Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:57:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salerno_AlessandroGonzales_D.pdf: 2445286 bytes, checksum: e866a42ced694e2b27c4f3217df48712 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Neste trabalho investigamos o efeito da expressão de genes envolvidos no transporte e redistribuição de triglicérides das lipoproteínas plasmáticas, a apolipoproteína (apo) CIII e a proteína de transferência de colesteril éster (CETP), sobre o metabolismo de triglicérides pós-prandial e sobre a formação de depósitos adiposos regionais em camundongos geneticamente modificados. Podemos resumir nossos achados da seguinte maneira: a expressão da CETP leva ao aumento da trigliceridemia pós prandial; nenhuma alteração da absorção intestinal de gorduras e de secreção hepática de VLDL (lipoproteína de densidade muito baixa); redução da atividade da lipoproteína lipase e retardo na remoção plasmática de lipoproteínas ricas em triglicérides (TG). Mediante longo prazo de dieta rica em gordura, a super-expressão da CETP também provoca redução da gordura subcutânea, redução do tamanho do adipócito e da concentração plasmática de leptina em camundongos transgênicos hipertrigliceridêmicos que super-expressam a apo CIII. Por outro lado, a superexpressão de apo CIII não afeta o tamanho dos depósitos adiposos viscerais e subcutâneos na vigência de dieta pobre em gordura, porém causa aumento dos depósitos adiposos viscerais e subcutâneos e do tamanho dos adipócitos viscerais e concentração de leptina mediante dieta rica em gordura. Os camundongos que super-expressam a apo CIII não apresentaram diferenças na adiposidade quando sob dieta pobre em gordura devido a um aumento do metabolismo corporal associado a maior velocidade de respiração mitocondrial de repouso. Porém, quando submetidos à dieta rica em gordura, acumulam mais tecido adiposo visceral e subcutâneo, tornando-se mais obesos que os controles. A expressão da CETP neste contexto metabólico de hipertrigliceridemia neutraliza o efeito adipogênico da apo CIII / Abstract: Cholesteryl ester transfer protein (CETP) promotes the exchange between cholesteryl ester (CE) from HDL and triglycerides (TG) from TG rich lipoproteins. The overexpression of apolipoprotein (apo) CIII in transgenic mice causes hypertriglyceridemia due to decreased TG rich lipoprotein plasma removal rate. In this work we investigated whether CETP expression and apo CIII expression affect the post-prandial TG levels and diet induced visceral adipose tissue formation in genetically modified mice. Results showed that the expression of CETP lead to augmented post-prandial TG levels, similar intestinal fat absorption and hepatic TG and cholesterol secretion rates, diminished TG rich lipoproteins plasma removal rates and reduced lipoprotein lipase activity. These findings indicate that the levels of circulating CETP modulate dietary fat tolerance. Under long-term high fat diet, the expression of CETP reduced the subcutaneous adipose depot, visceral adipocyte size and plasma leptin levels of hypertriglyceridemic mice overexpressing the apo CIII. On the other hand, under low fat diet, the apo CIII transgenic mice presented visceral and subcutaneous adipose depots similar to the wild type mice and increased body metabolic rate and mitochondrial resting respiration rates. However, under high fat diet, the apo CIII transgenic mice showed increased visceral and subcutaneous adipose tissue, visceral adipocyte size and plasma leptin levels and no differences in body energy dissipation (rectal temperature and mitochondrial resting respiration). In conclusion, the elevation of plasma apo CIII levels aggravates diet-induced obesity and the expression of physiological levels of circulating CETP reverses this adipogenic effect, indicating a novel role for CETP in modulating adiposity / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Les résultats des études cliniques récentes évaluant l'impact de l'augmentation du HDL-C sur la survenue des maladies cardiovasculaires n'ont pas permis de démontrer une efficacité significative de cette stratégie thérapeutique ciblée sur le HDL-C. L'évaluation de la fonctionnalité des particules HDL