Les pathologies vasculaires représentent aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité mondiale et leur nombre ne cesse d’augmenter. Les greffons autologues (disponibilité faible) et les prothèses synthétiques inadaptées pour des vaisseaux de diamètre inférieur à 6 mm ne répondent pas à la demande et il existe aujourd’hui, un réel besoin en substitut vasculaire pour les petits vaisseaux. Ainsi, le concept de l’ingénierie vasculaire semble très prometteur. Cette approche est fondée sur l’utilisation de matrices « scaffold » associées à une composante cellulaire pour construire, dans des conditions environnementales adaptées, un vaisseau qui réponde et réagisse aux contraintes physiologiques. Dans cet objectif, la fonctionnalisation d’une media vasculaire constituée de cellules musculaires lisses (CML) est prérequise. Aux CML matures qui ne sont pas de bons candidats (perte de leur phénotype contractile lors de la culture), nous avons identifié les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la gelée de Wharton (tissu conjonctif du cordon ombilical) comme source cellulaire majeure. Leur facilité de récupération, leur présence en grand nombre, leur faible immunogénicité et leur capacité de prolifération et différenciation en font d’excellents candidats en ingénierie tissulaire. Dans ce travail nous avons déterminé les conditions favorables à l’obtention d’un phénotype CML fonctionnelles et montré l’impact de différents paramètres environnementaux (apport en oxygène, facteurs de croissance, teneur en sérum…) sur le comportement des CSM de la gelée de Wharton. Nous avons pu montrer que 1) ces cellules étaient capables de se différencier en cellules au phénotype contractile comparable à celui des CML matures. 2) L’utilisation des films multicouches de polyéléctrolytes (FMP) en tant que support d’adhérence cellulaire a montré que les CSM de la gelée de Wharton avaient un comportement spécifique selon la charge de surface conduisant vers une cultures tridimensionnelle inadaptée sur (PAH-PSS)3 PAH et en monocouche sur films (PAH-PSS)4, 3) Ces cellules pouvaient être cultivées sur des hydrogels d’alginate fonctionnalisés par les FMP pour fournir un feuillet cellulaire susceptible de recréer une media vasculaire. / Vascular diseases represent today one of the leading causes of global mortality and the number is increasing. Autologous transplants (limited availability) and synthetic prostheses unsuitable for vessels with a diameter less than 6 mm are not sufficient and there is now a real need of vascular substitute for small vessels. Thus, the concept of vascular engineering seems very promising. This approach is based on the use of "scaffold" associated with a cellular component to build in suitable environmental conditions, a vessel that reacts with the physiological constraints. To this aim, the functionalization of an incorporated media vascular smooth muscle cells (SMC) is a prerequisite. Insteag of using Mature CML which are not good candidates (loss of contractile phenotype in culture), we identified mesenchymal stem cells (MSCs) from Wharton's jelly (connective tissue of the umbilical cord) as a major cellular source. Their easiness of recovery, their presence in large numbers, their low immunogenicity, their proliferation and differentiation capacity make them excellent candidates for tissue engineering. In this work we determined the conditions for obtaining a functional CML phenotype and showed the impact of different environmental parameters (oxygen level, growth factors, serum content ...) on the behavior of CSM jelly Wharton. We have shown that: 1) these cells were able to differentiate into cells in contractile phenotype comparable to that of mature SMC. 2) The use of multilayer films of polyelectrolytes as cell adhesion support has shown that MSCs from the Wharton jelly had a specific behavior according to surface charge leading to an inappropriate three-dimensional cultures (PAHPSS)3-PAH and monolayer films on (PAH-PSS)4, 3) These cells could be grown on functionalized alginate hydrogels to provide a cellular sheet which may recreate a vascular media

L’ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) est une maladie neurologique pouvant être causée par la mutation de la protéine mitochondriale OPA1 (Optic atrophy type 1) et pouvant conduire à une cécité. Certains patients peuvent présenter un dysfonctionnement mitochondrial plus généralisé, et développer d'autres complications neuromusculaires (ADOA-1+). La protéine OPA1 est une dynamine GTPasique impliquée dans la dynamique mitochondriale en modulant la fusion des membranes internes, et plus largement dans le maintien des fonctions mitochondriales. Le rôle de cette protéine a été étudié dans beaucoup de types cellulaires, mais peu d’études se sont intéressées à la cellule cardiaque qui pourtant possède de nombreuses mitochondries.La 1ère question soulevée par cette thèse était de déterminer l’implication de la protéine OPA1 dans l’organisation du réseau mitochondrial et dans le fonctionnement de la cellule cardiaque en condition physiologique ou pathologique. Pour répondre à cela, nous avons utilisé un modèle murin hétérozygote pour Opa1 (Opa1+/-). Nous avons montré que dans le cardiomyocyte adulte, la diminution d’expression d’OPA1 induisait un déséquilibre de la balance fusion/fission, qui se traduisait par une désorganisation du réseau mitochondrial, ainsi qu’une altération de la morphologie des mitochondries. Cependant, ces modifications n’engendraient pas d’altération des capacités oxydatives des mitochondries, mais conduisaient à une perturbation des propriétés d’ouverture du PTP. En outre, la déficience en OPA1 n’influençait pas la fonction cardiaque en condition physiologique, mais était associée à son altération plus sévère en condition pathologique. La 2nde question de cette thèse était de savoir l’implication d’OPA1 dans la réponse à un stress physiologique des cellules musculaires squelettiques, et ainsi étudier le lien éventuel entre OPA1 et la mise en place de la biogénèse mitochondriale. Nous avons donc soumis nos souris Opa1+/- à un exercice d’endurance. Nos résultats