L’Hypertensions Artérielle Pulmonaire (HTAP) résulte de l’obstruction progressive des artères pulmonaires de petits calibres due à un remodelage de la paroi vasculaire ainsi qu’à une vasoconstriction. Cette thèse repose sur 3 piliers de la physiopathologie de l’HTAP : l’inflammation, l’épigénétique et la susceptibilité génétique de la maladie.Le premier projet démontre que les cellules dendritiques des patients atteints d’HTAP sont moins sensibles à l’action immunomodulatrice des glucocorticoïdes et orientent la réponse des lymphocytes T vers une réponse Th17, souvent impliquée dans les maladies autoimmunes.Le second projet a pour but de comparer le profil de méthylation des cellules endothéliales d’artères pulmonaires (CE-AP) de patients atteints d’HTAP comparé aux CE-AP de patients contrôles. Nous avons mis en évidence des clusters de gènes ayant un profil de méthylation différents entre les CE-HTAP comparé aux CE-CTR. Un gène différentiellement méthylé s’est dégagé durant l’étude bioinformatique : ABCA1 (ATP binding cassette 1). L’altération de son expression prédite par l’étude bioinformatique a été validée chez l’homme et le modèle de rat monocrotaline.Enfin, le dernier projet décrit la caractérisation d’un nouveau modèle animal de susceptibilité génétique à l’HTAP liée à des mutations dans le gène Bmpr2 chez le rat, au niveau hémodynamique, histologique, vasculaire, moléculaire et électrophysiologique. Nous avons démontré que ce modèle reproduit des schémas physiopathologiques pertinents vis-à-vis de la maladie humaine, ces résultats font de ce modèle un nouveau outil d’étude de la physiopathologie de l’HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by a progressive pulmonary arterial obstruction due to pulmonary vascular remodeling of distal arterioles as well as abnormal vasoconstriction. This project allowed to study three biological process clearly establish to be implicated in physiopathology of PAH.The first project demonstrated a dendritic cells dysfunction and a Th17 immune polarization of idiopathic PAH patients.The objective of the second project was to study the epigenetic variations in pulmonary endothelial cells (PEC) through a specific pattern of DNA methylation. We identified clusters of probes that discriminates controls and PAH patients. During bioinformatics study, ABCA1 (ATP binding cassette 1) gene was emphasized. Alteration of ABCA1 expression predicted during bioinformatics study has been validated in human and in monocrotaline rat model.The last project described the validation of a new PAH model by a hemodynamic, histological, vascular, molecular and electrophysiological characterization of heterozygous rat mutated to Bmpr2 gene. Whole functional and molecular dysregulation define this animal model like a useful tool in the study of BMPRII signaling alteration in PAH physiopathology.

Une augmentation de la concentration de l’angiotensine II (Ang II) contribue à la prolifération, la migration et l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) par l’activation des voies des mitogen-activated protein kinases (MAPK) et de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protéine kinase B (PKB/Akt). L’Ang II induit l’activation du facteur de transcription early growth response protein-1 (Egr-1) et sa suractivation est remarquée dans les lésions athérosclérotiques et les modèles animaux de lésions vasculaires. La régulation des facteurs de transcription est effectuée par des histones désacétylases (HDACs) qui désacétylent les lysines des histones et protéines non-histones. L’Ang II induit la phosphorylation et l’export nucléaire de la classe IIa des HDACs, particulièrement les HDAC5, et une augmentation de celles-ci est observée dans les maladies vasculaires. L’Ang II est un puissant activateur des voies des MAPK et de la PI3K/Akt, toutefois l’implication de ces voies dans la phosphorylation des HDAC5 et l’expression de l’Egr-1 dans les CMLVs reste inexplorée. Dans cette étude, l’Ang II a induit la phosphorylation des HDAC5 sur la sérine 498 dans les A10 CMLVs. Un blocage pharmacologique de l’extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) par U0126 n’a montré aucun effet significatif sur la phosphorylation et l’exclusion nucléaire des HDAC5 induite par l’Ang II. Par contre, l’inhibition de la voie PI3K par wortmannin, de l’Akt par SC66 ou le knockdown de l’Akt par des petits ARN interférents (siRNA) a atténué la phosphorylation et l’export nucléaire des HDAC5 induits par l’Ang II. Par ailleurs, l’inhibition de l’Akt ou le knockdown de cette kinase a diminué l’expression de l’Egr-1 induite dans les CMLVs stimulées par l’Ang II. L’inhibition des HDACs de la classe IIa par MC1568 ou TMP-195 ou bien le knockdown des HDAC5 a diminué l’expression de l’Egr-1 induite par l’Ang II. De plus, le blocage de l’export nucléaire des HDAC5 par la leptomycine B ou la KPT-330 a empêché la localisation cytoplasmique des HDAC5 et a atténué l’expression de l’Egr-1 en réponse à une stimulation de l’Ang II. L’hypertrophie vasculaire induite par l’Ang