dans sa capacité à assurer le retour du cholestérol des tissus périphériques au foie s'avère plus importante que la simple mesure du HDL-C. L'objectif de mes travaux de recherche a été d'évaluer la fonctionnalité des particules HDL en fonction du contexte métabolique, inflammatoire et génétique de chaque individu. Mes travaux de recherche ont démontré que la niacine réduit l'athérogénicité des lipoprotéines durant la période postprandiale modulant par conséquent la fonctionnalité des particules HDL dans la voie du transport inverse de cholestérol. J'ai également montré que certaines pathologies infectieuses associées à des taux bas de HDL-C, entrainent une baisse de la capacité des particules HDL à stimuler l'efflux de cholestérol à travers le macrophage humain. En revanche, j'ai montré que des variations génétiques entrainant des taux élevés de HDL-C ne sont pas associées à une dysfonction des particules HDL dans la voie du transport inverse de cholestérol. Mes travaux soulignent l'importance de considérer que la fonctionnalité des particules HDL est modulée in vivo par des contraintes métaboliques inflammatoires et génétiques d'où il est nécessaire que les thérapies en cours de développement visant à augmenter la fonction des HDL soient résistantes aux modifications métaboliques et inflammatoires afin d'assurer une athéroprotection efficace. / HDL cholesterol as a therapeutic target has been the focus over the past 20 years mainly because its plasma concentrations are inversely correlated with the risk of coronary events. However, recent clinical trials involved the addition of niacin or CETP inhibitors to a statin in patients with CHD who had well controlled LDL-C levels have failed to show evidence of a significant reduction in cardiovascular events. Studies on the capacity of HDL to promote reverse cholesterol transport pathway have suggested that this is a better predictor of prevalent atherosclerotic disease than HDL-C itself. The main purpose of my project was to evaluate the impact of metabolic context, inflammation and genetics on modulation of HDL functionality. I have shown that extended release niacin/laropiprant treatment reduces atherogenic postprandial lipoproteins in patients with metabolic disorders stabilized by statins, having consequences on reverse cholesterol transport pathway and HDL functionality. Moreover, I have shown that infectious diseases such as HIV, induce an alteration in the capacity of HDL particles to stimulate cholesterol efflux from human macrophages. I have also shown that mutations causing high levels of HDL-C, are characterized by the presence of functional HDL in their capacity to stimulate reverse cholesterol pathway. However such patients are not systematically protected against cardiovascular disease highlighting the complex relationship between cholesterol efflux and the prediction of cardiovascular events. Those results point out the relevance of developing therapeutic approaches targeting HDL function and reverse cholesterol transport pathway.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sidneypinheirojunior_tese.pdf: 1185692 bytes, checksum: 2cae9b38515819abe487b6260ac74acc (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / Background Outstanding, among the factors associated to cholelithiasis after bariatric surgery, are those related to metabolism and synthesis of lipoproteins, such as apolipoprotein E (ApoE) and protein from cholesterol ester transfer protein (CETP). Methods - 220 patients have been part of the study, 114 (G1) with cholelithiasis postoperatively and 106 (G2) without cholelithiasis in over 8 months period, including the analysis of apoE-Hha I and CETP-TaqIB polymorphisms per PCR / RFLP and biochemical profile [total cholesterol (TC), lipoprotein cholesterol fraction of low (LDL), high (HDLc) and very low density (VLDLc), triglycerides (TG) and glucose levels. It was accepted level of significance for P <0.05. Results - Preoperatively, it was observed that in G1 54% of the patients with the APOE*4 allele had serum altered levels of LDL. Postoperatively, there was a decrease (P <0.001) of LDL with TG in G2 (85.3 ± 32.1 mg / dL, P <0.0001) and glucose (G1 = 83.2 ± 10.7 mg / dL; G2 = 84.7 ± 