Numerous mutations contribute to tumorigenesis of cancer cells. For most of them it remains unclear whether they are driver or passenger mutations. A classic knock-out to study their function in cancer cells used to take a lot of effort. The CRISPR/Cas-system can be used as a programmable “genome editing” tool. In this work, oncogenes have been inactivated with the CRISPR/Cas-system. Considering off-targets, Streptococcus pyogenes sgRNAs can be designed for 88% of the known cancer mutations. The activity of 15 sgRNAs, targeting 13 mutations in proto-oncogenes (deletions, insertions and point mutations), has been tested with a RFP-GFP-reporter plasmid. For 13 sgRNAs, activity prediction scores correlated with measured activity. Furthermore, sgRNAs have shown preferential binding to mutated versions of targeted proto-oncogene sequence and did not induce double strand breaks in the wild type sequence. For 10 sgRNAs, the activity against their target sequence has been more than 4 times higher than against the wild type sequence. Most of those sgRNAs target insertions or deletions and fewer target point mutations. Permanent knock-out of three mutated proto-oncogenes NPM1, BRAF and PIK3CA has been achieved with a lentiviral expression of CRISPR/Cas. Accordingly, effects on proliferation and phenotype have been studied. Knock-out of NPM1 c.863_864insTCTG mutation has been studied in heterozygous mutated OCI AML3 cell line. Proliferation was strongly inhibited by the corresponding sgRNA. Cells arrested in G0/1-phase of cell cycle (77%) compared to control cells (56%), although no difference was observed for sub-G1 phase, indicating no induction of apoptosis. Cells treated with NPM1 sgRNA had 88% reduced expression of NPM1 c.863_864insTCTG mRNA as well as less cytoplasmic localization of nucleophosmin as assessed by immunostaining. The activity of sgRNA has been confirmed by deep sequencing, showing a shift of wild type to mutated allele ratio from 51:49 to 68:32. This effect was enhanced by the additional treatment with the NHEJ inhibitor SCR7. A BRAFV600E sgRNA was tested in homozygously mutated melanoma cell lines A-375 and SK MEL-28. No differences were detected in comparison to controls. However, in the CRC cell line RKO, heterozygous for BRAFV600E and PIK3CAH1047R, proliferation was inhibited through sgRNAs against either BRAF or PIK3CA. A combination of both had no synergistic effect on proliferation. Activity and specificity of the sgRNA targeting BRAF were confirmed by deep sequencing, while the PIK3CA sgRNA showed a moderate induction of double strand breaks also in the wild type allele. The relation of wild type to mutated allele of BRAF was changed from 32:68 before treatment to 51:49 afterwards. This effect can be explained by a “re mutation” to the wild type after DSB via HDR with wild type sister chromatid as template. This effect was observed for PIK3CA sgRNA to a lesser extent. In conclusion, these results show the applicability of the CRISPR/Cas-system for the inactivation of mutated proto-oncogenes.:List of tables III List of figures IV List of abbreviations V 1 Introduction 1 1.1 Cancer 1 1.2 Oncogenes 2 1.2.1 Role in cancer 2 1.2.2 Targeted therapies 3 1.2.3 NPM1 5 1.2.4 BRAF 6 1.2.5 PIK3CA 7 1.3 CRISPR/Cas-system 7 1.4 Aim and motivation 10 2 Material and Methods 11 2.1 Design of sgRNAs 11 2.2 Plasmids 11 2.3 Cell culture 12 2.4 FACS analysis 14 2.5 T7 assay 14 2.6 Cell cycle analysis 15 2.7 Immunostaining 15 2.8 Apoptosis assay 16 2.9 Quantification of mutant NPM1 transcripts 16 2.10 Deep sequencing 16 2.11 Statistical Analysis 19 3 Results 20 3.1 Design of sgRNAs targeting oncogenes 20 3.2 Evaluation of sgRNA efficacy and selectivity 23 3.3 Effects of oncogene knock-out in cancer cell lines 27 3.3.1 Targeting NPM1 in AML cells 27 3.3.2 Targeting BRAF in melanoma cells 30 3.3.3 Targeting BRAF and PIK3CA in colorectal carcinoma cells 31 4 Discussion 37 4.1 The design of sgRNAs is possible for most cancer mutations 37 4.2 sgRNAs targeting oncogenes have to be tested 37 4.3 Oncogenes can be knocked out with the CRISPR/Cas-system 37 4.3.1 NPM1 in AML cells 37 4.3.2 BRAF in melanoma cells 38 4.3.3 BRAF and PIK3CA in CRC cells 38 4.4 Advantages and disadvantages to target oncogenes with the CRISPR/Cas-system 40 4.5 Concluding remarks 41 5 Original Article 43 6 Summary 47 7 Zusammenfassung 49 List of references 51 Appendix VIII / In Krebszellen tritt eine Vielzahl von Mutationen auf. Für den Großteil der Mutationen ist ungeklärt, ob es sich um krebsverursachende oder passagere Mutationen handelt. Ein gezieltes Ausschalten (Knock-out) dieser Gene zur Untersuchung ihrer Funktion in Krebszellen war bisher mit großem Aufwand verbunden. Das CRISPR/Cas-System lässt sich als programmierbares „Genome-editing“ Werkzeug einsetzen und wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um gezielt mutierte Protoonkogene zu inaktivieren. Für 88% der bekannten, in Krebszellen auftretenden Mutationen lassen sich, unter Berücksichtigung von off-targets, Streptococcus pyogenes sgRNAs entwerfen. Mit Hilfe eines RFP-GFP-Reporter-Plasmides wurde die Aktivität von 15 sgRNAs gegen 13 Mutationen (Deletionen, Insertionen und Punktmutationen) in Protoonkogenen überprüft. Für 13 der sgRNAs zeigte sich eine Aktivität, die mit der Vorhersage durch den Algorithmus korrelierte. Außerdem wurde gezeigt, dass die sgRNAs spezifisch genug binden, um zwar bei der mutierten Sequenz eines Protoonkogens, jedoch nicht bei der Wildtyp-Sequenz Doppelstrangbrüche zu erzeugen. Unter den sgRNAs waren 10 mit mehr als 4-fach höherer Aktivität bei komplett übereinstimmender Zielsequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz. Diese spezifischen sgRNAs waren vor allem gegen Insertions- oder Deletionsmutationen gerichtet, einige auch gegen