II a pu être inhibée par la suppression de l’HDAC5 et l’Egr-1. En conclusion, l’Ang II induit la phosphorylation et l’exclusion nucléaire des HDAC5 par la voie PI3K/Akt et non celle de ERK1/2; de plus, l’Ang II induit l’expression de l’Egr-1 à l’aide des HDAC5 via la voie Akt contribuant ainsi à l’hypertrophie des CMLVs. / Elevated concentration of angiotensin II (Ang II) contributes to vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation, migration and hypertrophy by the activation of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) and phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB/Akt) pathways. Ang II induced the expression of early growth response protein-1 (Egr-1), which is a transcription factor that is upregulated in atherosclerosis lesions and in animal models of vascular injuries. The activation or derepression of gene transcription is mediated by histone deacetylases (HDACs), which deacetylate lysine residues from histone and non-histones proteins. Ang II-induced the phosphorylation and nuclear export of class IIa HDACs, notably HDAC5, and its elevated activation is observed in vascular pathologies. Ang II is a potent activator of the MAPK and PI3K/Akt pathways, however their implication in the phosphorylation of HDAC5 and Egr-1 expression in VSMCs remain unexplored. In this study, Ang II-induced HDAC5 phosphorylation at serine 498 in A10 VSMCs and pharmacological blockade of the extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) by U0126 did not affect the phosphorylation and nuclear exclusion of HDAC5 in response to Ang II. Whereas, pharmacological inhibition of the PI3K by wortmannin, Akt by SC66 or small interfering RNA (siRNA)-induced silencing of Akt attenuated Ang II-induced HDAC5 phosphorylation and its nuclear export. Furthermore, inhibition or knockdown of Akt suppressed Ang II-induced Egr-1 expression. In addition, the inhibition of class IIa HDAC5 by MC1568, TMP-195 or HDAC5 knockdown by siRNA reduced Ang II-induced Egr-1 expression. The blockade of the nuclear export of HDAC5 by leptomycin B or KPT-330 prevented the cytoplasmic localization of HDAC5 and attenuated the expression of Egr-1 by Ang II in VSMCs. Moreover, HDAC5 or Egr-1 depletion prevented Ang II-induced cell hypertrophy. In summary, Ang II-induced HDAC5 phosphorylation and its nuclear export is mediated by the PI3K/Akt and not the ERK1/2 pathway, in addition, Ang II-induced Egr-1 expression involves the implication of HDAC5 via the Akt pathway which subsequently leads to VSMC hypertrophy.

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Le syndrome d'apnée obstructive du sommeil (SAOS), est une maladie chronique qui se caractérise par des interruptions répétées de la respiration durant le sommeil en raison de la fermeture temporaire des voies aériennes supérieures. L'hypoxie intermittente chronique (HI) résultante de cette fermeture transitoire des voies aériennes supérieures, constitue l’une des conséquences majeures du SAOS, et elle est la responsable de la plupart des complications liées à cette pathologie, dont nous citons: l’hypertension artérielle, l’infarctus de myocarde et plus généralement le remodelage cardiovasculaire.D’autre part, l’entrainement physique intensif(EI)est bien connu d’avoir des bénéfices sur le système cardiovasculaire, d’où nous avons poser l’hypothèse que l’EI peut inverser les effets délétères de l’HI sur la réactivité et le remodelage vasculaire ainsi que sur la signalisation calcique intracellulaire dans les cellules musculaires.Pour répondre à cette question, nous avons choisi le rat comme modèle animal, pour étudier l’effet potentiel de l'EI dans la prévention et l’inversion des effets délétères de (HI) en termes de réactivité et signalisation calcique dans les tissues musculaires.Des rats ont été exposés durant 21 jours à l’hypoxie intermittente dans des cages spécialement équipées pour maintenir un flux d’air alternant entre 21% et 5% de PO2 dans les cages contenant les rats hypoxique et a 21% de PO2 dans les cages contenant les rats contrôles. Durant les deux dernières semaines d’exposition à l’HI, un groupe des rats hypoxiques et un des rats normoxiques ont subi des sessions d'EI en courant sur un tapis roulant avec une vitesse allant de 16m/min jusqu'à 30 m/min.Les paramètres physiologiques ont été mesurés (Pression artérielle, fréquence cardiaque, hématocrites), l’aorte a été prélevé pour étudier la réactivité vasculaire, les cellules musculaires lisses de l’aorte ont été ensuite prélevés et cultivées pour étudier la signalisation calcique par microscopie à EPIfluorescence. Finalement les gènes codant pour les médiateurs de la signalisation calcique : RyR1, RyR2 RyR3, (ryanodine receptors), TRPV4 (transient receptor potential channel), SERCA1, SERCA2 (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+ -ATPase) et IP3R1 (Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor) dans différentes tissues vasculaires et squelettiques ont été étudiés au niveau moléculaire par Q-PCR et Western Blot.Nos résultats montrent que