A transmissão oral ganhou destaque devido aos recentes surtos que ocorreram no Brasil com a ingestão de alimentos contaminados, além dessa via outra de grande importância é a transmissão transplacentária, sendo assim o presente trabalho associou as duas formas de transmissão da doença, juntamente com o tratamento com o benzonidazol único medicamento disponível no Brasil para o tratamento da doença. O medicamente é adotado somente para o tratamento da fase aguda, porém alguns pesquisadores mostraram alguns benefícios da terapia com benzonidazol na fase crônica da doença podendo o medicamento diminuir o avanço da doença e prolongar a soro conversão negativa em pacientes intermediários. Assim o objetivo deste trabalho foi de investigar a eficácia do tratamento tanto na fase aguda quanto na fase crônica da doença, bem como o efeito do tratamento em fêmeas de fase crônica. Utilizou-se camundongos Balb/c infectados com 2 x 105 formas tripomastigotas sanguíneos da cepa RC de T. cruzi administrado via oral. Os animais de fase aguda tratados receberam 50mg/Kg/dia de benzonidazol por 16 dias enquanto que aos animais de fase crônica o tratamento se iniciou ao 3º dia de gestação sendo administrado pelo mesmo período. O curso da parasitemia sanguínea foi verificada bem como ao fim do tratamento a parasitemia tecidual em baço, fígado e coração; placenta e feto, quando havia, empregando-se as técnicas de qPCR, com dois distintos métodos de cálculos matemáticos, imunofluorescência em microscopia confocal e análise histopatológica por coloração HE. A administração de benzonidazol proporcionou a diminuição das cargas parasitárias de baço, fígado e coração elucidando a eficácia do medicamento também em fase crônica. Porém em placenta e feto o medicamento gerou aumento de parasitas teciduais nos grupos que receberam tratamento em detrimento aos que não receberam. Deste modo, podemos sugerir que o tratamento com benzonidazol pode ser indicado para minimizar a carga de parasitas ou até mesmo para sua completa erradicação em indivíduos em fase crônica. Bem como, sugerimos que o medicamento deve ser ofertado por maior tempo aos indivíduos chagásicos tanto na fase aguda quanto na fase crônica visto que apresenta melhores resultados com o prolongamento da terapia. Entrementes dissuadimos o tratamento durante o período gestacional visto que, pode induzir a diminuição das barreiras imunológicas maternas e/ou facilitar a migração parasitária para os tecidos placentários e fetais. / Chagas\' disease affect millions of people around the world and the benznidazole is the only drug for the treatment in Brazil, but it is used basically for the acute phase of the disease. Some researchers showed many benefits of benznidazole therapy in chronic phase like reduction of the progression of the disease. Therefore, the objective of this work was investigate the efficacy of treatment in both acute and chronic phase of this disease, as well as the effect of treatment of female mouse in chronic phase. Balb/c mice were infected with 2 x 105 trypomastigotes forms of RC strain of Trypanosoma cruzi by oral route. Mice in acute phase were treated with 50mg/Kg/day Benznidazole for 16 days. Some chronically-infected mice were treated by 3rd to 18th day of gestation with the same dose. Blood parasitaemias were determined by microscopic examination of tail vein blood amount. Tissues parasitism were determined by qPCR with two different mathematical forms, immunofluorescence confocal microscopy and histopathology by HE staining. Administration of benznidazole promoted decrease of parasites in spleen, liver and heart indicating the efficacy of the drug in the chronic phase. However in placenta and fetus the drug caused tissues parasites increased in the groups that received treatment. Therefore, we suggest that the treatment with benznidazole would be indicated to minimize the number of parasites or eliminate them in individuals in chronic phase. As well, we suggest that the drug should be offered for longer chagasic individuals to both acute and chronic phase because it shows better results with prolonged therapy. However, our results indicate the treatment do not be offered during pregnancy because it can induce the decrease of maternal immunological barriers and facilitate the parasite migration to the placental and fetal tissues.

