimioterápicos 5-Fluoruracila (5-FU) e sulfato de vincristina (SV), em administrações de diferentes concentrações e número de doses. Através desse experimento concluiu-se que o SV não foi um bom agente indutor de mucosite, ao contrário do 5-FU. A partir desses resultados foram realizados experimentos com 5-FU visando ajuste das condições dos experimentos inclusive do número, periodicidade e concentração das doses do quimioterápico. O melhor modelo de indução de mucosite gastrointestinal foi obtido através da administração de 3 doses de 5-FU com intervalo de 3 dias entre cada dose, nas concentrações entre 50 e 70 mg/Kg/dose. Os índices bioquímicos não foram influenciados pelo efeito da peletização da dieta e, de modo geral não houve diferença significativa entre os grupos tratados com WPC e com caseína. Independente da natureza da proteína (WPC ou caseína) observou-se maior proteção contra o 5-FU quando os animais receberam as dietas previamente à administração do quimioterápico. Ao contrário do esperado, o estímulo imunológico com hemáceas de carneiro não promoveu aumento nos níveis de GSH nos eritrócitos. As proteínas do soro do leite protegeram a mucosa, em termos de promover menor intensidade de mucosite, nos períodos mais críticos (72h após a 2ª e a 3ª dose de 5-FU) nas regiões de maior prevalência, duodeno e jejuno, quando se comparou com os resultados obtidos para os grupos tratados com caseína. Para os experimentos in vivo, do capítulo 4, utilizaram-se células de leucemia linfóide aguda (LLA) pediátrica humana, isoladas de pacientes do Centro Infantil Boldrini, as quais foram inoculadas em camundongos NOD/SCID. Nesses experimentos, utilizou-se dieta AIN-93G com WPC ou caseína e dieta comercial e o quimioterápico SV. Avaliou- se: peso corporal, consumo de dieta, razão entre peso dos órgãos (rim, baço e fígado) e peso corporal, evolução da leucemia, tempo de sobrevida, hemograma e níveis de glutationa em eritrócitos do sangue periférico. Nos experimentos in vitro foram usadas 6 linhagens celulares: K562 (Leucemia Mieloide Crônica), Nalm-6 (Leucemia Linfóide Aguda do tipo B), Jurkat (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), CEM (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), RAMOS (Linfoma Burkitt) e HL-60 (Leucemia Mieloide Aguda). Foram testadas a citotoxicidade (IC50) do WPC, a viabilidade celular e os níveis de glutationa total nas células leucêmicas estudadas em 4 tempos (0, 24, 48 e 72h) e 4 condições diferenciadas (células; células + WPC; células + WPC + ARAC-C; células + ARA-C). Todos os resultados, tanto do capítulo 3 como do 4, foram analisados através do software ¿Statística: Basic Statistics and Tables¿. Não houve diferença entre o WPC e a caseína em relação aos parâmetros avaliados nos experimentos in vivo, exceto na análise de Doença Residual Mínima (DRM), na qual a caseína se mostrou mais efetiva que o WPC. Constatou-se superioridade do WPC sobre os resultados de peso corporal, razão dos rins e baço pelo peso e evolução da leucemia em relação aos animais tratados com dieta comercial. Não foi possível verificar um efeito sinergístico entre o WPC e o quimioterápico sulfato de vincristina. No que se refere aos experimentos in vitro, o WPC apresentou IC50 para Nalm-6 de 6,72 mg/mL e para a linhagem CEM de 11,84 mg/mL. Verificou-se que as linhagens K562, Nalm-6 e HL-60 apresentaram perfis semelhantes em relação à viabilidade celular. No entanto, em relação à produção de glutationa total, cada linhagem comportou-se de maneira diferenciada, sendo que a maior produção em todas as condições e tempos estudados, foi para a linhagem HL-60 seguida pela K562 / Abstract: The objective of this research was to evaluate the effect of a bovine milk whey protein concentrate (WPC), enriched with transforming growth factor beta (TGF-ß) and lactoferrin in pediatric patients with Acute Myeloide Leukemia (AML) (Chapter 2); in a chemotherapic-induced gastrointestinal mucositis model in Wistar rats (Chapter 3); evaluate in human leukemic cells in culture or transplanted into immune-deficient mouse NOD/SCID (Chapter 4). WPC enriched with TGF-ß and lactoferrin was donated by Hilmar Cheese Company (Cal, USA). Chapter 2 describes a randomized, double-blind, placebo controlled, prospective clinical trial of nutritional intervention with participation of 21 therapy-naïve patients with AML aged 0-19 years from Centro Infantil Boldrini, Campinas, SP. Food intake, nutritional status, red blood cell glutathione (GSH) concentration, haemogram, cytokine concentration in plasma and cell cultures, salivary immunoglobulin A (IgA) and evolution of