l'HI induit une augmentation significative de pression artérielle et de l’hématocrite et une diminution dans la relaxation de l'aorte induite par l'acétylcholine pré contractée par la phénylnephrine. Ceci est conforme à notre observation selon laquelle HI augmente le niveau de calcium intracellulaire dans le muscle lisse aortique cultivé. D'autre part, l'EI induit une diminution significative de l’hématocrite et de la vasoconstriction aortique induite par la phénylnephrine et l'endothélie-1, conformément à l'observation que l'EI réduit la différence HI-N dans la réponse calcique. A l’échelle moléculaire, HI induit une augmentation significative de l'expression de RyR1, RyR2, RyR3, SERCA1, SERCA2, TRPV4 et IP3R1 au niveau de l'ARNm dans les tissus de tous les groupes, avec une plus grande quantité de RyR1,RyR2,et RyR3 dans les tissus HI des muscles lisses (principalement dans l'aorte thoracique et abdominale) et le SERCA1 (9 fois plus haut dans les tissus IH) et le SERCA2 (10 fois plus élevé dans les tissus HI) dans les muscles squelette (Gastrocnemius, plantaris et soléus). De plus, HI induit une augmentation significative de RYR1, RYR2 et TRPV4 au niveau protéique dans l'aorte thoracique et abdominale; et l'EI réduit la différence d'expression entre les animaux N et IH.Nos résultats suggèrent que l'EI représente un traitement prometteur non pharmacologique ou complémentaire pour limiter les complications cardio-vasculaires induites par l’HI et le remodelage musculaire chez les patients atteints de SAOS. / Obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is a chronic disease characterized by repeated interruptions of breathing during sleep due to the temporary closure of the upper airway. Its prevalence increases with the increasing in prevalence of obesity, especially in developed countries.Chronic intermittent hypoxia (IH) resulting from this transient closure of the upper airway is one of the major consequences of OSAS and is responsible of most of the complications related to this pathology, including hypertension, myocardial infarction, atherosclerosis and more generally cardiovascular remodeling.On the other hand, intensive physical training(IT) is well known to have benefits on cardiovascular system, thus we hypothesize that physical training can reverse the deleterious effects of IH on reactivity and vascular remodeling as well as intracellular calcium signaling in muscle cells.To answer this question, we chose the rat as an animal model to study the potential effect of IT in the prevention and reversal of deleterious (IH) effects in terms of reactivity and calcium signaling in muscle tissue.Rats were exposed for 21 days to intermittent hypoxia and housed in cages specially equipped to maintain an airflow alternating between 21% and 5% PO2 in cages containing hypoxic rats and 21% PO2 in cages containing the control rats. During the last two weeks of exposure to IH, a group of hypoxic rats and one of the normoxic rats underwent IT sessions on a treadmill at a speed of 16m / min to 30m / min.Physiological parameters were measured (blood pressure, heart rate, hematocrit), the aorta was removed to study the vascular reactivity, then vascular smooth muscle cells were removed and cultured to study calcium signaling by EPIfluorescence microscopy. Finally, the genes coding for the key mediators of the calcium signaling: RyR1, RyR2 RyR3, (ryanodine receptors), TRPV4 (transient receptor potential channel), SERCA1, SERCA2 (Sarco / Endoplasmic Reticulum Ca2 + -ATPase) and IP3R1 , 5-Trisphosphate Receptor) in various vascular and skeletal tissues were studied at the molecular level as mRNA by Q-PCR or as protein by Western Blot.Our results show that IH induces a significant increase in blood pressure and hematocrit and a decrease in acetylcholine-induced aortic relaxation pre-contracted with phenylnephrine. This was consistent with our observation that HI increases the level of intracellular calcium in cultured aortic smooth muscle. On the other hand, IT induced a significant decrease in hematocrit and aortic vasoconstriction induced by phenylnephrine and endothelial-1, consistant with the observation that IT reduces the IH-N difference in the calcium response. On the molecular scale, IH induces a significant increase in the expression of RyR1, RyR2, RyR3, SERCA1, SERCA2, TRPV4 and IP3R1 at the mRNA level in the tissues of all groups with a greater amount of RyR1,RyR2,& RyR3 higher in IH tissue of smooth muscles (mainly in the thoracic and abdominal aorta) and SERCA1 (9-fold higher in IH tissues) and SERCA2 (10-fold higher in IH tissues) in the skeletal muscles (Gastrocnemius, plantaris and soléus). In addition, IH induces a significant increase in RYR1, RYR2 and TRPV4 at the protein level in the thoracic and abdominal aorta; And IT reduces the difference in expression between animals N and IH.Our results suggest that IT is a promising, non-pharmacological or complementary treatment for limiting cardiovascular complications induced by IH and muscle remodeling in patients with OSAS.