ont révélé que nos deux groupes d’animaux disposaient des mêmes capacités physiques à l’entraînement. L’adaptation des souris Opa1+/- à l’entrainement s’effectuait par un remodelage métabolique, vraisemblablement pour contrer un défaut d’adaptation de la biogénèse mitochondriale. En conclusion, nos résultats ont permis de mieux définir le rôle de la protéine OPA1 dans les muscles striés et son implication dans l’adaptation à un stress. Ce travail nous ouvre des perspectives sur le rôle de la dynamique mitochondriale dans l’adaptation à un stress. / ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) is a neurological disease that can be caused by mutations in mitochondrial protein OPA1 (Optic atrophy type 1) and can lead to blindness. Some patients with OPA1 mutations may have a generalized mitochondrial dysfunction, and may develop additional neuromuscular complications (ADOA-1+). OPA1 protein is a GTPase dynamin involved in mitochondrial dynamics by controlling the fusion of inner membranes, and also in the maintenance of mitochondrial functions. The role of this protein has been studied in many cell types, but only few studies have been done on cardiac cell, which nevertheless has many mitochondria.The first question raised by this thesis was to determine the involvement of OPA1 protein in mitochondrial network organization and the functioning of the cardiac cell in physiological or pathological condition. To answer this, we used a mouse model heterozygous for Opa1 (Opa1+/-). We have shown that in adult cardiomyocytes, a decrease expression of OPA1 induces an imbalance fusion/fission, which results in a disruption of mitochondrial network, as well as alteration of the morphology of mitochondria. However, these changes did not alter oxidative capacities, but leads to a disturbance of PTP opening. Additionally, OPA1 deficiency did not affect cardiac function under physiological conditions, but it is associated with a stronger impairment of cardiac function in pathological condition.The 2nd part of this thesis was to determine the involvement of OPA1 in response to physiological stress in cells of skeletal muscle, and thus to study the possible link between OPA1 and mitochondrial biogenesis activation. For this, we submitted our Opa1+/- mice to an exercise training. Our results showed that both groups of animals were able to perform the same physical activity. The adaptation of Opa1+/- mice to training did not involve mitochondrial biogenesis and led to a specific response involving a metabolic remodelling towards higher fatty acids utilization.In conclusion, our results allowed us a better understanding of OPA1 role in striated muscle and its involvement for adaptation to a stress. This work opens new perspectives on the role of mitochondrial dynamics in cardiac and muscle cells and during adaptation to a stress

Le terme d’« hypertension artérielle pulmonaire » (HTAP) décrit une maladie vasculaire pulmonaire caractérisée par une augmentation progressive des pressions artérielles pulmonaires (PAP), définie par une PAP moyenne supérieure ou égale à 25 mmHg au repos et dont le principal symptôme est un essoufflement à l’effort. Un remodelage artériel pulmonaire intense conduisant à une obstruction des petits vaisseaux pulmonaires est responsable de la maladie. C’est une maladie rare mais néanmoins grave car pouvant aboutir à une insuffisance ventriculaire droite et entraîner le décès du patient.Le cadre général de notre étude est l’amélioration de la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’HTAP afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement au phénotype « pseudo-tumoral » des cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CML-AP) des patients atteints d’HTAP qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire pulmonaire de l’HTAP et qui présentent des caractéristiques communes avec les cellules cancéreuses, notamment une hyper-prolifération, une résistance à l’apoptose, des désordres métaboliques et une instabilité génomique. Etant donné que la protéine p53, un des plus importants suppresseurs de tumeur, est largement décrite comme inactivée dans la plupart des cancers, nous avons émis l’hypothèse qu’elle pourrait également jouer un rôle important dans le développement de l’HTAP. Les résultats des études in vitro menées sur des CML-AP de patients atteints d'HTAP idiopathiques (HTAPi) versus des sujets contrôles semblent indiquer que la protéine p53 n’est pas altérée dans les CML-AP HTAPi. En effet, la séquence codante du gène TP53 ne présente pas de mutation dans les CML-AP HTAPi, les expressions génique et protéique de p53 (et de certaines de ses protéines cibles) ne semblent pas être différentes entre contrôles et HTAPi, ni à l’état basal ni en réponse à différents stress cellulaires inducteurs de p53 (étoposide et H2O2). Cependant, la régulation de p53 semble altérée puisque nous avons observé une augmentation du taux protéique de MDM2, principal régulateur de p53, dans les CML-AP HTAPi. Ce résultat peut être considéré comme une des caractéristiques « pseudo-tumorales » des CML-AP HTAPi mais également être un élément déterminant du mécanisme d’action de la Nutlin-3a, qui a montré des effets anti-prolifératifs accrus dans les CML-AP HTAPi.Dans des études in vivo menées chez le rat, la protéine p53 semble jouer un rôle dans l’initiation de la pathogénèse d’une HTAP. En effet, les taux protéiques pulmonaires de p53, de sa cible p21 et de son régulateur (mais également cible transcriptionnelle) MDM2 sont diminués lors de la première semaine dans un modèle d’induction d’HTAP par mono-injection de monocrotaline (MCT) chez le rat, au cours duquel la pathologie se développe à partir de la 2ème semaine. De plus, l’administration quotidienne à des rats d’un inhibiteur de l’activité transcriptionnelle de p53, le pifithrin-α (PFT), conduit au développement d’une HTAP en 14 jours, au même titre qu’une mono-injection de MCT, et aggrave l’HTAP induite par la MCT. Des effets pro-prolifératifs et anti-apoptotiques du PFT révélés sur des CML-AP indiquent que l’inhibition de l’activité transcriptionnelle de p53 est à l'origine d'une prolifération exagéree et une résistance à l'apoptose, deux composantes clés dans le remaniement vasculaire pulmonaire et le développement de l'HTAP.En conclusion, ces résultats mettent en évidence l’implication de l’inactivation de la voie de p53 lors de la phase initiatrice du développement de l’HTAP, alors qu’aux stades tardifs et sévères de la maladie, il semble il y avoir une normalisation de p53. En revanche, l’augmentation de l’expression de son principal régulateur MDM2 observée dans les CML-AP de patients HTAP semble être une cible thérapeutique potentiellement intéressante. / Pulmonary artery hypertension (PAH) is a severe pulmonary vascular disease characterized by a progressive increase of the pulmonary arterial pressure (PAP), defined by a mean PAP greater than or equal to 25 mmHg at rest. The main symptom is a shortness of breath. An intense pulmonary arterial remodeling that leads to an obstruction of the small pulmonary vessels is responsible of the disease. PAH is a rare but severe disease that develops into right ventricular cardiac failure leading to the patient's death.The general framework of our study was to improve the understanding of the pathophysiology of PAH in order to identify new potential therapeutic targets and improve the clinical management of patients. In particular, we were interested in the “cancer-like phenotype” of PAH patient pulmonary arterial smooth muscle cells (PA-SMCs). PA-SMCs play a key role in the pulmonary vascular remodeling of PAH. These cells share characteristics with cancerous cells, such as: exaggerated proliferation, apoptosis resistance, metabolic disorders and genomic instability. Owing to the growth-suppressive and pro-apoptotic functions of p53 protein and its inactivation largely described in cancer, we hypothesized that the p53 pathway could also be altered during PAH development in PA-SMCs.The results of in vitro studies on PA-SMCs of late stage patients with idiopathic PAH (iPAH) versus control patients suggest that the p53 protein nor pathway is not altered in iPAH PA-SMCs. Indeed, the coding sequence of the TP53 gene presented no mutations in iPAH PA-SMCs. Analysis of mRNA and protein levels of p53 and its target proteins showed no difference between controls and iPAH PA-SMCs, neither in a basal state or in response to various cellular stresses such as etoposide and H2O2. However, regulation of p53 may be altered in iPAH PA-SMCs as we observed an increase of the MDM2 (the main p53 regulator) protein level compared to control. This last result may be considered as a “cancer-like” characteristic of iPAH PA-SMCs and also be a determining factor in the mechanism of action of Nutlin-3a, which had more important anti-proliferative effects in iPAH PA-SMCs than in control cells.In vivo studies in rats revealed, however, that the p53 pathway may play a role in the initiation stage of PAH pathogenesis. Indeed, kinetics evaluation of p53 lung expression in the PAH model, induced by a single injection of monocrotaline (MCT), revealed a decrease in the p53 protein level during the first week, followed by a normalization by the second week. PAH symptoms are developed in MCT rats after two weeks. Similarly, the protein levels of p21, a p53 target, and MDM2, the major p53 regulator, and also a transcriptional target of p53, decreased during the first week in the MCT-PAH model. In addition, daily treatment in rats with an inhibitor of p53 transcriptional activity, pifithrin-α (PFT), led to the development of PAH in 14 days, similarly to MCT, and worsened the PAH induced by MCT. Pro-apoptotic and anti-proliferative effects of PFT on PA-SMCs indicate that inhibition of p53 transcriptional activity causes an excessive proliferation and an apoptosis resistance, which are two key components of the pulmonary vascular remodeling and development of human and experimental PAH.In conclusion, these results demonstrate the involvement of the p53 pathway inactivation in the initiation stage of PAH development, whereas in late and severe stages of disease, its role seems to be less implicated. In contrast, the increased expression of MDM2 observed in PA-SMCs of PAH patients may be a potential therapeutic target.

La caractérisation des mécanismes moléculaires exacts de la signalisation de l'insuline est très importante pour comprendre, traiter et prévenir le diabète de type 2. Le deacetylase SIRT1 est une protéine récemment découverte qui est impliquée dans la régulation métabolique, comme dans la sécrétion de l'insuline et l'homéostasie glucidique. Un des activateurs de SIRT1, le resvératrol, a des effets bénéfiques sur la santé, dont une amélioration de la sensibilité à l'insuline et une durée de vie prolongée. Cependant, l'interaction exacte entre la signalisation de l'insuline, SIRT1 et le resvératrol n'est pas connue. Par conséquent j'ai étudié au cours de ma thèse l'impact du resvératrol et de SIRT1 sur la voie de signalisation de l'insuline, principalement dans des cellules musculaires mais aussi in vivo dans le modèle expérimentale du nématode C.elegans. J'ai pu montrer que le resvératrol est un inhibiteur class IA-spécifique de la PI3K. Le resveratrol inhibe aussi l'installation d'une insulino-résistance, peut-être par l'inhibition des protéines kinases comme JNK, diminuant ainsi la phosphorylation en sérine des IRS. Nous montrons aussi que SIRT1 intensifie la signalisation de l'insuline, probablement par l'interaction avec le complexe IRS-PI3K. L'interaction de SIR-2.1, l'homologue de SIRT1, avec la PI3K joue aussi un rôle important dans la régulation de la durée de vie de C.elegans / Characterisation of the exact molecular mechanisms of insulin signalling is of great importance in understanding, treating and preventing type 2 diabetes. The recently discovered deacetylase SIRT1 is implicated in several metabolic regulation mechanisms, including insulin secretion and glucose homeostasis. The SIRT1 activator resveratrol also has beneficial metabolic effects, including improved insulin sensitivity and prolonged lifespan. However, the exact interplay of insulin signalling, SIRT1 and resveratrol is not known. I have therefore studied the impact of resveratrol and SIRT1 on the insulin signalling pathway, mainly in muscle cells, but also in the living model C.elegans. This work has allowed me to show that resveratrol is an isoform-specific PI3K inhibitor. Resveratrol also inhibited instalment of insulin resistance, possible through inhibition of kinases like JNK thereby reducing the IRS serine phosphorylation. We also showed that SIRT1 potentiates insulin signalling, probably through interaction with IRS-PI3K. The interaction with SIR-2.1, the SIRT1 homolog, is important also in PI3K-mediated lifespan regulation in C.elegans

Au cours des dernières années, il est devenu évident que les sociétés des pays industrialisés sont à haut risque de maladies métaboliques. Une alimentation riche en énergie (lipide/glucide), combinée à une sédentarité accrue, est un facteur environnemental contribuant à l'augmentation de la prévalence de maladies reliées spécifiquement à des troubles endocriniens comme l'obésité et le diabète. Le traitement de ces désordres métaboliques doit donc passer par la connaissance et la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent ces désordres et le développement de traitements ciblés vers les facteurs responsables. Le tissu adipeux est une glande endocrine qui sécrète des substances, regroupées sous le terme d'adipokines, qui contrôlent l'homéostasie énergétique. L'augmentation de la masse adipeuse est responsable du développement de dérégulation hormonale qui mène à des dysfonctions physiologiques et métaboliques. Pour contrecarrer le développement démesuré du tissu adipeux, la signalisation insulinique ainsi que l’apport énergétique, responsables de la différenciation adipocytaire, doivent être inhibés. In vivo, la leptine, adipokine dont la concentration est corrélée à la masse adipeuse, présente des actions pro ou anti-insuliniques dans l’organisme pour réguler ce phénomène. Elle favorise l’effet inhibiteur de l’insuline sur la synthèse hépatique de glucose alors qu’elle s’oppose à son action sur l’expression des enzymes glucokinase et phosphoénol-pyruvate carboxykinase. La leptine influence aussi le taux circulant de triglycérides en diminuant sa concentration plasmatique. D'autre part, l'adiponectine, adipokine insulino- sensibilisante, voit sa sécrétion diminuée avec la prise de poids. La sensibilité à l'insuline est ainsi diminuée au fur et à mesure que le débalancement de ces deux adipokines s'accentue. La résistance à l'insuline s'installe alors pour s'opposer au stockage énergétique et à la prise illimitée de poids et la glycémie augmente. L'augmentation du glucose sanguin stimule la sécrétion d'insuline au niveau des cellules pancréatiques. C'est le diabète caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l'insuline. Le diabète, une des premières causes de mortalité dans le monde, est plus répandu sous sa forme non insulinodépendante (diabète de type 2, DT2) liée à l'obésité. Récemment, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateurs de l'expression d'une panoplie de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique. Parmi eux, les récepteurs des inducteurs de la prolifération des peroxysomes (PPAR, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Les PPAR ont été démontrés comme ayant un rôle central dans le contrôle de la transcription des gènes codants pour des protéines impliquées dans le métabolisme : les adipokines. PPARg, en plus de son implication dans le contrôle de l'homéostasie glucidique et lipidique, est reconnu comme étant un facteur de transcription pivot régulant l'adipogenèse du fait de son expression majeure dans le tissu adipeux. D'autre part, il est bien établi maintenant que l'obésité et le diabète sont des facteurs contribuant au développement du processus inflammatoire vasculaire caractéristique de l’athérosclérose. En effet, les cellules endothéliales et musculaires lisses, principales composantes de la média de l’artère, sont très sensibles aux altérations métaboliques. Une diminution de la sensibilité à l’insuline entraine une réduction de la disponibilité du glucose et l’utilisation des acides gras comme alternatif par ces cellules. Ceci induit l’accumulation des acides gras oxydés dans l’intima et leur filtration dans la média pour former un core lipidique. Bien que l’induction de la dysfonction endothéliale soit impliquée très précocement, certaines études pointent l’accumulation lipidique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et leur dysfonction comme déclencheurs de l’athérosclérose. Ce travail visait donc, dans un premier temps, à développer un modèle d'altérations métaboliques liées à la modulation de l'activité du tissu adipeux via une alimentation riche en lipides. Dans un second temps, cette étude tentait d'évaluer l’impact des adipocytes de souris sur les CML vasculaires et sur la modulation de leurs fonctions dans ce modèle d'altérations métaboliques et DT2 liés à l'alimentation et à l'obésité. Ainsi, par le biais de deux diètes pauvres en cholestérol à profil lipidique différent, nous avons développé un modèle murin présentant divers stades d'altérations du métabolisme allant jusqu'au DT2 en lien avec l'obésité chez les mâles et chez les femelles. D’autre part, des signes de cardiomyopathie ainsi qu’une modulation du taux des adipokines sont reliés à ces mêmes diètes. Parallèlement, l’activité de PPAR!2 est modulée chez les souris sous diètes enrichies en gras. Ensuite, nous avons démontré que les adipocytes, provenant de souris alimentées avec une diète enrichie en gras, modulaient la migration et la prolifération des CML comparativement au groupe contrôle. Ces modulations dépendaient en grande partie de la nature de la diète consommée, mais également du sexe de la souris. Par ailleurs, les altérations fonctionnelles des CML, couplées à des modulations géniques, sont associées aux changements du profil de sécrétion des adipokines mesurées chez les adipocytes. L’ensemble de ces travaux suggère une action directe de la nature de la stimulation du tissu adipeux blanc dans la modulation du profil de sécrétion des adipokines et l'induction du DT2 in vivo. Ces altérations de la physiologie adipocytaire se reflètent in vitro où le tissu adipeux contribue aux altérations physiopathologiques des CML liées au DT2. Ainsi, cette étude est l'une des premières à établir un lien direct entre les modulations adipocytaires et les effets de leurs sécrétions sur la physiologie des CML. Ces observations peuvent être exploitées cliniquement dans un développement futur d’outils thérapeutiques visant à prévenir et à traiter les troubles métaboliques et le DT2, en ciblant le tissu adipeux comme entité métabolique et endocrine. / Obesity is recognized as a risk factor to a variety of chronic diseases linked to the metabolic syndrome like atherosclerosis and type 2 diabetes (T2D), and is a major cause of increased risk of morbidity and mortality worldwide. High fat diets (HFD) coupled with sedentarity in the industrialized societies contribute to the raise of metabolic alterations prevalence specifically linked to endocrine troubles. Treatment of these latter should include the comprehension of the molecular mechanisms underlying these disorders in order to appropriately target factors responsible for the disease establishment. Adipose tissue is no longer considered as a passive organ which only stores lipids, but also works as an active gland that secretes several bioactive substances called adipokines. Among them, there are key factors known to play a pivotal role in the regulation of glucose and lipid homeostasis, lipid storage, adipogenesis. They are also recognized for their control of a wide range of cell type like adipocytes, hepatocytes and skeletal myocytes. Accumulation of adipose tissue in obesity, linked with the type as much as the amount of dietary lipids, is due to hyperplasia and hypertrophy of adipocytes. These changes are associated with modification in their secretion and inflammatory profile. To counteract excessive fat tissue development, insulin signalling known for its role in adipogenesis is inhibited. Thus, leptin is secreted by adipocytes to inhibit insulin action and the insulin sensitizer adipokine, adiponectin, is down regulated. The two factors are correlated to weight gain and their respective secretion profile is upregulated for leptin and down regulated for adiponectin. Insulin resistance is developed to prevent energetic storage and unlimited weight gain but glycemic control fails and glycaemia raises. Hyperglycaemia stimulates more insulin secretion, a characteristic of T2D linked to obesity. An estimated 80% of those who develop T2D are obese. Obesity induces important and complex changes, not only in glycemic homeostasis but also in the adipocytes. Following fatty acids (FA) stimulation, the main ligand-activated transcriptional factor that controls adipose tissue metabolism and adipokine secretion, peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARg), is activated. This nuclear receptor subtype regroups two isoforms: PPARg1, expressed in many tissues (adipose tissue, muscle, heart and liver) where it controls glucose and lipid homeostasis, and PPARg2, the adipocyte’s specific form, which further governs preadipocyte differentiation, up-regulation of genes involved in lipogenesis and the expression of adipokines. Recent advances showed that increased FA and glycaemia trigger vascular alterations that lead to atherosclerosis. In fact, endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC), the main arterial components, are sensitive to metabolic alterations. A lack in insulin sensitivity, leading to lower glucose availability, forces arterial cells to use FA as alternative energy source. Thus, in atheroprone regions susceptible to plaque formation, EC and SMC are subjected to metabolic modifications that lead to oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) accumulation in the intima and the progression of vascular disease. Many studies confirmed that the presence of SMC in the atherosclerotic plaque originates from the vascular wall but are showing a distinct phenotype. Even if the role of these cells in atherogenesis is not clear, trans-differentiation of SMC into foam cells has been reported in vitro. Thus, the present study aims at studying a HFD-induced obesity mouse model, developed to evaluate the impact of FA nature on the adipokine secretion profile of adipocytes. We also intended to determine gender-specific impact on modulation of metabolic disorders in response to those diets. On the other hand, we aim to determine the role of adipocytes in the development of obesity-linked atherosclerosis. For that, the second part of this study targeted the effect of adipocytes isolated from mice fed with HFD on SMC physiology. We focused our investigation on the effects of adipocytes regardless of the impact of other cell types in the adipose tissue. To reach our goal, we developed a HFD-fed mouse preparation demonstrating different stages of metabolic disorders leading to T2D. This model allowed us to generate adipocytes with different alteration status, reflected by the modulation of their adipokine secretion profile. Modifications in adipokine secretions were associated with PPAR!2 modulation. These results, reported in both genders, were delayed in female who expressed higher levels of estrogen receptor alpha (ER"). Then, the adipocytes were used to produce conditioned cultured media. To decipher the mechanistic contributions of HFD in adipokines modulation, the potential of adipocytes to induce SMC pathophysiologic disorders was evaluated in SMC stimulated by conditioned cultured media. This protocol enables the transposition of diet-induced fat cell modifications into extended alterations in the physiology of vascular SMC. These results strongly support pro-atherogenic effects of abdominal adipocytes on an important vascular component function through paracrine actions. Thus, adipocytes can be recognized as a link between the pathogenic potential of obesity and the impairments of SMC functions. A better understanding of the pathogenic effects of the adipose tissue on other tissues and organ systems might assist to develop better strategies in treating obesity- induced cardiovascular disease and metabolic syndrome.

L’athérosclérose est étroitement liée au diabète de type 2. De fortes concentrations plasmatiques en acides gras libres (AGL) et en insuline sont des caractéristiques retrouvées chez les patients souffrant de ces deux pathologies. Les AGL, présents dans notre alimentation, font partie de l’environnement auquel les cellules sont exposées. Leurs effets dépendent de leur nature, les acides gras saturés (AGS) étant néfastes et les acides gras monoinsaturés (AGMI) plus protecteurs. Ils ont donc des effets variés sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) impliquées dans la pathogénèse de l’athérosclérose. Ainsi, l’objectif principal de ce projet de maîtrise était d’évaluer l’impact de deux combinaisons d’AGL sur la viabilité des CMLV, en condition hyperinsulinémique ou non. Les deux combinaisons renfermaient les mêmes AGL mais en proportions différentes, l’une étant plus riche en AGS et l’autre en AGMI. Nos résultats ont montré que les combinaisons d’AGL ont un effet pro-apoptotique principalement dû aux AGS. L’acide oléique présent dans les combinaisons atténue cependant cet effet. Il diminue même plus fortement l’apoptose des CMLV lorsqu’associé à un AGS que lorsqu’utilisé seul. Cet impact est significatif uniquement dans certaines proportions de ces AGL et est plus efficace en présence d’insuline. Ces résultats mettent en lumière la présence d’une compétition entre mécanismes anti- et pro-apoptotiques en fonction des proportions d’AGS versus AGMI et de l’insulinémie chez les CMLV. Ils soulignent également l’importance de la présence des AGMI dans les diètes riches en AGS et pourraient être utiles pour l’élaboration de nouvelles diètes adaptées aux patients athérosclérotiques et diabétiques. / Atherosclerosis is closely linked to type 2 diabetes. High plasmatic concentrations of free fatty acids (FFA) and insulin are common features in patients suffering from both diseases. FFA, present in our diet, are part of the environment to which body cells are exposed. Their effects are dependent of their nature, being harmful for saturated fatty acids (SFA) and more protective for monounsaturated fatty acids (MUFA). They can have therefore various effects on vascular smooth muscle cells (VSMC) implicated throughout the development of atherosclerosis. Thus, this study aimed to assess the impact of two FFA combinations on VSMC viability, whether or not in a hyperinsulinemic condition. Both combinations contained the same FFA but in different proportions, one being richer in SFA and the other in MUFA. Our results showed that FFA combinations have a pro-apoptotic impact, mainly due to SFA. However, the presence of oleic acid in the combinations attenuated this effect. Furthermore, oleic acid had the capacity to reduce more strongly VSMC apoptosis when combined with a SFA than when used alone, although only under specific FFA ratios. This impact is even more effective in presence of insulin. These results highlight the presence of a competition between anti- and pro-apoptotic mechanisms dependent of FFA ratios (SFA vs. MUFA) and insulinemia to which are exposed VSMC. They also underline the importance of the presence of MUFA such as oleic acid in diets rich in SFA and could be useful for the development of new diets adapted to atherosclerotic and diabetic patients.

L’ovaire est un organe indispensable à la fonction reproductive, car il permet la production, la maturation et la libération de la cellule germinale femelle, l’ovocyte. Malgré son rôle central dans la régulation de la reproduction chez la femme, plusieurs de ses processus physiologiques et de ses conditions pathologiques sont encore imparfaitement décrits. La caractérisation du rôle de nouveaux régulateurs pourrait permettre l’élucidation de plusieurs questionnements actuels en physiologie ovarienne. Initialement étudiée dans l’organogenèse et l’oncogenèse pour son implication dans la prolifération, la migration, la différenciation et l’apoptose cellulaire, la voie de signalisation Hippo pourrait s’avérer être un facteur déterminant dans la physiologie ovarienne. En effet, elle a été récemment rapportée comme participant à la régulation de l’activation folliculaire, de la prolifération des cellules de la granulosa et de l’ovulation. La voie Hippo consiste en une cascade de kinases menant ultimement à la phosphorylation des deux co-régulateurs transcriptionnels YAP1 (yes-associated protein 1) et TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif). L’objectif général de ce projet de thèse était de caractériser les rôles de Yap1/Taz dans la physiologie ovarienne en utilisant des modèles murins transgéniques d’inactivation conditionnelle de ces gènes dans les cellules de la granulosa. La première portion du projet a conduit à la caractérisation d’un phénotype inattendu de défaut des oviductes. Les souris femelles adultes étaient sous-fertiles et leur fonction ovarienne était intacte. En fait, la sous-fertilité était causée par le piégeage des embryons dans des dilatations de la paroi de l’oviducte, empêchant ainsi leur transport adéquat vers l’utérus. Nous sommes parvenus à démontrer que la perte d’expression de YAP1/TAZ dans les couches musculeuses de l’oviducte conduisait à un amincissement progressif de sa paroi et était ultimement responsable de l’échec du transport embryonnaire. Dans la seconde portion du projet, nous avons utilisé la culture primaire de cellules de la granulosa afin de décrire l’implication de la voie Hippo dans l’ovulation. Nous avons identifié la protéine kinase A comme modulateur clé de l’activation de la voie Hippo par l’hormone lutéinisante (LH). En utilisant un système adénoviral de délétion de Yap1/Taz, nous avons mis en évidence l’importance de leur expression pour l’induction de plusieurs gènes cibles de la LH. Ensuite, au moyen d’une expérience d’immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré l’implication de YAP1 dans la régulation de la transcription de l’amphiréguline, un effecteur central de la cascade de signalisation de la LH. Dans son ensemble, ce projet a permis de mettre la lumière sur de nouveaux rôles de la voie de signalisation Hippo dans la régulation des cellules musculaires lisses de l’oviducte et des cellules de la granulosa durant l’ovulation chez la souris. Elles ouvrent la voie à une investigation plus précise de l’implication de la voie Hippo dans ces deux organes clés du système reproducteur femelle. / The ovary is a central organ of the female reproductive tract involved in oocyte production, maturation and release. Still, many physiological and pathological ovarian processes remain to be described more comprehensively. The precise characterization of the roles of new ovarian regulators would contribute to a better understanding of its physiology. The Hippo signaling pathway was initially studied for its roles in cellular proliferation, apoptosis, migration and differentiation during organ and tumor development. Recently, it has been shown to be involved during normal physiological processes of multiple organs, including the ovary. Hippo was shown to be involved in the activation of primordial follicles, in the proliferation of granulosa cells and during ovulation. Hippo consists of a central kinase cascade leading to the phosphorylation of YAP1 (yes-associated protein 1) and TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif), the two transcriptional coactivators of the pathway. The objective of this thesis was to characterize the precise roles of Yap1/Taz in ovarian physiology using transgenic mouse models of their genetic deletion in granulosa cells. The first part of this thesis project led to the characterization of an unexpected oviductal phenotype. Adult females were subfertile and their ovarian function was unaffected. The subfertility was rather caused by the entrapment of embryos in oviductal dilations, preventing their normal transport to the uterus. We demonstrated that loss of YAP1/TAZ expression in oviductal smooth muscle cells led to a gradual thinning of the oviductal wall and was responsible for the embryo transport impediment. In the second part of this project, we cultured primary mouse granulosa cells to characterize the roles of the Hippo signaling pathway during ovulation. We showed that protein kinase A is a key effector of Hippo activation following the luteinizing hormone (LH) surge. We then demonstrated that Yap1/Taz expression is required for the induction of several LH target genes. Using a chromatin immunoprecipitation experiment, we were able to show that YAP1 drives the expression of amphiregulin, a key paracrine transmitter of the LH signal, during the early events of ovulation. Together, these results identified new roles of the Hippo signaling pathway in the regulation of oviductal smooth muscle cells and of granulosa cells during ovulation. This thesis project opens the door to new avenues of investigation of Hippo involvement in the regulation of the female reproductive system.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l’Université de Montréal / Les canaux ioniques présents dans la membrane des cellules musculaires lisses vasculaires, et surtout des cellules retrouvées au niveau des artères de résistance, jouent des rôles prépondérants dans le contrôle du potentiel membranaire et de la contractilité vasculaire. Nos deux études ont porté sur l) les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux potassiques (K+) et 2) les propriétés fonctionnelles des canaux perméables au chlore (Cl') dans la régulation de l'activité électromécanique des cellules artérielles. Dans la première partie de cette thèse, nous décrivons le mécanisme de l'interaction entre la 4-aminopyridine et un courant K+ sortant à rectification retardée (Kdr) dans des cellules d'artères coronaires de conductance de lapin. Parmi les multiples canaux K identifies au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires, Kdr joue un rôle majeur dans le maintien du potentiel membranaire de repos entre -70 et -40 mV. La 4-aminopyridine (4- AP) est un inhibiteur relativement spécifique du canal Kdr et a été utilisée abondamment pour caractériser ses propriétés biophysiques et son rôle physiologique. Malgré son usage répandu, on ne connaît pas la nature de l'interaction entre la 4-AP et le canal Kdr concernant les canaux Kdr, nous estimons que le canal Kdr coronaire est possiblement un hétéro-multimère de plusieurs sous-unités fonctionnelles a et modulatrices P. Le but de notre deuxième étude a été d'évaluer le rôle des canaux Cl' dans la contraction vasculaire induite par la stimulation des récepteurs αi-adrénergiques, et de mesurer l'influence de changements de la pression transmurale sur cette réponse. Malgré l'importance des canaux calciques de type L (CaL) dans la contraction vasculaire, des études récentes suggèrent que deux canaux perméables au Cl' dépendants du Ca2+ intracellulaire (CICa) ou sensibles aux changements de volume (Clvol) sont impliqués, respectivement, dans la dépolarisation et contraction engendrées par certains agonistes vasoconstricteurs ou lors d'une élévation de la pression transmurale ("réponse myogénique"), propriété à laquelle on attribue un rôle important dans les mécanismes d'autorégulation dans plusieurs lits vasculaires. En condition isobarique, nous avons évalué le rôle des canaux Cl' dans les réponses αi-adrénergique (stimulée par la phényléphrine - PE) et myogénique des artérioles (70 -100 pm diamètre interne) mésentériques de lapin. Nos observations nous ont permis de tirer les conclusions suivantes. i) La PE cause une vasoconstriction liée à l'activation des canaux CICaet CaL. ii) L'acide niflumique (NfA) ou le 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS) ne modifie pas la contraction induite par l'activation des canaux CaL. iii) La dilatation induite par l'inhibition de dca par la NfA est dépendante de la pression pour des concentrations faibles et modérées (0.5 à 1 µM) de l'agoniste PE. iv) L'étirement de la paroi causée par une hausse de la pression transmurale active possiblement un courant sensible au DIDS qui "masque" en partie la vasoconstriction induite par la PE attribuée à l'activité des canaux CICa. v) La dépolarisation induite par la PE est renversée complètement par la NfA. vi) Le courant sensible au DIDS contribue à la réponse myogénique. Ces travaux mettent donc en évidence l'importance physiologique des canaux Cl' dans la dépolarisation et la contraction de la microcirculation mésentérique associées à la stimulation par le système nerveux autonome sympathique dans des conditions normales de pression transmurale.