11.5 mg / dL, P <0.0001 for both), TC and LDL and HDL cholesterol increased only in G2 (P <0.0001). The B1 allele was related to decreased (P <0.01) of TC, LDLc and TG postoperatively in both groups, in addition to lowering glucose levels and increase HDL cholesterol only in G2 (P <0.0001). The genotype APOE*_/4 in G2 was associated with decreased levels of TC, LDL, TG and glucose levels and increased levels of HDL cholesterol (P<0.01) postoperatively. Conclusions - This study does not confirm the association of apoE-Hha-I and CETP-TaqIB with gallstones in the late postoperative period after bariatric surgery. However, B1 allele seems to enhance the action of bariatric surgery in the control of dyslipidemia effectively reducing levels of TC, LDL and TG, with additional benefit to those without gallstones by decreasing blood glucose levels and also increase HDL cholesterol. The relationship of APOE*4 with increased LDLc preoperatively only in G1 suggests its association with cholelithiasis in the late postoperative bariatric surgery, which should be evaluated in prospective studies. / Introdução- Destacam-se entre os fatores associados à colelitíase após cirurgia bariátrica, aqueles relacionados a metabolismo e síntese de lipoproteínas plasmáticas, como apolipoproteína E (apo E) e proteína de transferência do éster de colesterol (CETP). Objetivos-Avaliar a associação das variantes genéticas apoE-Hha I e CETP-TaqIB na colelitíase e sua influência no perfil bioquímico,além de perfil antropométrico e co-morbidades em pacientes com obesidade mórbida após cirurgia bariátrica. Métodos- Foram estudados 220 pacientes: 114 (G1) com colelitíase no pós-operatório e 106 (G2) sem colelitíase, em período >8 meses, incluindo a análise dos polimorfismos apoE-HhaI e CETP-TaqIB por PCR/RFLP e perfil bioquímico [colesterol total (CT), fração de colesterol de lipoproteína de baixa (LDLc), alta (HDLc) e muito baixa densidade (VLDLc), triglicérides (TG) e glicemia], além do índice de massa corporal (IMC), cintura abdominal (CA), hipertensão e diabete melito. Admitiu-se nível de significância para P<0,05. Resultados- Houve semelhança entre os grupos para os genótipos de apoE-HhaI e CETP-TaqIB. O genótipo APOE*3/3 prevaleceu em ambos os grupos (G1: 65% e G2:73%; P=0,204), enquanto genótipos APOE*_/4 destacaram-se em G1 (23% versus 16%; P=0,269). Para CETP o alelo B1 prevaleceu em G1 (0,59) e G2 (0,62; P=0,558). O perfil bioquímico, com valores recomendados já no pré-operatório em ambos os grupos, exceto para TG (141,4±75,4; 159,3±90,9mg/dL, respectivamente, P=0,123) e glicemia (113,0±53,2; 105,8±34,3mg/dL, respectivamente; P=0,262), mostrou decréscimo (P<0,001) no pós-operatório para todas as variáveis, incluindo TG (respectivamente, 89,0±34,6mg/dL; 85,3±32,1mg/dL; P<0,0001 para ambos) e glicemia (respectivamente, 83,2±10,7mg/dL; 84,7±11,5mg/dL; P<0,0001 para ambos). Níveis de HDLc mostraram acréscimo no pós-operatório apenas em G2 (52,5±14,7 versus 43,0±11,9; P<0,0001). Em G1, 54% dos pacientes portadores do alelo APOE*4 tinham níveis séricos alterados de LDLc no pré-operatório. O genótipo APOE*3/3, em G1, associou-se com decréscimo nos níveis de CT, LDLc, TG e glicemia e aumento nos níveis de HDLc (P<0,01). O mesmo ocorreu para genótipos APOE*_/4, em G2. O alelo B1 relacionou-se com decréscimo (P<0,01) de CT, LDLc e TG no pós-operatório em ambos os grupos, além de redução de glicemia e aumento de HDLc apenas em G2 (P<0,0001).Ambos os grupos mostraram redução nos valores de IMC e CA, além de hipertensão e diabete melito. Conclusões: Variantes de apoE-HhaI e CETP-TaqIB não diferenciam os grupos com e sem colelitíase no pós-operatório tardio de cirurgia bariátrica. Presença de APOE*4 relacionada com aumento de LDLc no pré-operatório, sugere sua influência no desenvolvimento de colelitíase no pós- operatório tardio, a ser confirmado em estudos prospectivos. CETP-Taq IB, representado pelo alelo B1 parece potencializar a ação da cirurgia bariátrica no controle do perfil bioquímico, particularmente em G2 com aumento de HDLc e decréscimo da glicemia. Além disso, independente da presença de colelitiase, a cirurgia bariátrica controla também doenças crônicas como diabete melito e hipertensão arterial.

Dans le plasma, la protéine humaine de transfert des esters de cholestérol joueun rôle central dans le métabolisme des lipoprotéines plasmatiques en catalysant le transfert net massique d'esters de cholestérol des HDL vers les lipoprotéines contenant de l'Apo.B, et de triglycérides des VLDL vers les HDL et LDL. Bien que le rôle de la CETP sur l'athérogénicité du profil lipoprotéique reste à l'heure actuelle encore ambigu, l'étude des mécanismes de régulation de cette protéine suscite un intérêt croissant d'un point de vue pharmacologique en particulier en ce qui concerne le développement d'inhibiteurs. <br />Une approche in vitro nous a permis de montrer que des composés amphipathiques (acides gras non estérifiés et rétinoïdes) constitués d'une chaîne carbonée hydrophobe et d'un groupement carboxylique ionisable induisaient une augmentation de l'activité de transfert des esters de cholestérol en augmentant l'électronégativité des particules lipoprotéiques. <br />In vivo, nos études ont permis de mettre en évidence une corrélation significative entre la concentration en acides gras non estérifiés liés aux protéines et l'activité de la CETP plasmatique chez des sujets normolipidémiques. L'effet des acides gras non estérifiés est encore plus marqué dans des situations pathologiques associées à une redistribution des AGNE de l'albumine vers les lipoprotéines plasmatiques (analbuminémie ou syndrôme néphrotique). La mise au point d'une méthode électrophorétique spécifique nous a permis de confirmer que, chez des sujets analbuminémiques, les échanges d'esters de cholestérol s'effectuent préférentiellement avec les lipoprotéines les plus électronégatives dont le contenu en AGNE est le plus élevé.<br />Globalement, les résultats de cette étude montrent que les AGNE constituent des modérateurs potentiels de l'activité de transfert des esters de cholestérol au niveau plasmatique et qu'ils pourraient ainsi influencer l'athérogénicité du profil lipoprotéique.

La capacité des particules HDL à exercer des effets anti-athérogènes passe notamment par leur capacité à assurer le transport inverse du cholestérol (RCT). L'objectif principal de mon programme de recherche est l'étude de l'étape initiale du transport inverse du cholestérol que représente l'efflux de cholestérol du macrophage, dans le contexte des maladies métaboliques et du risque cardiovasculaire et de mortalité. J'ai étudié la relation entre l'efflux, et les conséquences sur le développement de l'athérosclérose dans un contexte métabolique particulier ; le syndrome métabolique (SM). J'ai démontré que les critères individuels du SM sont intimement liés à l'efflux et que ces deux notions sont associées de façon indépendante aux paramètres cliniques de l'athérosclérose. J'ai aussi évalué la pertinence de l'efflux de cholestérol comme biomarqueur de la mortalité. Cette étude identifie l'efflux comme prédicteur de la mortalité toutes causes confondues, indépendamment des taux de HDL-cholestérol et des facteurs de risques cardiovasculaires traditionnels, dans une population de patients traités par angioplastie coronaire primaire, suite à un infarctus du myocarde avec élévation du segment ST. Enfin, je me suis intéressée à à une situation métabolique particulière ; l'état postprandial. Mes travaux montrent que la réponse postprandiale hypertriglycéridémique physiologique observée chez des individus sans désordre métabolique ne s'accompagne pas d'altération majeure de l'efficacité du RCT ou de l'inflammation systémique. Mes travaux confirment le rôle déterminant de l'efflux dans la prévention du développement de l'athérosclérose et de la mortalité cardiovasculaire. / The contribution of high-density lipoprotein to cardiovascular benefit is closely linked to its anti-atherogenic role in the cellular cholesterol efflux. The main purpose of my project was to evaluate the efficiency of the first step of reverse cholesterol transport (RCT), which is the efflux capacity, on metabolic disorder context, on cardiovascular risk and on mortality. My research has focused on three independent and complementary parts. I have first evaluated the relationship between efflux and its consequences on atherosclerosis development in a metabolic syndrome (MetS) population. I have shown that individual criteria of MetS are closely related synergistically to cholesterol efflux capacity. In addition, established metabolic syndrome and cholesterol efflux capacity were independently associated with clinical features of atherosclerosis. In a second study I identified cholesterol efflux capacity as a predictor of all-cause mortality in consecutive ST-segment elevation myocardial infarction patients treated by primary angioplasty, independent of HDL-C, traditional cardiovascular risks or cardiac risk factors. Finally I have evaluated the consequences of postprandial hypertriglyceridemia on the functionality of key steps of RCT and associated anti-inflammatory components. My work has shown that the physiological postprandial hypertriglyceridemia response is not accompanied by a major alteration in the efficiency of RCT or systemic inflammation, on individual without metabolic syndrome. In conclusion, I have confirmed the crucial role of the first step of reverse cholesterol transport in preventing the development of atherosclerosis and cardiovascular mortality.

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En étudiant les variations génétiques au sein d'une population, il est possible d'identifier des polymorphismes génétiques qui confèrent une protection naturelle contre la maladie. Si l'on parvient à comprendre le mécanisme moléculaire qui sous-tend cette protection, par exemple en reliant la variation génétique à la perturbation d'une protéine bien précise, il pourrait être possible de développer des thérapies pharmacologiques qui agissent sur la même cible biologique. Cette relation entre les médicaments et les variations génétiques est une des prémisses centrales de la validation génétique de cibles pharmacologiques qui est un facteur de réussite dans le développement de médicaments. Dans cette thèse, nous utiliserons un modèle génétique pour prédire les effets bénéfiques et indésirables de l'ivabradine, un médicament utilisé afin de réduire la fréquence cardiaque. L'ivabradine est un inhibiteur du canal ionique potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4, encodé par le gène HCN4, dont les bénéfices sont hétérogènes chez différentes populations de patients. Ce médicament est efficace pour le traitement de l'angine et de l'insuffisance cardiaque, mais s'est avéré inefficace en prévention secondaire chez des patients coronariens stables sans dysfonction systolique. La caractérisation des effets de l'ivabradine s'est échelonnée sur une période de 6 ans et trois grands essais de phase III ont été menées. Nous étudierons la possibilité d'avoir prédit ou accéléré ce processus à l'aide de modèles génétiques et nous contrasterons les effets spécifiques à l'ivabradine des effets généraux de la réduction de la fréquence cardiaque par une approche de randomisation mendélienne. Deuxièmement, une approche génétique sera utilisée pour évaluer l'effet de l'inhibition de la cholesteryl ester tranfer protein (CETP), une enzyme responsable du transfert des cholestérols estérifiés et des triglycérides entre différentes lipoprotéines ainsi qu'une cible pharmacologique largement étudiée pour le traitement de la maladie coronarienne. Les études génétiques prédisent un bénéfice à l'inhibition de CETP, mais les essais randomisés ont eu des résultats hétérogènes et décevants. Nous utiliserons un modèle génétique d'inhibition de la CETP pour identifier des variables qui peuvent moduler l'effet de l'inhibition de la CETP sur des biomarqueurs et la maladie ischémique. Les biomarqueurs pris en compte comprennent les taux de cholestérol à lipoprotéines de basse et haute densité, mais aussi la capacité du plasma à absorber le cholestérol, une mesure fonctionnelle importante et sous-étudiée. Le sexe et l'indice de masse corporelle se sont avérés être deux variables qui modifient fortement les effets d'une réduction génétiquement prédite de la concentration de CETP sur les paramètres étudiés. Notre modèle prédit un bénéfice plus important de l'inhibition de la CETP pour les femmes et les individus ayant un indice de masse corporelle normal sur le profil lipidique, mais nous n'avons pas pu démontrer une modulation de l'effet sur la maladie ischémique. Cette étude reste importante sur le plan méthodologique, car elle soulève la possibilité d'utiliser des modèles génétiques de cibles pharmacologiques pour prédire l'hétérogénéité dans la réponse au médicament, une lacune des essais randomisés classiques. Enfin, nous avons adopté une approche centrée sur les gènes pour caractériser l'effet de 19 114 protéines humaines sur 1 210 phénotypes de la UK Biobank. Les résultats de cette étude sont accessibles au public (https://exphewas.statgen.org/) et constituent une ressource précieuse pour cerner rapidement les conséquences phénotypiques associées à un locus. Dans le contexte de validation de cibles pharmacologiques, cette plate-forme web peut aider à rapidement identifier les problèmes de sécurité potentiels ou à découvrir des possibilités de repositionnement du médicament. Un exemple d'utilisation de cette plate-forme est présenté où nous identifions le gène de la myotiline comme un nouvel acteur potentiel dans la pathogénèse de la fibrillation auriculaire. / Using population-level data, it is possible to identify genetic polymorphisms that confer natural protection against disease. If the molecular mechanism underlying this protection can be understood, for example by linking variants to the disruption of a particular protein, it may be possible to develop drugs that act on the same biological target. This link between drugs and variants is a central premise of genetic drug target validation. In this work, a genetic model is used to predict the beneficial and adverse effects of ivabradine, a drug used to lower heart rate. Ivabradine is an inhibitor of the ion channel potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4, encoded by the HCN4 gene, with heterogeneous benefits in different patient populations. This drug is effective in the treatment of angina and heart failure but it is ineffective in patients with stable coronary artery disease without systolic dysfunction. Characterization of the effect of ivabradine has occurred over a 6-year period and three large phase III trials have been conducted. We will investigate whether this process could have been streamlined using genetic models and contrast the ivabradine-specific effect with the general effect of heart rate reduction using a Mendelian Randomization approach. Second, a genetic approach is used to study the effect of inhibiting cholesteryl ester tranfer protein (CETP), an enzyme responsible for the transfer of cholestery esters and triglycerides between different lipoproteins and a widely studied drug target for the treatment of coronary artery disease. Genetic studies predict a benefit of CETP inhibition, but randomized trials yielded heterogeneous and disappointing results. We will use a genetic model of CETP inhibition to identify variables that may modulate the effect of CETP inhibition on biomarkers and ischemic disease. The biomarkers we considered included low- and high-density lipoprotein cholesterol levels but also the plasma cholesterol efflux capacity, an important and understudied functional measure of high density lipoproteins. Sex and body mass index strongly modulated the effect of a genetically predicted lower CETP concentration on the lipid profile. Our model predicts a greater benefit of CETP inhibition in women and individuals with normal body mass index on the lipid profile, but these observations did not translate to changes in the effect on cardiovascular outcomes. This study remains methodologically important because it demonstrates the possibility of using genetic models of drug targets to predict heterogeneity in drug response, a shortcoming of conventional randomized trials. Finally, we adopted a gene-centric approach to characterize the effect of 19,114 human protein-coding genes on 1,210 UK Biobank phenotypes. The results of this study are publicly available (https://exphewas.statgen.org/) and provide a valuable resource to rapidly screen the phenotypic consequences associated with a gene. In the context of drug target validation, this platform can help quickly identify potential safety issues or discover drug repurposing opportunities. An example of the use of this platform is presented where we identify the myotilin gene as a potential atrial fibrillation gene.