Au cours des dernières années, il est devenu évident que les sociétés des pays industrialisés sont à haut risque de maladies métaboliques. Une alimentation riche en énergie (lipide/glucide), combinée à une sédentarité accrue, est un facteur environnemental contribuant à l'augmentation de la prévalence de maladies reliées spécifiquement à des troubles endocriniens comme l'obésité et le diabète. Le traitement de ces désordres métaboliques doit donc passer par la connaissance et la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent ces désordres et le développement de traitements ciblés vers les facteurs responsables. Le tissu adipeux est une glande endocrine qui sécrète des substances, regroupées sous le terme d'adipokines, qui contrôlent l'homéostasie énergétique. L'augmentation de la masse adipeuse est responsable du développement de dérégulation hormonale qui mène à des dysfonctions physiologiques et métaboliques. Pour contrecarrer le développement démesuré du tissu adipeux, la signalisation insulinique ainsi que l’apport énergétique, responsables de la différenciation adipocytaire, doivent être inhibés. In vivo, la leptine, adipokine dont la concentration est corrélée à la masse adipeuse, présente des actions pro ou anti-insuliniques dans l’organisme pour réguler ce phénomène. Elle favorise l’effet inhibiteur de l’insuline sur la synthèse hépatique de glucose alors qu’elle s’oppose à son action sur l’expression des enzymes glucokinase et phosphoénol-pyruvate carboxykinase. La leptine influence aussi le taux circulant de triglycérides en diminuant sa concentration plasmatique. D'autre part, l'adiponectine, adipokine insulino- sensibilisante, voit sa sécrétion diminuée avec la prise de poids. La sensibilité à l'insuline est ainsi diminuée au fur et à mesure que le débalancement de ces deux adipokines s'accentue. La résistance à l'insuline s'installe alors pour s'opposer au stockage énergétique et à la prise illimitée de poids et la glycémie augmente. L'augmentation du glucose sanguin stimule la sécrétion d'insuline au niveau des cellules pancréatiques. C'est le diabète caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l'insuline. Le diabète, une des premières causes de mortalité dans le monde, est plus répandu sous sa forme non insulinodépendante (diabète de type 2, DT2) liée à l'obésité. Récemment, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateurs de l'expression d'une panoplie de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique. Parmi eux, les récepteurs des inducteurs de la prolifération des peroxysomes (PPAR, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Les PPAR ont été démontrés comme ayant un rôle central dans le contrôle de la transcription des gènes codants pour des protéines impliquées dans le métabolisme : les adipokines. PPARg, en plus de son implication dans le contrôle de l'homéostasie glucidique et lipidique, est reconnu comme étant un facteur de transcription pivot régulant l'adipogenèse du fait de son expression majeure dans le tissu adipeux. D'autre part, il est bien établi maintenant que l'obésité et le diabète sont des facteurs contribuant au développement du processus inflammatoire vasculaire caractéristique de l’athérosclérose. En effet, les cellules endothéliales et musculaires lisses, principales composantes de la média de l’artère, sont très sensibles aux altérations métaboliques. Une diminution de la sensibilité à l’insuline entraine une réduction de la disponibilité du glucose et l’utilisation des acides gras comme alternatif par ces cellules. Ceci induit l’accumulation des acides gras oxydés dans l’intima et leur filtration dans la média pour former un core lipidique. Bien que l’induction de la dysfonction endothéliale soit impliquée très précocement, certaines études pointent l’accumulation lipidique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et leur dysfonction comme déclencheurs de l’athérosclérose. Ce travail visait donc, dans un premier temps, à développer un modèle d'altérations métaboliques liées à la modulation de l'activité du tissu adipeux via une alimentation riche en lipides. Dans un second temps, cette étude tentait d'évaluer l’impact des adipocytes de souris sur les CML vasculaires et sur la modulation de leurs fonctions dans ce modèle d'altérations métaboliques et DT2 liés à l'alimentation et à l'obésité. Ainsi, par le biais de deux diètes pauvres en cholestérol à profil lipidique différent, nous avons développé un modèle murin présentant divers stades d'altérations du métabolisme allant jusqu'au DT2 en lien avec l'obésité chez les mâles et chez les femelles. D’autre part, des signes de cardiomyopathie ainsi qu’une modulation du taux des adipokines sont reliés à ces mêmes diètes. Parallèlement, l’activité de PPAR!2 est modulée chez les souris sous diètes enrichies en gras. Ensuite, nous avons démontré que les adipocytes, provenant de souris alimentées avec une diète enrichie en gras, modulaient la migration et la prolifération des CML comparativement au groupe contrôle. Ces modulations dépendaient en grande partie de la nature de la diète consommée, mais également du sexe de la souris. Par ailleurs, les altérations fonctionnelles des CML, couplées à des modulations géniques, sont associées aux changements du profil de sécrétion des adipokines mesurées chez les adipocytes. L’ensemble de ces travaux suggère une action directe de la nature de la stimulation du tissu adipeux blanc dans la modulation du profil de sécrétion des adipokines et l'induction du DT2 in vivo. Ces altérations de la physiologie adipocytaire se reflètent in vitro où le tissu adipeux contribue aux altérations physiopathologiques des CML liées au DT2. Ainsi, cette étude est l'une des premières à établir un lien direct entre les modulations adipocytaires et les effets de leurs sécrétions sur la physiologie des CML. Ces observations