Punktmutationen. Durch permanente, lentivirale Expression von CRISPR/Cas wurden die Effekte eines Knock-out von drei mutierten Protoonkogenen, NPM1, BRAF und PIK3CA, auf das Wachstum und phänotypische Aspekte humaner Krebszelllinien untersucht. Ein Knock-out der NPM1 c.863_864insTCTG Mutation wurde in heterozygot mutierten OCI AML3 Zellen untersucht, es zeigte sich eine starke Proliferationshemmung. In der Zellzyklusanalyse trat ein G0/1-Arrest dieser Zellen (77%) im Vergleich mit Kontroll-Zellen (56%) auf, jedoch keine Unterschiede in der sub-G1-Analyse, sodass nicht von einer vermehrten Apoptose auszugehen ist. Die mit sgRNA behandelten OCI-AML3 Zellen zeigten sowohl eine um 88% verminderte NPM1 c.863_864insTCTG mRNA-Expression als auch verminderte zytoplasmatische Sublokalisation des Nucleophosmins in der Immunfärbung. Die hohe Aktivität der gRNA gegen mutiertes NPM1 wurde durch Deep Sequencing bestätigt, außerdem hat sich das Verhältnis vom Wildtyp- zu mutiertem Allel von 51:49 zu 68:32 verschoben. Dieser Effekt wurde durch Zugabe des NHEJ-Hemmstoffes SCR7 noch verstärkt. Die sgRNA gegen BRAFV600E wurde in den homozygot mutierten Melanom-Zelllinien A-375 und SK-MEL-28 getestet. Bei Proliferationsversuchen zeigten sich keine Unterschiede im Vergleich zu Kontrollzellen. In der kolorektalen Krebszelllinie RKO, die heterozygot BRAFV600E und PIK3CAH1047R ist, zeigte sich bei der Testung von sgRNAs gegen BRAF, PIK3CA und Kombination beider sgRNAs eine Wachstumshemmung. Jedoch lag kein synergistischer Effekt bei sgRNA-Kombination vor. Zudem bestätigten sich Aktivität und Spezifität der sgRNA gegen BRAF im Deep Sequencing, während die sgRNA gegen PIK3CA in mäßigem Umfang Doppelstrangbrüche im Wildtyp-Allel verursachte. Das Verhältnis vom Wildtyp- zu mutiertem BRAF Allel verschob sich von 32:68 ohne sgRNA zu 51:49 nach sgRNA-Behandlung. Eine mögliche Erklärung dieser Beobachtung ist die Rückmutation zum Wildtyp-Allel nach Doppelstrangbruch mit Hilfe homologer Rekombination durch das Wildtyp-Schwesterchromatid. Für PIK3CA konnte dieser Effekt in schwächerem Ausmaß ebenfalls beobachtet werden. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass das CRISPR/Cas-System zur Inaktivierung mutierter Protoonkogene genutzt werden kann.:List of tables III List of figures IV List of abbreviations V 1 Introduction 1 1.1 Cancer 1 1.2 Oncogenes 2 1.2.1 Role in cancer 2 1.2.2 Targeted therapies 3 1.2.3 NPM1 5 1.2.4 BRAF 6 1.2.5 PIK3CA 7 1.3 CRISPR/Cas-system 7 1.4 Aim and motivation 10 2 Material and Methods 11 2.1 Design of sgRNAs 11 2.2 Plasmids 11 2.3 Cell culture 12 2.4 FACS analysis 14 2.5 T7 assay 14 2.6 Cell cycle analysis 15 2.7 Immunostaining 15 2.8 Apoptosis assay 16 2.9 Quantification of mutant NPM1 transcripts 16 2.10 Deep sequencing 16 2.11 Statistical Analysis 19 3 Results 20 3.1 Design of sgRNAs targeting oncogenes 20 3.2 Evaluation of sgRNA efficacy and selectivity 23 3.3 Effects of oncogene knock-out in cancer cell lines 27 3.3.1 Targeting NPM1 in AML cells 27 3.3.2 Targeting BRAF in melanoma cells 30 3.3.3 Targeting BRAF and PIK3CA in colorectal carcinoma cells 31 4 Discussion 37 4.1 The design of sgRNAs is possible for most cancer mutations 37 4.2 sgRNAs targeting oncogenes have to be tested 37 4.3 Oncogenes can be knocked out with the CRISPR/Cas-system 37 4.3.1 NPM1 in AML cells 37 4.3.2 BRAF in melanoma cells 38 4.3.3 BRAF and PIK3CA in CRC cells 38 4.4 Advantages and disadvantages to target oncogenes with the CRISPR/Cas-system 40 4.5 Concluding remarks 41 5 Original Article 43 6 Summary 47 7 Zusammenfassung 49 List of references 51 Appendix VIII

Je m'intéresse à l'usage des adverbes de manière et de degré dans les écrits d'une scriptrice saguenéenne qui a vécu au XXe siècle. Par cette étude, les principes proposés dans les théories contemporaine et historique à propos des adverbes (et de leur relation avec les adjectifs) peuvent être observés dans l'usage. Cela permet de rendre compte de l'utilisation réelle qui est faite des adverbes à une époque spécifique dans le but de formuler quelques observations quant à leur emploi général. Dans un corpus de documents intimes, 1 359 occurrences d'adverbes et d'adjectifs ont été extraites. Leur analyse a corroboré de nombreux postulats émis dans les ouvrages scolaires historiques ainsi que dans les études théoriques contemporaines. Cependant, elle a aussi permis de mettre en lumière quelques phénomènes plus particuliers. Par exemple, l'analyse de la variabilité a permis de considérer la thèse de l'hypercorrection graphique et elle a soulevé des questions par rapport à la catégorisation des mots en classes grammaticales (Hummel, 2017a; Hummel, 2017b). De plus, l'observation des occurrences met en exergue le fait que la modification syntaxique semble subordonnée à la catégorisation sémantique des adverbes : l'appartenance à une sous-catégorie adverbiale parait ainsi avoir une incidence sur les syntagmes modifiés. Des constats ont aussi été faits du côté de la sélection : ce concept est lié de près à celui de la modification. Le rôle de la sémantique dans la sélection des adverbes (et des adjectifs) ne semble pas non plus à négliger. Enfin, d'autres particularités ont été mises de l'avant et ces dernières ont notamment permis d'illustrer l'importance discursive des adverbes à l'écrit. Il convient toutefois de rappeler que cette étude constitue une brève incursion : de nombreuses pistes de recherche en syntaxe et en sociolinguistique doivent encore être approfondies (entre autres par l'analyse d'un plus grand nombre d'occurrences)