mucositis were studied. Health individuals at the same age range were used as a control group. The statistical analysis was done using SPSS software (p < 0.05). The research protocol was approved by the National Committee of Ethics in Research (CONEP), resgistered by the number 14097. WPC showed a positive effect in the nutritional status of the patients, but it did not influence their body composition. Percentual distribution of macronutrients was adequate in all times of analyses for both WPC and maltodextrin (placebo) groups, but the percentage of adequacy of the majority of micronutrients did not reach recommendation. Other laboratorial analyses and evolution of mucositis did not show any difference between WPC and placebo groups. Comparison of AML patients with a group of healthy control showed higher concentrations of albumin, prealbumin, haematocrit, hemoglobin, platelets, Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine-stimulated tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin 6 (IL-6), interleukin 10 (IL-10) and interferon gamma (IFN-?) and phytohemaglutinin (PHA)- stimulated IL-6 in controls. On the other hand, patients with AML had higher red blood cell glutathione concentration and spontaneous TNF-a and IFN-??production in comparison to controls. Chapter 3 describes the experiments envolved in the development of a chemotherapic-induced model of mucosites, in Wistar rats, in which 5-Fluoruracila (5-FU) and Vincristine Sulfate (VS) were used, in various concentrations and number of doses. Through this experiment it was concluded that the VS was not a good promoter of mucositis in rats, unlike 5-FU. From these results, experiments were performed with 5-FU considering conditions of the experiments including the number, frequency and concentration of the doses of chemotherapic. The best model was obtained by the administration of 3 doses of 5-FU, each with a 3-days interval and concentrations in the range of 50 to 70 mg/Kg/dose. Haematological parameters and erythrocyte glutathione (GSH) were not influenced by pelletization of the diet and no difference was found between WPC and casein groups. Independent of the protein type (casein or WPC) the effect of 5-Fluoruracila was less deleterious when the diets were offered prior to the chemotherapic treatment. Contrary to expected, sheep red blood cells did not stimulate higher production of erythrocyte GSH by the WPC. WPC decreased mucosites intensity better than casein protecting the mucosa during the most critical periods (72h after 2nd and 3rd doses of 5-FU) in the intestinal regions of major prevalence of mucositis (duodenum and jejunum). More studies are required to support the WPC benefit in the protection and recovery of the mucosa GIT in experimental animal models, and possibly in humans. In chapter 4, cells originated from patients with Acute Lymphoid Leukemia (ALL) from Centro Infantil Boldrini were inoculated in NOD/SCID mice. The animals were fed with commercial diet or AIN-93G diet with WPC or casein as the only protein source and used the chemotherapic vincristine sulfate. Body weight, diet ingestion, ratio between organs (kidney, spleen and liver) and body weight, leukemia evolution, survival time, haemogram and glutathione levels were evaluated. The cell lineages K562 (Chronic Myeloid Leukemia), Nalm-6 (B cell, ALL), Jurkat (T cell, ALL), CEM (T cell, ALL), RAMOS (Burkitt¿s Lymphoma) and HL-60 (AML) were used for the in vitro assays, in which WPC cytotoxicity (IC50), cell viability and glutathione levels were accessed in four different times (0, 24, 48 and 72h) and conditions (cells; cells + WPC; cells + WPC + ARA-C; cells + ARA-C). Data were submitted to statistic analysis by using the: Basic Statistics and Tables software. There was no differences between WPC and casein in relation to the parameters evaluated in vivo, with the exception of the analysis of Minimal Residual Disease (MRD), in which casein seemed to be more effective than WPC. Results on body weight, ratio between organs and body weight and evalution of leukemia were better for the WPC group when compared with animals fed commercial diet. No synergistic effect between the WPC and vincristine sulfate could be observed. In the in vitro experiments, WPC IC50 was 6,72 mg/mL for Nalm-6 and 11,84 mg/mL for CEM cells. K562, Nalm-6 and HL-60 cell lineages showed similar viability profiles. However, each lineage produced different total glutathione concentration in the culture medium, with a higher production achieved by HL-60 cells, followed by K562 cells / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição