La mégakaryopoïèse est un processus complexe, qui prend naissance à partir des cellules souches hématopoïétiques (HSC). Ces dernières se différencient par étapes successives en mégakaryocytes (MKs) qui, suite à leur maturation, libèrent les plaquettes. Afin de modéliser le sort des HSCs lors de la mégakaryopoïèse en culture, un nouveau modèle mathématique a été développé, basé sur un programme de différenciation tridimensionnelle (3-D) où chaque sous-population est représentée par un compartiment. Dans le but d’évaluer la prolifération, la différenciation des MKs immatures puis matures, la cinétique de mort cellulaire ainsi que le nombre de plaquettes produites, à partir des cellules de sang de cordon (CB) ombilical enrichies en CD34+, un ensemble d'équations différentielles a été déployé. Les cellules CD34+ ont été placées en culture dans un milieu optimisé pour la différenciation mégakaryocytaire. Les paramètres cinétiques ont été estimés pour deux températures d'incubation (37°C versus 39°C). Les résultats des régressions ont été validés par l'évaluation de l'estimabilité des paramètres, en utilisant des analyses de sensibilité locale et globale, puis la détermination d'un intervalle de confiance. Ceux-ci ont été comparés par le biais de tests statistiques et d’analyses en composante principale (ACP). Le modèle proposé pourrait permettre de mieux comprendre les phénomènes complexes observés. Les MKs sont uniques parmi les cellules hématopoïétiques, étant les seules à devenir polyploïdes au cours de leur développement par l’entremise de l’endomitose, un processus mitotique qui se termine prématurément durant la cytocinèse. Pour obtenir une image plus complète et exhaustive de la mégacaryopoïèse, une approche d’imagerie cellulaire à grand champ et à long terme a été développée permettant de suivre individuellement l'évolution des HSCs lors de leur différenciation ex vivo. Cela a permis de démontrer que les MKs polyploïdes sont encore capables de se diviser et de produire des cellules filles polyploïdes, et que ce processus est plus fréquent chez les MKs issues de CB que de moelle osseuse d'adulte. De plus, le processus de formation des proplaquettes semble également réversible. Les phénomènes énoncés plus haut étaient inversement proportionnels au niveau de ploïdie des MKs. En conclusion, cette étude a dévoilé de nouvelles propriétés jusqu’ici inconnues des MKs. / Megakaryopoiesis is a complex process, which is initiated with the proliferation and the differentiation of hematopoietic stem cells (HSC) into megakaryocytes (MK), followed by the maturation of MK and ended by platelet release. To describe the fates of HSC during ex vivo megakaryopoiesis, a new mathematical model was developed based on a 3-dimensional kinetic developmental program. To address this, a set of differential equations was applied to analyze the proliferation, differentiation and death kinetic rates of purified cord blood (CB)-CD34+ cells, immature and mature MKs, as well as platelet number and productivity. CB-CD34+ cells were placed in culture optimized for MK differentiation. The kinetic parameters were estimated for two incubation temperatures (37°C vs. 39°C). The regression results have been validated by assessing the parameter identifiability using local and global sensitivity analyses and confidence intervals, and compared using statistical tests and principal component analysis (PCA). Furthermore, PCA was applied on the solution matrix to construct a simplified MK differentiation pathway model, and to reveal dependencies among the model parameters. The proposed model provides insight into phenomena that would be otherwise difficult to interpret. MKs are unique among mammalian marrow cells as they polyploidize during their natural development. It is universally accepted that MK becomes polyploid by repeatedly deviating from normal cell cycling, where it ceases to complete cytokinesis and divide. To challenge this long-standing hypothesis and to obtain a more comprehensive picture of megakaryopoiesis, a long-term and large-field live cell imaging approach of in vitro MK culture was developed. Using CB- and bone marrow (BM)-CD34+ as starting cells, the direct observation of cells undergoing differentiation and maturation over a 5-day culture period is reported for the first time. Herein, direct visual proof that polyploid MKs can complete cytokinesis during its normal development is presented. This phenomenon was found not restricted to CB- as the BM-derived polyploid MK also underwent division. However the latter showed significantly lower proliferation rate. This new finding explains in part the unresolved issue of low ploidy levels observed in CB-MK and contests the notion that polyploid MKs do not divide.

La transplantation cellulaire apparaît aujourd'hui comme une thérapie prometteuse pour certaines formes graves d'insuffisance cardiaque réfractaire aux traitements classiques. Nous avons tenté dans ce travail d'améliorer la thérapie cellulaire en agissant sur deux paramètres : la perte et la survie des cellules. Dans une première étape, nous avons comparé les effets de deux méthodes de couverture épicardique des cellules via des biomatériaux cellularisés (feuilles de cellules et une matrice de gélatine) par rapport à ceux des injections conventionnelles dans le myocarde. Nous avons choisi de transplanter des cellules souches musculaires pour une étude de preuve de concept. Une amélioration de la fonction contractile au bout de 1 mois associée à une amélioration de la rétention cellulaire, une augmentation du nombre de vaisseaux sanguins et une diminution du pourcentage de la fibrose ont été enregistrées dans les groupes de biomatériaux cellularisés par rapport au groupe des injections de cellules. Nous avons tenté de confirmer les bénéfices de la couverture épicardique avec un autre type cellulaire. Nous avons choisi d'utiliser des cellules souches stromales d'origine adipeuse (ADSC pour Adipose Derived Stroma/Stem Cells). Toutefois, et malgré les bénéfices fonctionnels apportés lors des greffes, les feuilles d'ADSC étaient difficilement maniables lors de la chirurgie. De plus, les ADSC ont été incapables de générer de nouveaux cardiomyocytes s'intégrant électriquement et mécaniquement dans le tissu receveur. L'objectif de " régénération " myocardique requiert l'apport de cellules ayant un potentiel de différenciation cardiaque et devrait donc pouvoir être atteint avec des cellules souches embryonnaires (CSE). Nous avons choisi de travailler avec ce type cellulaire en raison de la possibilité de dériver, à partir de ces cellules, de véritables progéniteurs des cardiomyocytes. Pour limiter les conditions hypoxiques de l'environnement ischémique, nous avons co-transplanté les progéniteurs cardiaques dérivés des CSE humaines avec des ADSC afin d'en exploiter les propriétés trophiques, et d'optimiser ainsi la survie du greffon. Les deux populations cellulaires ont été transférées sur le myocarde infarci via, une matrice de gélatine (GELFILM™) qui représente de meilleures propriétés mécaniques. Lors de cette étude, nous avons remarqué une préservation contre le remodelage ventriculaire à court (1mois) et long (6mois) terme chez les animaux greffés avec les patchs co-ensemencés par rapport aux animaux recevant le patch seul et l'étude des patchs composites a montré la présence de cellules humaines in vitro mais pas in vivo, probablement à cause d'une maîtrise insuffisante du rejet. Notre travail a donc consisté en une analyse systématique de plusieurs paramètres fondamentaux de thérapie cellulaire (méthode de transfert des cellules, limitation des conditions de mort cellulaire après greffes, choix du type cellulaire). Les résultats obtenus valident l'emploi des matrices cellularisées déposées sur l'épicarde. Il convient maintenant d'optimiser la nature du biomatériau, les conditions de culture des progéniteurs cardiaques avec des cellules trophiques dans le but d'améliorer la survie du greffon.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a group of diseases characterized by avascular obstruction leading to a progressive increase of the resistances in the pulmonary blood flow. The recent progress in the understanding of mechanisms at the origin of this disease underlines the role of extrapulmonary cells, such as circulating stem cells and bone marrow-derived progenitor cells in vascular remodeling and in PAH development. In this thesis we have shown implication of the progenitor cells and chemotactic axis in the vascular remodeling in human and experimental PAH. This work could help to develop new therapies allowing more specific and more effective treatments leading to improved survival of PAH patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les lymphocytes Th17 forment une population de cellules T CD4+ pro-inflammatoires, impliqués non seulement dans l'élimination d'agents pathogènes, mais ayant aussi un rôle délétère dans l'induction de maladies inflammatoires chroniques. Ils expriment spécifiquement le récepteur de chimiokines CCR6, qui a pour ligand le CCL20 mais aussi les β-defensine-1, 2 et 3, peptides ayant une activité antimicrobienne. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) représentent une population cellulaire hétérogène exerçant diverses propriétés immunomodulatrices.Les résultats obtenus dans ce travail de thèse montrent que l'environnement inflammatoire contribue à augmenter l'adhésion des lymphocytes Th17 aux CSMs, et qu'elle est régulée par l'interaction du CCR6 avec ses ligands ; que les CSMs exercent, en partie via la sécrétion de PGE2, des effets anti-inflammatoires en faisant acquérir un phénotype régulateur aux lymphocytes Th17 différenciés, soulignant ainsi la plasticité de ces derniers.De plus, nous avons montré que les lymphocytes Th17 activés par l'antigène produisent du CCL20 et induisent, via la production de l'IL-17 et de l'IL-22, la sécrétion d'hBD-2, mais pas celle des hBD-1 et 3, par des kératinocytes épidermiques humains et de la peau reconstituée; que le CCL20, ainsi que la hBD-2, induisent l'arrêt de ces cellules sur l'endothélium enflammé in vitro en conditions de cisaillement. Finalement, l'activation spécifique d'antigène des lymphocytes Th17 entraîne une perte de l'expression de CCR6, ce qui provoque ainsi un état transitoire de non réponse à une nouvelle stimulation de ces cellules avec les ligands de CCR6, permettant leur migration ultérieure hors du tissu enflammé. / Th17 cells form a population CD4+ T cells with strong pro-inflammatory properties that are not only involved in the clearance of pathogens, but also play a deleterious role of in the pathogenesis of inflammatory disease. Th17 cells specifically express CCR6, a chemokine receptor that binds to its unique chemokine ligand, CCL20, as well as to human β-defensin (hBD)-1, 2 and 3, peptides with anti-microbial activity. Mesenchymal stem cells (MSC) represent a heterogenous population that exert broad immunomodulatory effects.The results from the studies carried out during this thesis show that the inflammatory environment contributes to increased adhesion of Th17 cells to MSCs, which is mediated via the interaction of CCR6 with its ligands, and that MSCs exert, in part via the secretion of PGE2, anti-inflammatory effects through the induction of a T regulatory cell phenotype in fully differentiated tissue-infiltrating Th17 cells, thereby underscoring the plasticity of the latter cells.Furthermore, the results show that antigen-activated Th17 cells produce CCL20 and induce, via the production of both IL-17 and IL-22, the secretion of hBD-2, but not 1 and 3, by normal human epidermal keratinocytes and reconstituted skin, and that CCL20, as well as hBD-2, induce arrest of these cells onto inflamed endothelium in vitro under conditions of shear stress. Finally, antigen-specific activation of Th17 cells also causes a loss of CCR6 expression from their cell surface and thus results in a transitory state of non-responsiveness to further stimulation of these cells with CCR6 ligands, which is likely to permit their subsequent migration out of inflamed tissue.

Introduction : les lésions médullaires sont sources de déficits et souvent de handicap majeur. Afin de limiter les conséquences de ces traumatismes la recherche scientifique expérimente des stratégies thérapeutiques visant à  réduire la lésion et à   régénérer le tissu nerveux. Malheureusement la neuroprotection seule n'a jusqu'à  présent pu démontrer de réel bénéfice clinique et actuellement de nombreux espoirs reposent sur la neurorégénération via les thérapies cellulaires. Dans cet esprit nous avons développé et validé un modèle lésionnel chez le rat puis réalisé dans la lésion des greffes de cellules progénitrices embryonnaires humaines afin de promouvoir la régénération du tissu nerveux. Matériel et méthode : nous avons développé chez le rat un modèle de compression médullaire par inflation d'un ballonnet dans l'espace épidural en région thoracique (T9). Les animaux lésés présentent initialement une paraplégie sensitivo-motrice complète suivi d'une faible récupération neurologique spontanée (10%) à J7. Grâce à  ce modèle nous avons étudié les stratégies de régénération du tissu par la transplantation in situ dans la moelle lésée de cellules progénitrices. Des greffes de cellules progénitrices neurales embryonnaires ont ainsi été réalisées en région lésée ainsi que dans les métamères sus et sous jacents. Les cellules souches provenant d'embryons humains étaient préalablement transduites in vitro pour exprimer la Neurogénine 2. La Neurogénine 2 est un facteur neurotrophique permettant d'influencer la différenciation cellulaire en neurones.Résultats : le modèle de compression développé est fiable et reproductible. La validation pharmaceutique réalisée par l'administration d'une molécule neuroprotectrice: un antagoniste des récepteurs à  NMDA (Gacyclidine), confirme d'une part sa pertinence pour l'évaluation de stratégies thérapeutiques et d'autre part que l'excitotoxicité est un élément majeur des processus physiopathologiques survenant dans la phase secondaire de la lésion. Sur un suivi de 35 jours, les animaux greffés avec des cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2 présentent une récupération motrice significative. Cette récupération est corrélée à  la restauration partielle des fibres sérotoninergiques et de la localisation membranaire de leur récepteur en sous lésionnel. Les groupes contrôles et greffés uniquement avec des cellules souches non transduites n'atteignent pas, quant à eux, des scores efficaces et présentent une récupération fonctionnelle inférieure à celle des animaux non greffés. L'identification des cellules transplantées dans le tissu lésé grâce à des différents marquages (EGFP et HuNu) ne permet pas de retrouver ces cellules un mois après la transplantation.Conclusion : ces résultats sont encourageants et sont en faveur d'un bénéfice supporté par la greffe de cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2. Ces cellules sans survivre au delà  de un mois apporteraient un support trophique permettant une régénération et une récupération fonctionnelle. La restauration du système sérotoninergique dont on connaît l'implication dans la locomotion expliquerait ces résultats qui méritent cependant une validation sur un modèle gros animal (singe, porc) avant une application clinique. / Spinal cord injuries (SCI) lead to deficits and often to major handicaps. To limit consequences of SCI, research focuses on the development of therapeutic strategies that aimed either at the reduction of the lesion and/or nervous tissues regeneration. Unfortunately, up to now the sole neuroprotective strategy did not demonstrate beneficial effects at the clinical level and there is thus more and more hopes based on neuroregenerative strategy in particular based on cell transplantation. In that aim, we have developed and characterized a rat injury model and grafted in the lesion site human embryonic progenitors to promote regeneration of nervous tissues.We have set up a rat model of spinal cord compression using an inflated balloon in the epidural space at the thoracic level (T9). Injured animals presented an initial complete sensory-motor paraplegia followed by a limited spontaneous neurological recovery (10%) one week after traumatism. Using this model, we have studied a regenerative strategy based on in situ progenitor cells transplantation in the injured spinal cord. Grafting of human embryonic progenitors had been done in the lesion site and in metamers located bellow and above the lesion. Human embryonic progenitors had been previously engineered in vitro to produce Neurogenin 2, a neurotrophic factor, that favours cell differentiation into neural lineages. The developed spinal cord compression model is reliable and reproducible. Pharmacological validation using a neuroprotective molecule, an