La mise en lumière d’inconduites, au sein d’organisations privées et publiques, ne sont que quelques-uns des facteurs qui ont entrainé, au cours des dernières décennies, des questionnements quant au rôle que devraient jouer ces organisations sur le plan éthique et social. La mise en place de dispositifs ayant pour but de soutenir l’éthique en milieu de travail donne dès lors forme à des efforts d’institutionnalisation de l’éthique. Or, une grande confusion persiste – au sein du discours public, managérial et même théorique – quant au mode de régulation sociale que constitue l’éthique. Ainsi, les initiatives déployées sous ce libellé s’inscrivent parfois dans des visées fort variées. En parallèle, la fonction ressources humaines, ainsi que les professionnels qui la composent (PRH), est soumise à une évaluation sévère de leur performance. Le rôle de ces derniers à titre de gardiens du contrat social des employés est pour sa part largement remis en question. C’est dans ce contexte que la présente thèse vise à explorer la forme que prend l’éthique organisationnelle, ainsi que les liens pouvant être tissés entre l’institutionnalisation de cette dernière et la fonction ressources humaines. Pour ce faire, deux organisations québécoises de grande taille (N=2) sont étudiées. Afin de contraster le discours organisationnel du discours des PRH, une analyse documentaire est effectuée et 35 entretiens semi-dirigés (N=35) auprès de PRH sont complétés. Les résultats suggèrent qu’en l’absence de formalisation, des pratiques informelles – voire une forme de corégulation – émergent afin de pallier à un manque de sens et de lignes directrices. Des facteurs tels que la nature politique et hiérarchique de l’organisation et de certaines prises de décision peuvent toutefois faire dévier celles-ci ainsi que les efforts d’institutionnalisation. De même, l’analyse de la place qui est accordée à l’éthique au sein d’un milieu de travail donné ne peut être évaluée par biais du seul concept d’infrastructure éthique. En effet, il doit être bonifié par la prise en considération des éléments de l’infrastructure RH touchant à l’éthique. De plus, dans le but de favoriser le développement de la compétence éthique – tant au plan individuel qu’organisationnel –, les infrastructures auraient avantage à incorporer les dimensions morales telles que les trois éthiques (sollicitude, justice, critique), et ce, pour un développement optimal. La présente thèse donne ainsi forme au développement du concept d’armature organisationnelle en soutien à l’éthique ainsi qu’à une modélisation du processus d’institutionnalisation de l’éthique au sein d’une organisation. / The bringing into light of misconducts, observed within private and public organisations alike, is only one of the factors which has in recent decades led to a questioning of their social and ethical roles. The implementation of mechanisms which aim to sustain ethics within the workplace thus shaped institutionalisation of ethics efforts. However, a great confusion persists – within the public, managerial and even theoretical discourse – as to the social regulation mode that is ethics. Consequently, initiatives deployed under this labelling often pursue very different aims. In parallel, the human resources function, as well as its professionals (HRP), is subjected to a severe performance evaluation. Notably the role of these professionals, as guardians of the social contract uniting employees to the organisation, is often called into question. It is in this context that this thesis aims to explore the form that organisational ethics take as well as the links which may be established between the institutionalisation of ethics and the human resources function. To achieve this, two large-size Quebec organisations (N=2) are studied. In order to contrast the organisational discourse to that of the HRPs, a documentary analysis is completed as well as thirty-five (N=35) semi-directed HRP interviews. The results suggest that in the absence of formalisation, informal practices – and even a form of coregulation – emerge to mitigate the absence or lack of sense and direction. However, factors such as the political and hierarchical nature of the organisation and of some of the decisions can make these, as well as institutionalisation efforts, deviate. Similarly, it is posited that the place that is granted to ethics within a given workplace cannot be evaluated by the sole concept of ethical infrastructure. Indeed, this concept must be complemented by the taking into consideration of the elements of the HR infrastructure which pertain to ethics. Moreover, in order to favour an optimal development of ethical competence – at both the individual and organisational levels –, infrastructures would benefit from the incorporation of moral dimensions such as the three ethics (care, justice, critique). This thesis thus gives shape to the concept of organisational framework in support of ethics as well as to a model of the institutionalisation process of ethics within organisations.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / L’analyse de la controverse sur le gaz de schiste en France et au Québec à un niveau intermédiaire (méso) permet de souligner les processus de construction et contestation sociale et politique des différents cadrages soutenus par les réseaux d’acteurs en concurrence. Les dynamiques d’intéressement à l’intérieur et à l’extérieur de l’action publique illustrent les multiples scènes et forums dans lesquels se déploie la controverse. L’analyse de la construction de ce problème public et ses diverses redéfinitions démontre le rôle central du cadrage politique des controverses. Les solutions retenues définissent tout autant qu’elles tentent de réduire le risque relatif à cette nouvelle industrie gazière (face à un risque cadré comme technologique en France, on observe un cadrage sur l’acceptabilité sociale au Québec). Il s’agit alors d’insister particulièrement sur la dimension procédurale de problématisation des enjeux au regard du recours à la