peuvent être exploitées cliniquement dans un développement futur d’outils thérapeutiques visant à prévenir et à traiter les troubles métaboliques et le DT2, en ciblant le tissu adipeux comme entité métabolique et endocrine. / Obesity is recognized as a risk factor to a variety of chronic diseases linked to the metabolic syndrome like atherosclerosis and type 2 diabetes (T2D), and is a major cause of increased risk of morbidity and mortality worldwide. High fat diets (HFD) coupled with sedentarity in the industrialized societies contribute to the raise of metabolic alterations prevalence specifically linked to endocrine troubles. Treatment of these latter should include the comprehension of the molecular mechanisms underlying these disorders in order to appropriately target factors responsible for the disease establishment. Adipose tissue is no longer considered as a passive organ which only stores lipids, but also works as an active gland that secretes several bioactive substances called adipokines. Among them, there are key factors known to play a pivotal role in the regulation of glucose and lipid homeostasis, lipid storage, adipogenesis. They are also recognized for their control of a wide range of cell type like adipocytes, hepatocytes and skeletal myocytes. Accumulation of adipose tissue in obesity, linked with the type as much as the amount of dietary lipids, is due to hyperplasia and hypertrophy of adipocytes. These changes are associated with modification in their secretion and inflammatory profile. To counteract excessive fat tissue development, insulin signalling known for its role in adipogenesis is inhibited. Thus, leptin is secreted by adipocytes to inhibit insulin action and the insulin sensitizer adipokine, adiponectin, is down regulated. The two factors are correlated to weight gain and their respective secretion profile is upregulated for leptin and down regulated for adiponectin. Insulin resistance is developed to prevent energetic storage and unlimited weight gain but glycemic control fails and glycaemia raises. Hyperglycaemia stimulates more insulin secretion, a characteristic of T2D linked to obesity. An estimated 80% of those who develop T2D are obese. Obesity induces important and complex changes, not only in glycemic homeostasis but also in the adipocytes. Following fatty acids (FA) stimulation, the main ligand-activated transcriptional factor that controls adipose tissue metabolism and adipokine secretion, peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARg), is activated. This nuclear receptor subtype regroups two isoforms: PPARg1, expressed in many tissues (adipose tissue, muscle, heart and liver) where it controls glucose and lipid homeostasis, and PPARg2, the adipocyte’s specific form, which further governs preadipocyte differentiation, up-regulation of genes involved in lipogenesis and the expression of adipokines. Recent advances showed that increased FA and glycaemia trigger vascular alterations that lead to atherosclerosis. In fact, endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC), the main arterial components, are sensitive to metabolic alterations. A lack in insulin sensitivity, leading to lower glucose availability, forces arterial cells to use FA as alternative energy source. Thus, in atheroprone regions susceptible to plaque formation, EC and SMC are subjected to metabolic modifications that lead to oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) accumulation in the intima and the progression of vascular disease. Many studies confirmed that the presence of SMC in the atherosclerotic plaque originates from the vascular wall but are showing a distinct phenotype. Even if the role of these cells in atherogenesis is not clear, trans-differentiation of SMC into foam cells has been reported in vitro. Thus, the present study aims at studying a HFD-induced obesity mouse model, developed to evaluate the impact of FA nature on the adipokine secretion profile of adipocytes. We also intended to determine gender-specific impact on modulation of metabolic disorders in response to those diets. On the other hand, we aim to determine the role of adipocytes in the development of obesity-linked atherosclerosis. For that, the second part of this study targeted the effect of adipocytes isolated from mice fed with HFD on SMC physiology. We focused our investigation on the effects of adipocytes regardless of the impact of other cell types in the adipose tissue. To reach our goal, we developed a HFD-fed mouse preparation demonstrating different stages of metabolic disorders leading to T2D. This model allowed us to generate adipocytes with different alteration status, reflected by the modulation of their adipokine secretion profile. Modifications in adipokine secretions were associated with PPAR!2 modulation. These results, reported in both genders, were delayed in female who expressed higher levels of estrogen receptor alpha (ER"). Then, the adipocytes were used to produce conditioned cultured media. To decipher the mechanistic contributions of HFD in adipokines modulation, the potential of adipocytes to induce SMC pathophysiologic disorders was evaluated in SMC stimulated by conditioned cultured media. This protocol enables the transposition of diet-induced fat cell modifications into extended alterations in the physiology of vascular SMC. These results strongly support pro-atherogenic effects of abdominal adipocytes on an important vascular component function through paracrine actions. Thus, adipocytes can be recognized as a link between the pathogenic potential of obesity and the impairments of SMC functions. A better understanding of the pathogenic effects of the adipose tissue on other tissues and organ systems might assist to develop better strategies in treating obesity- induced cardiovascular disease and metabolic syndrome.

L’athérosclérose est étroitement liée au diabète de type 2. De fortes concentrations plasmatiques en acides gras libres (AGL) et en insuline sont des caractéristiques retrouvées chez les patients souffrant de ces deux pathologies. Les AGL, présents dans notre alimentation, font partie de l’environnement auquel les cellules sont exposées. Leurs effets dépendent de leur nature, les acides gras saturés (AGS) étant néfastes et les acides gras monoinsaturés (AGMI) plus protecteurs. Ils ont donc des effets variés sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) impliquées dans la pathogénèse de l’athérosclérose. Ainsi, l’objectif principal de ce projet de maîtrise était d’évaluer l’impact de deux combinaisons d’AGL sur la viabilité des CMLV, en condition hyperinsulinémique ou non. Les deux combinaisons renfermaient les mêmes AGL mais en proportions différentes, l’une étant plus riche en AGS et l’autre en AGMI. Nos résultats ont montré que les combinaisons d’AGL ont un effet pro-apoptotique principalement dû aux AGS. L’acide oléique présent dans les combinaisons atténue cependant cet effet. Il diminue même plus fortement l’apoptose des CMLV lorsqu’associé à un AGS que lorsqu’utilisé seul. Cet impact est significatif uniquement dans certaines proportions de ces AGL et est plus efficace en présence d’insuline. Ces résultats mettent en lumière la présence d’une compétition entre mécanismes anti- et pro-apoptotiques en fonction des proportions d’AGS versus AGMI et de l’insulinémie chez les CMLV. Ils soulignent également l’importance de la présence des AGMI dans les diètes riches en AGS et pourraient être utiles pour l’élaboration de nouvelles diètes adaptées aux patients athérosclérotiques et diabétiques. / Atherosclerosis is closely linked to type 2 diabetes. High plasmatic concentrations of free fatty acids (FFA) and insulin are common features in patients suffering from both diseases. FFA, present in our diet, are part of the environment to which body cells are exposed. Their effects are dependent of their nature, being harmful for saturated fatty acids (SFA) and more protective for monounsaturated fatty acids (MUFA). They can have therefore various effects on vascular smooth muscle cells (VSMC) implicated throughout the development of atherosclerosis. Thus, this study aimed to assess the impact of two FFA combinations on VSMC viability, whether or not in a hyperinsulinemic condition. Both combinations contained the same FFA but in different proportions, one being richer in SFA and the other in MUFA. Our results showed that FFA combinations have a pro-apoptotic impact, mainly due to SFA. However, the presence of oleic acid in the combinations attenuated this effect. Furthermore, oleic acid had the capacity to reduce more strongly VSMC apoptosis when combined with a SFA than when used alone, although only under specific FFA ratios. This impact is even more effective in presence of insulin. These results highlight the presence of a competition between anti- and pro-apoptotic mechanisms dependent of FFA ratios (SFA vs. MUFA) and insulinemia to which are exposed VSMC. They also underline the importance of the presence of MUFA such as oleic acid in diets rich in SFA and could be useful for the development of new diets adapted to atherosclerotic and diabetic patients.

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par l'accumulation de cholestérol dans la paroi artérielle et associée à une réponse immunitaire anormale dans laquelle les macrophages jouent un rôle important. Récemment, il a été démontré que les vaisseaux lymphatiques jouent un rôle primordial dans le transport inverse du cholestérol (Martel et al. JCI 2013). L’objectif global de mon stage de maîtrise a été de mieux caractériser la dysfonction lymphatique associée à l’athérosclérose, en étudiant de plus près l’origine physiologique et temporelle de ce mauvais fonctionnement. Notre approche a été d’étudier, depuis l’initiation de l’athérosclérose jusqu’à la progression d’une lésion athérosclérotique tardive, la physiologie des deux constituants principaux qui forment les vaisseaux lymphatiques : les capillaires et collecteurs lymphatiques. En utilisant comme modèle principal des souris Ldlr-/-; hApoB100+/+, nous avons pu démontrer que la dysfonction lymphatique est présente avant même l’apparition de l’athérosclérose, et que cette dysfonction est principalement associée avec un défaut au niveau des vaisseaux collecteurs, limitant ainsi le transport de la lymphe des tissus périphériques vers le sang. De plus, nous avons démontré pour la première fois l’expression du récepteur au LDL par les cellules endothéliales lymphatiques. Nos travaux subséquents démontrent que ce défaut de propulsion de la lymphe pourrait être attribuable à l’absence du récepteur au LDL, et que la dysfonction lymphatique observée précocement dans l’athérosclérose peut être limitée par des injections systémiques de VEGF (vascular endothelial growth factor) –C. Ces résultats suggèrent que la caractérisation fonctionnelle de la capacité de pompage des vaisseaux collecteurs serait une condition préalable à la compréhension de l'interaction entre la fonction du système lymphatique et la progression de l'athérosclérose. Ultimement, nos travaux nous ont amené à considérer de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la prévention et le traitement de l’athérosclérose. / Atherosclerosis is driven by the accumulation of cholesterol in the arterial wall, which triggers an inappropriate immune response in which macrophages play an important role. It has now been shown that the lymphatic vessels play an important role in reverse cholesterol transport (Martel et al. JCI 2013). The overall objective of my Master internship was to better characterize lymphatic dysfunction associated with atherosclerosis, studying closely the physiological and temporal origin of this pathological feature. Our approach was to study, from the initiation of atherosclerosis to the progression of the atherosclerotic lesion, the physiology of the two main components that form the lymphatic vessels: the lymphatic capillaries and collectors. Using a mouse model that closely resembles human atherosclerosis (Ldlr-/-; hApoB100+/+) we have demonstrated that lymphatic dysfunction is present before the onset of atherosclerosis, and that this dysfunction is primarily associated with a defect in the collecting vessels, thereby limiting the lymph transport from peripheral tissues to the blood. In addition, we have clearly demonstrated, for the first time to our knowledge, the presence of the LDL receptor on lymphatic endothelial cells. Our subsequent work shows that this reduction in lymph flow could be due to the absence of the LDL receptor, and that lymphatic transport can be restored by systemic injections of VEGF (vascular endothelial growth factor) –C. These results suggest that the functional characterization of the pumping capacity of the collecting vessels would be a prerequisite for the understanding of the interactions between the function of the lymphatic system and the progression of atherosclerosis. Altogether, our work unveils new potential therapeutic targets for the prevention and treatment of atherosclerosis.

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN. / Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) kinases are the largest family of receptor tyrosine kinases. Their ligands, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs/EFNs are implicated in many biological processes. Hypertension is a chronic medical condition of high arterial blood pressure (BP). New hypertension therapeutic treatments are of great importance for public health. Until recently, there are only a few studies related to the role of EPHs/EFNs in vascular smooth muscle cell (VSMC) function. In our previous studies, we have found that EPHB6 and EFNB1 function in concert with sex hormones to regulate BP. In the present investigation, we found that different EPH/EFN family members can either positively or negatively regulate the VSMC contractility and BP: while EPHB4 and EFNB2 belong to the former category, EFNB1, EFNB3 and EPHB6, the latter. In vivo, male but not female smooth muscle-specific EPHB4 knockout (KO) mice presented decreased BP, compared to WT controls. VSMCs from EPHB4 KO mice in the presence of testosterone showed reduced contractility. EFNB2 is the major ligand of EPHB4. As expected, smooth muscle-specific EFNB2 KO mice had a similar although not identical BP phenotype as EPHB4 KO mice. Male but not female EFNB2 KO mice on regular or high-salt diet presented reduced BP, compared to WT counterparts. At the cellular level, the KO VSMCs showed reduced contractility compared to WT controls. In a human genetic study, we identified in the EFNB2 gene six SNPs that were significantly associated with hypertension risk in a sex-dependent way, corroborating our findings in mice. On the other hand, EFNB3 gene KO in female mice resulted in elevated BP and small artery resistance in vivo, enhanced small arterial contractility ex vivo, and augmented VSMC contractility in vitro. Male KO mice had normal BP, but castration led to significant BP elevation in KO but not in WT mice. VSMCs from female KO mice showed heightened MLC phosphorylation and reduced MLC kinase phosphorylation. This signaling change was mediated through an adaptor protein Grip1. Indeed, in a genome-wide association study by the International Consortium for Blood Pressure, an SNP in the GRIP1 gene approached the significant threshold p-value for its association with diastolic BP. Our research for the first time revealed that EPHs/EFNs are novel components in the BP regulation system. Members of the EPH/EFN family may act as Yin and Yang forces to finely tune the vessel tone for BP homeostasis and regulation. Such effects of EPHs/EFNs depend on sex and sex-hormone levels. Based on this new knowledge, we could develop novel personalized hypertension therapy using sex hormone antagonists or sex hormone replacement therapy, depending on the sex hormone levels of the patients and mutations in EPH/EFN genes.