antagonist of NMDA receptors (Gacyclidin), not only confirmed the pertinence of this model for the evaluation of therapeutic strategies but also that excitotoxicity plays a major role in the physiopathological processes involved in the secondary phase after lesion.Thirty five days after transplantation, rats that had been grafted with Neurogenin 2 expressing human embryonic progenitors demonstrated a significant motor recovery. This recovery was associated with a partial restoration of serotonin innervations bellow the lesion site and translocation of 5HT1A receptors to the plasma membrane of motoneurons. Animals transplanted with naïve cells presented a lower functional recovery than injured rat that had not been grafted. Moreover, one month after transplantation, grafted cells were not identifiable in the injured spinal cord. These encouraging results favour a beneficial effect of Neurogenin 2-expressing cells transplantation. One month after grafting, hENPs were undetectable in the injured spinal cord, thus functional recovery appears to be indirect and is likely due to trophic support supply. Partial restoration of serotonin innervations, whose role is well known in the locomotor function, may explain part of the observed functional recovery. These results clearly require to be validated in bigger animal models (monkey, pig) before any translation to the clinic.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi / Hematopoietic stem cells (HSC) are rare, but essential to sustain the constant production of all mature blood cells, a constantly renewing tissue. They are defined by two main characteristics; namely self-renewal (SR), or the capacity to preserve cell identity following division, and multipotency, the differentiation potential that allows them to generate all hematopoietic lineages. Given their attributes, HSC are used for cellular therapy in the transplantation field. A hierarchy in tissue organisation is also preserved in leukemia, or blood cancer, a heterogeneous tumor mass that is sustained by a subset of cells with unlimited SR potential, the leukemia stem cells (LSC). Studies presented in this manuscript aim to explore the molecular basis underlying SR, which are still poorly defined. Certain members of the HOX family of homeodomain transcription factors are involved in the regulation of normal hematopoiesis, and their deregulation can contribute to leukemia development. In particular, Hoxb4 overexpression in HSC influences cells fate, favouring SR divisions and their subsequent expansion in culture and in vivo. In general, HSC exhaust rapidly when maintained ex vivo, outside of their niche. Several factors interact with HOX and modulate their binding to DNA, including members of the TALE (Three Amino acid Loop Extension) protein family, such as MEIS1 and PBX1. Using a strategy of combined overexpression of Hoxb4 and an anti-sense to Pbx1in HSC, generating Hoxb4hiPbx1lo cells, it is possible to further impact on their SR potential and expansion in vitro. These Hoxb4hiPbx1lo cells remain functionally intact despite extreme modulation of their cell fate in culture. Levels of expression of nuclear factors, alone or in combination, can thus impact significantly on HSC fate. In order to identify other nuclear factors potentially involved in the process of HSC self-renewal, a strategy enabling simultaneous assessment several gene candidates was elaborated. To this end, progress made in terms of HSC purification and their culture in micro-wells facilitated the setup of an RNAi (RNA interference) screen, measuring the functional impact of lowering gene candidate transcript levels on HSC activity. Gene candidates selected for this study belong to the greater group of chromatin modifiers, more specifically the family of histone demethylases (HDM) containing a Jumonji catalytic domain. This choice stems from the regulatory function of several members of histone methyl-transferase complexes on HSC self-renewal, including the histone methyl-transferase MLL (Mixed Lineage Leukemia). This strategy was also used in the laboratory to study the role of asymmetry factors on HSC fate, in a collaborative study. These studies enabled identification of both positive and negative regulators of HSC activity. Among these, reduced expression of the gene coding for JARID1B, a histone 3 lysine 4 (H3K4) HDM, increased HSC activity was associated with Hox genes activation. In conclusion, several nuclear determinants, including transcription factors and chromatin modifiers, can influence HSC fate. Underlying mechanisms and identification of additional modulators of SR remain areas to explore, which could eventually contribute to HSC expansion strategies ex vivo, and identification of therapeutic targets against LSC. Keywords: hematopoietic stem cells, Hoxb4, Pbx1, self-renewal, histone demethylases, RNAi