participation publique et à l’expertise scientifique. Les multiples acteurs de cette controverse sont interrogés : les participants à la mobilisation sociale mais aussi les acteurs de l’industrie et des structures politiques et administratives, afin de dresser la cartographie de leur position mais aussi de leurs discours depuis les prémices de cette nouvelle activité industrielle d’exploration du gaz de schiste (2008) jusqu’aux derniers rebondissements politiques (2015). Cette recherche s’appuie sur un corpus d’entretiens qualitatifs (40) mais aussi d’articles de presse écrite (2 400) ainsi que sur l’analyse qualitative et quantitative des divers rapports et commissions de travail sur le gaz de schiste. MOTS-CLÉS Gaz de schiste, controverse, traduction, problème public, hydrocarbures non conventionnels, fracturation hydraulique, expertise, intéressement, comparaison, risque technologique, acceptabilité sociale. / The analysis of the shale gas controversy in France and Quebec at an intermediate (meso) level stresses the social and political construction and dispute processes of the various framings supported by contesting actors’ networks. “Interestment” dynamics both inside and outside public policies show the multiple scenes and forums in which the controversy unfold. The analysis of how this public problem is built and its various redefinitions shows the core role of political framing of controversies. The solutions define as well as they reduce the risk related to this new industry (a technological risk in France and a frame on social acceptability in Quebec). It is then important to stress the procedural dimension of problematizing the stakes regarding public participation and scientific expertise. This study questions the various actors of the controversy, those of social mobilization, the industry and the political and administrative structures, to map both their position and their discourses since the beginnings of the new industrial activity of exploring for shale gas (2008) to the latest political developments (2015). This study is based on a corpus of qualitative interviews (40), press articles (2 400) and a qualitative and quantitative analysis of the various reports and committees on shale gas. KEYWORDS Shale gas, controversy, translation, public problem, unconventional hydrocarbons, hydraulic fracturing, expertise, interestment, comparison, technological threat, social acceptability.

Ce mémoire présente des résultats d'une recherche descriptive exploratoire, basée sur une étude de cas, qui vise à identifier les méthodes pédagogiques favorables à l'établissement d'un environnement d'apprentissage socioconstructiviste dans un cours en ligne en mode hybride. Nous avons fondé notre étude sur une analyse qualitative des échanges entre un professeur de sciences humaines et les sept étudiants d'un cours de deuxième cycle, dans une université canadienne francophone, en utilisant l'enregistrement intégral de 8 séances de cours en mode synchrone pour dégager des tendances et pour identifier des méthodes pédagogiques appropriées à ce contexte.

La problématique adressée dans notre projet concernait les participants d’un service d’aide individualisée en mathématiques au collégial et certaines de leurs difficultés rencontrées lors du passage du secondaire vers le cégep. En particulier, on apprend que les connaissances préalables ainsi que les attitudes envers les mathématiques sont la source de certaines de ces difficultés. La présente recherche avait pour objectif de documenter les points de vue sur les mathématiques de ces participants afin d’en apprendre à propos de la relation qu’ils entretiennent avec cette matière. En nous inscrivant dans la perspective sociologique du rapport au savoir de Charlot (1997), nous avons cherché des éléments de réponse aux questions suivantes : quels sont les rapports aux mathématiques, anciens et actuels, d’étudiants du collégial ayant participé à un service d’aide individualisée en mathématiques? Qu’est-ce qui caractérise ces rapports du point de vue épistémique, identitaire et social? Pour y arriver, nous avons recueilli les bilans de savoirs de 26 étudiants de niveau collégial qui ont été soumis à une analyse par thèmes. De cette analyse de contenu, nous retenons que les participants s’exprimaient de façon diversifiée à propos du niveau de difficulté, du rapport affectif, des résultats obtenus, du niveau d’effort et de l’enseignement dans le cadre de leurs cours d’avant le cégep. Ensuite, les participants mentionnent que les cours de mathématiques du cégep sont beaucoup plus difficiles, que le rythme est plus rapide et que l’effort exigé est plus important qu’au secondaire. Aussi, nous avons constaté que pour les participants, les mathématiques (surtout celles du primaire) ont une utilité dans la vie quotidienne et dans le futur. Finalement, nous avons identifié différentes motivations à s’inscrire au service d’aide. La caractérisation des rapports aux mathématiques des participants et des dimensions épistémique, identitaire et sociale du rapport au savoir a été abordée à travers une discussion au sujet de l’utilité des mathématiques, de l’adhésion à l’enseignant/discipline et du travail à l’école. Il serait intéressant d’explorer les rapports aux mathématiques d’étudiants inscrits dans un programme réputé pour ces taux élevés d’échecs différences afin d’aborder la question des rapports au savoir propices à la réussite. De plus, nous croyons que l’utilisation de bilans de savoirs favoriserait le développement d’une sensibilité aux différents rapports aux mathématiques de la part des enseignants pouvant éventuellement mener à une diversification des interventions pédagogiques. Mots clés : rapport au savoir, mathématiques, niveau collégial, bilan de savoirs, aide à la réussite.