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS. / CENP-B is a highly conserved, centromere associated protein and is a major autoantigen in systemic sclerosis (SSc). Anti-CENP-B autoantibodies are associated with prominent vascular manifestations such as pulmonary arterial hypertension (PAH) in the limited cutaneous subset of SSc. PAH occurs as a consequence of progressive obliteration of small arteries due to vascular smooth muscle cell dysfunction, migration and proliferation. However, the factors driving this obliteration are unknown. Earlier in vitro studies have demonstrated that some autoantigens have an additional role when they are released in the extracellular environment during the course of injurious insults resulting in cell death. Indeed, it was previously suggested that extracellular autoantigens participate in normal wound repair processes by acting like cytokines and/or chemokines and subsequently displaying pathogenic activities that contribute to the development of autoimmune diseases. Our present findings suggest that the nuclear autoantigen CENP-B can be added to this set of bifunctional molecules. The present study clearly indicates that exogenous CENP-B bound specifically to the surface of human pulmonary artery SMCs. Binding of CENP-B to SMC stimulated their migration during in vitro wound healing assays, as well as their secretion of interleukins 6 and 8. The mechanism by which CENP-B mediated these effects involved the focal adhesion kinase, Src, ERK1/2, and p38 MAPK pathways. Moreover, CENP-B released from apoptotic endothelial cells was found to bind to SMC, thus indicating a plausible in vivo source of extracellular CENP-B. Here, we also report several lines of evidence indicating that CENP-B, which has no obvious primary or secondary structural homology to chemokines, induced SMC activation by interacting with CCR3. Moreover, the present study clearly demonstrates the involvement of EGFR in CENP-B signaling leading to IL-8 secretion. Finally, anti-CENP-B autoantibodies were found to abolish this signaling pathway, thus preventing CENP-B from transactivating EGFR and exerting its cytokine-like activities toward vascular SMCs. The present study sheds new light on the possible role of extracellular CENP-B and its potent biological effects on human pulmonary artery SMCs. The identification of CENP-B as a CCR3 ligand opens up new perspectives for the study of the pathogenic role of anti-CENP-B autoantibodies.

Nous avons précédemment montré que les cellules musculaires lisses vasculaires(CMLV) des rats spontanément hypertendus (SHR) présentent une expression augmentée des protéines G inhibitrices (Gi) et une prolifération cellulaire accrue par rapport aux CMLV des rats Wystar-Kyoto (WKY). Le niveau d'AMPc s’est également avéré plus faible dans les CMLV de SHR. La présente étude a donc été entreprise afin d'examiner la contribution de la diminution du niveau intracellulaire d'AMPc à l’augmentation de l'expression des protéines Gi et à la prolifération accrue des CMLV de SHR et de continuer à explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents responsables de cette réponse. Les CMLV de SHR ont montré par rapport aux CMLV des WKY une expression accrue de Giα-2 et Giα-3 qui a été diminué d'une manière dépendante de concentration par le dbcAMP, un analogue d'AMPc perméable à la membrane cellulaire. En outre, les fonctions augmentées des protéines Gi comme démontrées par l'amplification de l’inhibition de l'adénylate cyclase par les hormones inhibitrices et l'activité forskoline (FSK)-stimulée de l’adénylate cyclase par une faible concentration de GTPγS dans les CMLV de SHR ont également été restaurées aux niveaux de WKY par le dbcAMP. La prolifération accrue des CMLV de SHR a également été atténuée par le dbcAMP et la forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase. De plus, dbcAMP a restauré la production augmentée d'anion superoxyde (O2-), l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression accrue des protéines Nox 4 et p47phox observée dans les CMLV de SHR jusqu’au niveau contrôle. Par ailleurs, la phosphorylation accrue des PDGF-R, EGF-R, c-Src et ERK1/2 énoncée par les CMLV de SHR a également été diminuée par le dbcAMP d'une manière dépendante de concentration. Ces résultats suggèrent que le niveau réduit d'AMPc intracellulaire montré par les CMLV de SHR contribue à l'expression accrue des protéines Gi et à l’hyperprolifération cellulaire à travers l’augmentation du stress oxydatif, la transactivation des EGF-R, PDGF-R et la voie de signalisation des MAP kinases. / We have previously shown that vascular smooth muscle cells (VSMC) from spontaneously hypertensive rats (SHR) exhibit enhanced expression of inhibitory G proteins (Gi) and enhanced cell proliferation as compared to VSMC from Wystar-Kyoto rats (WKY). The levels of cAMP were shown to be decreased in VSMC from SHR. The present study was therefore undertaken to examine the contribution of the decreased intracellular level of cAMP in the enhanced expression of Gi proteins and increased proliferation of VSMC from SHR and to further explore the underlying molecular mechanisms responsible for this response. VSMC from SHR showed an enhanced expression of Giα-2 and Giα-3 as compared to VSMC from WKY which was decreased in a dose-dependent manner by dbcAMP, a cell-permeable cAMP analog. In addition, the enhanced functions of Gi proteins as demonstrated by enhanced inhibition of adenylyl cyclase by inhibitory hormones and forskolin (FSK)-stimulated adenylyl cyclase activity by low concentration of GTPγS in VSMC from SHR were also restored to the WKY levels by dbcAMP. The enhanced proliferation of VSMC exhibited by SHR was also attenuated by dbcAMP and forskolin, an activator of adenylyl cyclase. In addition, dbcAMP also restored the increased production of superoxide anion (O2-), NAD(P)H oxidase activity and enhanced expression of Nox 4 and p47phox proteins observed in VSMC from SHR to control levels. Furthermore, the increased phosphorylation of PDGF-R, EGF-R, c-Src and ERK1/2 exhibited by VSMC from SHR were also decreased by dbcAMP in a dose-dependent manner. These results suggest that decreased levels of intracellular cAMP exhibited by VSMC from SHR contributes to the enhanced expression of Gi proteins and hyperproliferation through increasing oxidative stress and transactivation of EGF-R, PDGF-R and MAP kinase signaling pathway.