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumour of childhood. In spite of many therapeutic improvements, only 60% survive long term. Presence of cancer stem cell (CSCs) is thought to mediate such resistance. PARP-1 plays an important role in the chemoresistance of certain tumours and its inhibition is shown to potentiate cells to routinely used anticancer agents. Moreover, Bcl-2 is over-expressed in NB and that its increased expression would contribute to chemotherapy resistance. Our goal was to determine the efficacy in vitro of a PARP inhibitor, AG-014699 (AG), and a Bcl-2 inhibitor, Obatoclax (Obx), in vitro and in vivo, in monotherapy or in combination to Doxorubicine (Doxo) and Cisplatine (Cis), classical chemotherapeutic agents used in NB treatment. In order to determine PARP-1 expression in NB tumours, 132 tumours were analyzed. We used an MTT test to evaluate 6 NB cell line and CSC sensitivity to AG alone or in combination to Doxo and Cis. We investigated the extent of cell death by Annexin-V and determined the degree of DNA damage by γH2aX staining. Also, signalling pathway modulations were analyzed by Western Blots. Obx sensitivity was determined by MTT test on 6 NB cell lines and its combination to Cis was also examined in 2 NB cell lines. Annexin-V and combinations to ZVAD-FMK also evaluated its effect on apoptosis. In vivo experiments were also done. Our results show that PARP-1 is associated to less aggressive tumors. AG has little to no effect on tumour growth when used alone and does not potentiate the effects of Doxo and Cis although more experiments will be needed. AG combined to Doxo seems to sensitize CSC in one cell line. Annexin-V and γH2aX staining reveal no effects of AG combination and Doxo mostly confers all cell damage and death. However, we do observe an increase in DNA damage and apoptosis in one cell line (SK-N-FI) when AG is used in monotherapy. pAKT and pERK are upregulated by Doxo and AG combination. NB cells are sensitized to Obx at nanomolar concentrations. Also, Obx activates apoptotic cell death. Moreover, Obx synergizes with Cis in vitro. In vivo, Obx significantly decreases tumor size. We conclude that Obx seems like a promising therapeutic approach in NB treatment whilst AG does not look so encouraging.

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC. / Stem cells have captured public’s attention in the last years, thanks to their involvement in cancer therapies and also their huge theoretical potential in the regenerative medicine field. In order to translate this new technology to the clinic, a better understanding of their regulatory mechanisms is still needed. It is well established that mouse embryonic stem cell (ESC) fate is highly regulated by core pluripotency factors. However, it is conceivable that novel self-renewal or differentiation regulators are not yet described. To investigate this possibility, we used a viral-based approach to generate a collection of ESC with nested chromosomal deletions called DelES (Deletion in ES cells). This library contains more than a thousand independent ESC clones highly enriched in chromosomal deletions which together cover ~25% of the mouse genome. Using this resource, we conducted an embryoid body (EB) differentiation screen and showed that several clones were having an abnormal EB formation phenotype. Complementation studies later identified Rps14-a ribosomal protein (RP) coding gene- as a novel haploinsufficient gene in EB formation from undifferentiated ESC. Further analyses of our screen results showed a strong bias for a subset of small subunit ribosomal protein genes which are critical for ESC differentiation but not for their self-renewal activity. Interestingly, the most severe differentiation phenotypes were found with ribosomal proteins associated to the ribosome’s mRNA exit site, namely Rps5, Rps14 and Rps28. While RP gene imbalance often leads to a p53 response that can be corrected by p53 suppression, ESC clones with decreased expression of mRNA exit site RP genes were surprisingly insensitive to p53 reduction, but were rescued by BAC or cDNA complementation, thus confirming the causative nature of these genes in the ESC phenotype. Finally, polysomal profiling and RNA-Seq studies showed that Rps5 deleted ESC exhibit an abnormal mesodermal gene signature. Together, our work presents a highly valuable resource for functional genomic studies in ESC and also highlights a novel p53-independent role linked to RP gene imbalance. Our results shed light on the relevance of these subunits for the developmental transition of ESC from a pluripotent to a differentiated state.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.