Cette étude propose d'évaluer la performance des fonds mutuels d'actions américaines gérés activement en tenant compte du bais de transactions intérimaires. Nous appliquons l'approche du facteur d'escompte stochastique à l'aide de modèles linéaires à facteurs en utilisant tant des données mensuelles que quotidiennes. Nous utilisons les trois modèles les plus populaires dans la littérature, soit le CAPM, le modèle de Fama-French et le modèle de Carhart, et les estimons avec deux ensembles d'actifs de base, soit les propres facteurs de ces modèles ou des portefeuilles passifs constitués de dix portefeuilles industriels et six portefeuilles de style. Le principal objectif est donc de comparer formellement la performance obtenue avec les mesures mensuelles traditionnelles à celles obtenues avec les mesures mensuelles capitalisées à partir de mesures quotidiennes, afin de mettre en évidence la présence du biais de transactions intérimaires dans l'évaluation de la performance. Nos résultats montrent que les mesures mensuelles tendent à attribuer plus de performance que leur équivalentes capitalisées. De plus, ils révèlent que la proportion de performances significativement négatives augmente lorsque les mesures capitalisées sont appliquées. Les transactions intérimaires ne semblent toutefois pas avoir un effet significatif sur la performance moyenne des fonds et son impact apparaît économiquement faible. Cependant, les résultats de l'analyse individuelle des fonds montrent qu'un nombre important de fonds voient leur performance révisée à la hausse ou à la baisse avec les mesures ajustées pour le biais. La proportion de fonds dont la performance est ajustée à la baisse est plus élevée que celle ajustée à la hausse. Mots clés : approche SDF, données quotidiennes, évaluation de la performance, fonds mutuels d'actions, modèles linéaires à facteurs, transactions intérimaires.

En prenant la Bosnie-Herzégovine (BiH) comme étude de cas, je propose dans cette thèse interdisciplinaire d'examiner comment les activistes mémoriels, agissant au niveau méso-institutionnel, utilisent les médias numériques et les outils technologiques pour mettre en œuvre diverses stratégies de contre-mémoire dans l'espace public. J'examine une variété de pratiques développées en marge des discours historiques officiels sur la guerre de 1992-1995, toujours dominés par la victimisation et la haine. Neuf cas tirés de la littérature et de données empiriques originales sont utilisés pour démontrer comment, malgré un climat politique extrêmement tendu, les activistes mémoriels de BiH arrivent à faire circuler de nouvelles représentations du passé avec pour objectif d'induire des changements mnémoniques dans la société bosnienne. Je m'attarde d'abord aux stratégies qu'ils mobilisent dans l'espace public en reprenant la catégorisation proposée par Trevisanut (2016) soit la re-membrance, la (ré-)appropriation et la polyphonie. Par la suite, je suggère que les activistes mémoriels en Bosnie-Herzégovine, bien qu'évoluant dans une sphère publique dominée par les divisions ethnonationalistes et un parallélisme politique exacerbé, arrivent à déployer ces stratégies en utilisant les médias numériques comme une arène, un espace ou une collection pour les récits contre-mémoriels qu'ils portent. Soutenue par une analyse thématique construite à partir de vingt-six entrevues avec des activistes mémoriels travaillant pour différentes organisations, la thèse qui suit répond à un besoin de nouvelles recherches sur l'activisme mémoriel médiatique et ouvre de nouvelles perspectives pour des études futures à l'intérieur d'autres zones post-conflit. / Taking Bosnia-Herzegovina as a case study, this thesis examines how memory activists, acting at the meso level, use digital media to implement various counter-memory strategies in relation to the war of 1992-1995. A variety of practices at the margins of official historical discourses, which are still dominated by victimization and hatred, are examined and examples from both the literature and original empirical data are used to show how, in an extremely tense political climate, memory activists can use diverse strategies and tools to allow new representations of the past to circulate, bringing about mnemonic change. I first focus on the strategies that they mobilize in the public space by taking up the categorization proposed by Trevisanut (2016) namely re-membrance, (re-)appropriation and polyphony. Subsequently, Then, I suggest that memory activists in Bosnia-Herzegovina, although evolving in a public sphere dominated by ethnonationalist divisions and exacerbated political parallelism, manage to deploy these strategies by using digital media as an arena, a space or a repository for counter-memory narratives. Supported by thematic analysis, this thesis responds to a need for contemporary empirical research on media memory activism and opens new perspectives for future interdisciplinary studies of these issues in other divided societies.

Ce projet de recherche porte sur l'étude du cas de la politique agroforestière en Bretagne. Malgré une politique agroforestière plus avancée, nous observons que la France rencontre des défis similaires au Québec et peine à développer plus largement les pratiques agroforestières sur son territoire. Notre objectif est d'identifier les forces et les limitations affectant l'efficacité des mesures prises pour promouvoir l'agroforesterie, en utilisant l'exemple de la région Bretagne en France. La Bretagne a été choisie en raison de son profil agricole, similaire à celui des principales régions agricoles au Québec. L'état du développement de l'agroforesterie a été étudié grâce à une revue de la littérature et une série d'entretiens avec des personnes activement impliquées dans le développement de l'agroforesterie en Bretagne. En Bretagne, le développement de l'agroforesterie est majoritairement dû à l'influence du plan national de développement de l'agroforesterie et du programme Breizh Bocage. Les résultats du programme Breizh Bocage sont mitigés, de nombreuses haies établies dans le cadre du programme sont laissées à l'abandon, les agriculteurs invoquant un manque de temps pour l'entretien. L'absence d'une obligation de participation obligatoire à la plantation contribue à leur détachement des haies, ainsi qu'à un manque de perspectives économiques pour l'utilisation du bois. De nombreux freins juridiques, entre autres liés aux financements européens, empêchent la réalisation de certaines actions. Cependant, la troisième campagne du programme, lancée pour la période 2023-2027, semble suivre une autre voie, davantage qualitative. Pour le plan national de développement de l'agroforesterie, le constat est relativement le même. Le manque de financement accordé aux structures responsables des actions à mener, ainsi que le manque de temps a grandement nui à la réussite des démarches entreprises. Le manque d'ouverture du plan aux acteurs locaux a diminué les possibilités de création de partenariat et l'établissement de projets. / This research project focuses on the case of agroforestry policy in Brittany. Despite a more advanced agroforestry policy, we observe that France faces similar challenges to Quebec and struggles to scale up the implementation of agroforestry practices on its territory. Our objective is to identify the strengths and limitations affecting the effectiveness of measures taken to promote agroforestry, using the example of the Brittany region in France. Brittany was chosen because of its agricultural profile, similar to that of the main agricultural regions in Quebec. The state of agroforestry development was studied through a literature review and a series of interviews with individuals actively involved in agroforestry development in Brittany. In Brittany, the development of agroforestry is mainly due to the influence of two programs: the national agroforestry development plan and the Breizh Bocage program. The outcomes of this program are mixed; many hedges established under the program are left abandoned, with farmers citing a lack of time for maintenance. The absence of a mandatory obligation to participate in planting contributes to their detachment from hedges, as well as a lack of economic prospects for wood use. Unfortunately, many legal barriers, among others, related to European funding, hinder the implementation of certain actions. However, the third campaign of the Breizh Bocage program launched for the period 2023-2027 seems to be taking a different, more qualitative approach. For the agroforestry development plan, the observation is relatively the same. The lack of funding allocated to the structures in charge of the actions to be carried out, as well as the lack of time, greatly harmed the success of the steps taken. The lack of openness of the plan or local actors diminished the possibilities of creating partnerships and establishing projects.

Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) und ihre zugehörigen (Cas) Proteine sind eine Reihe neuer Werkzeuge, die eine beispiellose Kontrolle über genetisches Material ermöglichen. Die meisten CRISPR-Cas-Systeme verwenden ein kurzes RNA-Molekül, das in ihre Struktur eingebunden ist, um sie zu einer spezifischen, komplementären DNA-Sequenz zu führen. Nach Erkennung der Komplementarität wird die DNA dann gespalten. Aufgrund der einfachen Reprogrammierbarkeit der Guide-RNA und ihrer hohen Spezifität für die Ziel-DNA-Sequenz haben diese Systeme ein enormes Potenzial in Bereichen wie Medizin, Landwirtschaft, Biotechnologie und Krankheitsforschung sowie in anderen Bereichen gezeigt und die Aufmerksamkeit von Wissenschaft und Industrie auf sich gezogen. Das gründliche Verständnis dieser Systeme ist entscheidend für ihre sichere Anwendung, insbesondere wenn man die ethischen Implikationen in Betracht zieht. In dieser Arbeit wurden komplexe Einzelmolekülexperimente unter Verwendung mehrerer hochmoderner Methoden eingesetzt, um einige bisher ungelöste Fragen bezüglich der Target-Suche und -spaltung dieser CRISPR-Cas-Systeme zu beantworten. • Direkte Beobachtung und Quantifizierung der Target-Suche durch den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Der Typ I-E CRISPR-Cas-Komplex Cascade ist ein Multiprotein-Komplex ohne inhärente Nukleaseaktivität, der doppelsträngige DNA bindet, indem er zuerst eine kurze Sequenz von zwei Nukleotiden namens Protospacer Adjacent Motif (PAM) erkennt und dann eine sogenannte R-Loop-Struktur mit dem benachbarten komplementären DNA-Strang bildet. Während der Prozess der R-Loop-Bildung vielfach untersucht wurde, bleibt der Mechanismus, wie Cascade bei potenziell sehr langen DNA-Sequenzen überhaupt zur richtigen Stelle gelangt unklar. Um Licht in diesen Prozess zu bringen, wurde ein kombiniertes Magnetpinzetten- und Fluoreszenzmikroskopie-Experiment etabliert, das die gleichzeitige Erfassung von DNA-Bindung und R-Loop-Bildung ermöglicht. Diese Experimente zeigten, dass Cascade für die Target-Suche einen Mechanismus namens Facilitated Diffusion verwendet. Dies bedeutet, dass Cascade nach einem dreidimensional Diffusionsprozess an einer zufälligen Stelle an DNA bindet und dann mit einem eindimensionalen Scannen um die Bindungsstelle beginnt. Wenn kein Target gefunden wird, wird der Prozess wiederholt. Bei einer nichterfolgreichen Suche dauert das eindimensionale Scannen etwa 150 ms und erstreckt sich über mehrere hundert potenzielle Targets. Das Verdrehen der DNA und damit das Anlegen von Supercoiling erleichtert oder behindert die R-Schleifen-Bildung, je nach Dreh-Richtung, und beeinflusst damit indirekt die Dauer der Suche. Die Experimente zeigten weiterhin, dass auch die Effizienz der Target-Suche, d.h. die Wahrscheinlichkeit, das richtige Ziel zu finden, sobald das eindimensionale Scannen begonnen hat, stark vom Supercoiling abhängt. Während Wahrscheinlichkeiten von über 40 % für negatives Supercoiling gefunden wurden, d.h. mit erleichterter R-Loop-Bildung, betrug sie in Abwesenheit von Supercoiling nur 5 %. • Entwicklung eines kinetischen Modells für den Such- und Erkennungsprozess für den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Als nächstes wurde ein kinetisches Modell entwickelt, das die Target-Suche als Random Walk auf DNA beschreibt, während dem sich der Cascade-Komplex von PAM zu PAM bewegt und die benachbarten Stellen auf Komplementarität prüft. Dieses Modell ermöglichte nicht nur Vorhersagen von Suchparametern wie Sucheffizienz und -dauer, sondern ermöglichte auch eine genaue Beschreibung der Erkennungswahrscheinlichkeiten, sobald das richtige PAM gefunden wurde. Es konnte herausgefunden werden, dass die Wahrscheinlichkeit, bei der Begegnung mit dem richtigen Ziel erfolgreich einen R-Loop zu bilden, gering ist, höchstwahrscheinlich um einen zu langen Aufenthalt an nur teilweise komplementären und damit falschen Targets zu verhindern. Das Modell sagt jedoch voraus, dass eine Stelle während eines eindimensionalen Scans bis zu 15 Mal besucht wird, um die geringe Erkennungswahrscheinlichkeit auszugleichen. Es wurde somit gezeigt, dass Target-Suche und -Erkennung in einem ausgefeilten Prozess eng miteinander verbunden sind, der die Zeit an falschen Targets minimiert aber dennoch eine schnelle Erkennung des richtigen Targets ermöglicht. • Untersuchung der Stabilität von CRISPR-Cas9 nach der Spaltung CRISPR-Cas9 ist ein einzelnes Protein, das doppelsträngige DNA in einem durch RNA gesteuerten Prozess ähnlich dem von Cascade anvisiert und bindet. Cas9 hat jedoch eine inhärente Nukleaseaktivität und spaltet die DNA nach der R-Loop-Bildung selbst. Dafür hat es zwei Nuklease-Domänen, die jeweils einen Strang der DNA spalten. Cas9 ist das derzeit am weitesten verbreitete Tool für Anwendungen in der Genomeditierung. Eine Erkenntnis, an dessen Erklärung weiterhin geforscht wird, ist, dass Cas9 auch nach der Spaltung für Stunden an sein DNA-Target gebunden bleibt, was es zu einem de-facto Single-Turnover-Enzym macht. Biologisch gesehen ist dies erstaunlich, da CRISPR-Cas-Systeme in einem engen Wettbewerb gegen ihre viralen Gegner stehen. Aus Anwendungssicht verbirgt und behindert Cas9 durch das lange Binden die zu bearbeitende DNA-Stelle vor den Reparatursystemen der Zellen. Für ein effizientes Gensystem ist es entscheidend, Möglichkeiten zu entwickeln, Cas9 kontrolliert von seinem Ziel zu entfernen. Dafür ist ein detailliertes Verständnis des Verhaltens von Cas9 nach der Reaktion erforderlich. Bisher wurde angenommen, dass Cas9 in eine einzelne, stabile post-Spaltungskonformation eintritt, deren Stabilität, insbesondere unter Einfluss von Torsion und Kraft, wie sie in der Zelle oft auftreten nicht gut untersucht ist. Unter Verwendung eines hochparallelen Magnetpinzetten-Experiments, das die gleichzeitige Beobachtung von bis zu Hunderten von DNA-Molekülen ermöglicht, wurde gezeigt, dass die post-Spaltungsstabilität von Cas9 und seinen mutierten Nickase-Varianten viel komplexer ist: Wenn der Non-Target- Strang (der Strang, der nicht an der R-Loop-Bildung beteiligt ist) gespalten wird, wie es bei Wildtyp-Cas9 und seiner Non-Target-Strang spaltenden Nickase-Variante der Fall ist, wird der gespaltene Non-Target-Strang über eine Drehbewegung um den anderen Strang herum unter Reibung freigesetzt. Auf diese Weise können diese Varianten hohe Torsionsspannungen aushalten und bleiben für Stunden an ihrem Ziel gebunden, was nachfolgende Zellreparaturmechanismen behindert. Für die Nickase-Variante, die nur den Target-Strang spaltet, kann der Non-Target-Strang bei ausreichend hohem Supercoiling-Niveau, wie es zum Beispiel während der Transkription in Zellen häufig vorkommt, nicht freigesetzt werden. Stattdessen kollabiert bei ausreichend hohen Supercoiling-Niveaus der R-Loop und die Cas9-Nickase dissoziiert von der DNA. Für diese Cas9-Variante deckten die Experimente mehrere verschiedene Stabilitätszustände mit Kollapszeiten von einigen Minuten bis hin zu Stunden auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nach der Spaltung hohe konformationelle Flexibilität mit komplexen Dynamiken zwischen verschiedenen Stabilitätszuständen gibt.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179 / Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated (Cas) proteins are new tools that allow unprecedented control over genetic material. Most CRISPR-Cas systems use a short RNA molecule incorporated into their structure to guide them to a specific, complementary sequence of DNA. Upon recognition of the complementarity, the DNA is then cleaved. Given the simple re-programmability of the guide RNA and high specificity for the targeted DNA sequence, these systems have shown immense potential in fields such as medicine, agriculture, biotechnology, and disease research, among others, and have attracted the attention of academia and industry. A thorough understanding of these systems on different scales is paramount to their safe usage, especially considering the ethical implications. In this work, complex single-molecule experiments combining several state-of-the-art methods were employed to shed light on some unresolved questions regarding target search and cleavage of these CRISPR-Cas systems. • Direct observation and quantification of the target search by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade The Type I-E CRISPR-Cas complex Cascade is a multi-protein complex without inherent nuclease activity that targets and binds double-stranded DNA by first detecting a short two-nucleotide long sequence called Protospacer Adjacent Motif (PAM) and then forming a so-called R-loop structure with the adjacent complementary DNA strand. While the process of R-loop formation has been studied extensively, the mechanism of how Cascade gets to the correct site in the first place - on potentially vast DNA sequences - remains unclear. To shed light on this process, a combined magnetic tweezers and fluorescence microscopy assay was established that allowed the simultaneous detection of DNA binding and R-loop formation. These experiments showed that Cascade employs a facilitated diffusion mechanism for target search. After a three-dimensional diffusion process, it randomly binds DNA and proceeds to one-dimensional scanning around the binding site. If no target is found, the process is repeated. If no target can be found, the one-dimensional scanning lasts approximately 150ms and spans several hundred potential targets. Twisting the DNA facilitates or hinders R-loop formation depending on the direction and thereby indirectly affects the duration. The experiments further showed that the efficiency of the target search, i.e., the probability of finding the correct target once a one-dimensional scanning event has started, also depends greatly on the level of supercoiling. While probabilities higher than 40% were found for negative supercoiling levels, i.e., with facilitated R-loop formation, it was as low as 5% in the absence of supercoiling. • Establishment of a kinetic model for the target search and recognition process employed by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Next, a kinetic model was developed, which described the target search as a random walk on DNA, during which the Cascade complex scans individual PAMs for adjacent targets. This model enabled predictions of target search parameters, such as search efficiency and duration, and also allowed the accurate description of target recognition probabilities once the correct PAM had been found under varying supercoiling levels. We found that upon encountering the correct target, the probability of successfully forming an R-loop is low, preventing stalling at only partially complementary sequences. However, our model predicts that the target site is revisited up to 15 times during one scanning process to compensate for the low recognition probability. It was thus shown that target search and recognition are tightly linked in a delicate process, minimizing time at off-targets while nonetheless enabling fast recognition. • Probing the stability of CRISPR-Cas9 after cleavage CRISPR-Cas9 is a single protein that targets and binds double-stranded DNA in an RNA-guided process similar to Cascade. In contrast to Cascade, Cas9 has inherent nuclease activity and cleaves the DNA upon R-loop formation. More specifically, Cas9 has two nuclease domains that each cleave one strand of the DNA. It is the currently most widely used tool for applications in genome editing. One finding that continues to puzzle researchers is that Cas9 stays bound to its DNA target for durations in the order of hours even after cleavage, making it a de facto single-turnover enzyme. From a biological standpoint, this is puzzling because CRISPR-Cas systems are in a tight arms race against their viral adversaries. From an application viewpoint, Cas9 conceals and obstructs the to-be-edited DNA site from the cells’ repair systems. For an efficient gene editing system, it is crucial to develop ways of removing Cas9 from its target in a controlled manner. For this, a detailed understanding of the post-reaction behavior of Cas9 is required. So far, Cas9 was believed to enter a single, stable post-cleavage conformation, the stability of which was not well understood, especially under the influence of force and twist. Employing a highly parallel magnetic tweezers experiment, allowing the simultaneous observation of up to hundreds of DNA molecules, the post-cleavage stability of Cas9 and its mutated nickase variants was shown to be much more complex: If the non-target strand (the strand not involved in the R-loop) is cleaved, as is the case for wild-type Cas9 and its non-target strand cleaving nickase variant, the cleaved non-target strand is released via a swiveling motion under friction. This way, these variants can release high torsional stress and stay bound to their target for hours, hindering subsequent cell repair machinery. The non-target strand cannot be released upon torsional stress for the nickase variant that only cleaves the target strand. Instead, if the supercoiling levels are high enough, as often applied in cells, for example during transcription, the R-loop collapses, and the Cas9 nickase dissociates from the DNA. We found several different stability states with collapse times of a few minutes up to hours. These results suggest high conformational flexibility after cleavage with complex dynamics between different stability states.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179