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés aux rôles de l’hypoxie intermittente (HI) sur l’inflammation respiratoire. Dans un premier travail, nous avons caractérisé le profil inflammatoire des cellules épithéliales nasales humaines (CENH) en réponse à l’HI et mis en évidence une augmentation significative de la sécrétion d’IL-8, de PDGF AA, de VEGF et de gélatinases. L’IL-8 sécrétée était active comme en atteste le pouvoir chémotactique majeur des surnageants de CENH envers les neutrophiles. De plus, nous avons montré que l’HI per se était responsable d’une augmentation de la migration des neutrophiles et que l’addition d’IL-8 potentialisait cet effet, d’autant plus qu’elle agissait sur des neutrophiles de patients présentant un syndrome d’apnées/hypopnées du sommeil, déjà activés. Dans le second travail, nous avons mis en évidence une réponse spécifique des cellules musculaires lisses bronchiques à l’HI avec une sécrétion de VEGF et surtout une augmentation de leurs capacités de migration. De surcroît, nous avons montré que le surnageant des CENH soumises à l’HI induisait une augmentation majeure de ces capacités de migration, dépendant de la sécrétion de PDGFAA. Nos études montrent que l’HI induit une réponse inflammatoire des cellules résidentes de l’arbre trachéobronchique, cellules épithéliales et musculaires lisses. L’utilisation d’un modèle in vitro a permis d’isoler cette réponse tissulaire spécifique de l’influence d’une inflammation vasculaire et systémique. Ces résultats peuvent expliquer la neutrophilie observée dans les expectorations des apnéiques ainsi que les résultats fonctionnels respiratoires de ces patients / In present work, we addressed the role of Intermittent Hypoxia (IH) on respiratory inflammation. In a first study, we characterized the inflammatory profile of the human nasal epithelial cells (CENH) in response to IH and showed a significant increase of the IL-8, PDGF AA, VEGF and gelatinases secretion. The released IL-8 was active, as shown by the ability of supernatants to induce neutrophil migration. Furthermore, we showed that IH per se induced neutrophil migration and that IL-8 had an additive effect, especially on already activated neutrophils from patients suffering from sleep apnea/hypopnea syndrome (SAHS). In the second study, we showed a specific response of bronchial smooth muscle cells (BSMC) to IH with induction of VEGF secretion and an increase in migration capacities. In addition, supernatants of CENH exposed to IH induced a major increase of BSMC migration, dependent on PDGFAA secretion. Our studies show that IH leads to an inflammatory response of the resident tracheobronchial cells, both epithelial and smooth muscle cells. The use of an in vitro model allowed to isolate the specific tissular response from the influence of a vascular and systemic inflammation. These results can explain the neutrophilia observed in induced sputum of patients with SAHS, as well as the results of their pulmonary functional tests

L'objectif principal de ce travail était de comparer l'implication (i) de cellules vasculaires, cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et cellules endothéliales (CE), ou des cellules circulantes, les plaquettes, et (ii) des microparticules (MP) issues de ces différentes cellules dans la génération de la thrombine mais également dans son inhibition par les systèmes anticoagulants de la protéine C activée (PCa) et de l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), et d'identifier les mécanismes et les déterminants responsables des différences observées entre ces supports cellulaires pour la coagulation. Nous avons démontré que l'intégrine [alpha]v[gamma]3 qui est le récepteur pour la prothrombine sur les surfaces vasculaires était impliquée dans la génération de thrombine à la surface des CML soumises ou non à des déformations mécaniques cycliques. A l'état de base, les CML et les CE ont un potentiel thrombinique similaire, mais moins important que celui des plaquettes. Nous avons montré un rôle synergique du TFPI avec la PCa dans l'inhibition de la génération de thrombine à la surface de ces cellules plus importante avec les CML qu'avec les CE. L'ensemble de nos résultats suggère que les CML pourraient exercer des effets procoagulants comparables aux CE mais avec des régulations différentes en réponse aux facteurs pro- et anticoagulants, et que les MP issues de cellules vasculaires ont un pouvoir thrombogène très supérieur à leurs cellules d'origine / The main objective of this study was to compare the implication (i) of vascular cells, smooth muscle cells (SMC) and endothelial cells (EC), or circulating cells, platelets, and (ii) microparticles (MP) derived from these different cells in the generation of thrombin but also in its inhibition by the activated protein C (APC) and the tissue factor pathway inhibitor (TFPI), and to identify the mechanisms and determinants responsibles for observed differences between these different cell supports for coagulation. We have demonstrated that [alpha]v[gamma]3 integrin, the prothrombin receptor on the vascular surfaces, was involved in the generation of thrombin on the surface of these cells subjected or not subjected to cyclic mechanical deformations. At baseline, SMC and EC, have equivalent thrombin generating capacities, but less than that of platelets. We have shown a synergistic role of TFPI with APC in the inhibition of thrombin generation at the surface of these cells, more important with SMC than with EC. Taken together, our results suggest that SMC may exert procoagulant effects comparable to EC but with different regulations in response to pro-and anticoagulant factors, and that MP derived from vascular cells have a very higher thrombogenic activity compared to their parent cells