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde em regiões endêmicas que vão desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina. O protozoário tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi é o agente causador dessa devastadora doença, que afeta milhões de pessoas. Existem em torno de 10 milhões de indivíduos contaminados e pelo menos 25 milhões de pessoas vivem em locais riscos de infecção. Os dois medicamentos, o nifurtimox e o benzonidazol, apresentam sérios efeitos colaterais além de se mostrarem ineficazes na fase crônica da doença. Esse triste perfil, felizmente, tem se alterado com recentes avanços que levaram o ravuconazol, pozaconazol e K11777 para estudos em fase clínica. Com base em seu papel fundamental no ciclo do T. cruzi, a sexta enzima da via glicolítica, a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) vem sendo considerada um alvo promissor para a descoberta e o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos para o tratamento da doença de Chagas. É amplamente conhecida a importância do planejamento de compostos tanto por método baseado na estrutura do alvo quanto do ligante. A docagem molecular foi usada para a seleção inicial dos compostos para o teste biocalorimétrico, e a partir dessa estratégia foi possível, de 25 compostos. Os parâmetros cinéticos da catálise da TcGAPDH foram determinados (KM = 10,51 ± 0,91 µM, Vmax = 4,18 ± 0,09 x 10-4 mM s-1 e kcat = 85,88 ± 3,22 s-1). Os experimentos cinéticos por ITC possibilitou na identificação de cinco compostos bioativos, sendo três com constante de inibição abaixo de 100 µM (13,21 ± 0,88, 35,00 ± 1,70 e 78,45 ± 2,69 µM). Processos de simulação de dinâmica molecular foram aplicados para a predição do modo de interação dos três compostos com Ki app menores que 100 µM. / Chagas disease is a serious health problem in endemic regions ranging from the southern the United States to Argentina. The protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent of this devastating disease that affects millions of people. Exist about 10 million people infected and at least 25 million people live in risk of local infection. There are only two drugs used to treat Chagas disease during acute phase and it show harmful side effects. This gloomy outlook has changed due to major advances in research of anti-trypanosomatid agents; an example is posaconazole, ravuconazole and K11777 both, which currently is in clinical phase. A promising target that is receiving considerable attention is the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12) a key protein in the glycolytic pathway of trypanosomatids. SBVS methods were used for the selection of 25 compounds and these were assayed against GAPDH using Isothermal Titration Calorimetry. The kinetic parameters of catalysis were determined TcGAPDH (KM = 10.91 ± 0.91 µM, Vmax = 4.18 ± 0.09 x 10-4 mM s-1 and kcat = 85.88 ± 3.22 s-1). The kinetic experiments by ITC allowed the identification of five bioactive compounds, three with inhibition constant below 100 µM. Simulation process of molecular dynamics were applied to predict the mode of interaction for the three compounds with Kiapp less than 100 µM.

Desde a identificação do vírus da imunodeficiência humana (HIV, do inglês Human Immunodeficiency Virus) como agente causador da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS ? do inglês Acquired Immunodeficiency Syndrome), a busca para tratamentos seguros e eficazes contra o HIV transformou-se no principal foco para a descoberta de uma nova droga em todo o mundo. A AIDS aparece como um dos principais problemas de saúde pública para as próximas décadas, onde será o maior determinante de mortalidade na faixa etária entre 20 e 50 anos em praticamente todos os países do mundo. Tendo como objetivo relacionar a atividade de compostos biflavonóides anti-HIV-1 com algumas de suas propriedades moleculares, serão utilizados métodos de Mecânica Molecular e Química Quântica. O método de cálculo semi-empírico AM1 foi empregado para calcular um conjunto de propriedades moleculares dos 14 compostos biflavonóides com atividade anti-HIV-1. A seguir utilizar-se-á métodos estatísticos com a finalidade de separar os 14 compostos em duas classes, ativos e não ativos, de forma que se relacione qual as propriedades, dentre as calculadas, são responsáveis pela atividade dos compostos biflavonóides estudados. As técnicas estatísticas utilizadas foram a Análise de Componentes Principais (PCA: Principal Components Analysis), Análise Hierárquica de Agrupamentos (HCA: Hierarquical Clusters Analysis) e Análise de Discriminates por Passos (SDA: Stepwise Discriminant Analysis). Os estudos com PCA, HCA, e SDA mostraram que as variáveis HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital - Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia), LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital ? Orbital Molecular Desocupado de Menor Energia), e Área superficial são responsáveis pela separação dos compostos com alta e baixa atividade anti-HIV-1. O comportamento destas três propriedades pode ser útil na tentativa de se obter outros compostos biflavonóides com elevada atividade inibidora anti-HIV-1. / A set of 25 quinone compounds with anti-trypanocidal activity was studied by using the Density Functional Theory (DFT) method in order to calculate electronic atomic and molecular properties to be correlated with the biological activity. The chemometric methods Principal Component Analysis (PCA), Hierarchical Cluster Analysis (HCA), Stepwise Discriminant Analysis (SDA), Kth nearest neighbor (KNN) and Soft Independent Modeling of Class Analogy (SIMCA) were used to obtain possible relationships between the calculated descriptors and the biological activity studied and predict the anti-trypanocidal activity of new quinone compounds from a test set. Four descriptors were responsible for the separation between the active and inactive compounds: T5 (torsion angle), HOMO-1 (energy of the first molecular orbital below HOMO), QTS1 (sum of absolute values of the atomic charges) and VOLS2 (volume of the substituent at region B). These descriptors give information on the kind of interaction that occurs between the compounds and the biological receptor. The prediction study was done with a set of three new quinone compounds by using the PCA, HCA, SDA, KNN and SIMCA. Beside the five chemometric methods, the neural network method was used by employing the backpropagation algorithm. The four variables (T5, QTS1, VOLS2 and HOMO-1) were employed to validate the models constructed previously. The architecture of networks consisting of four neurons at input layers, ten neurons at intermediary layers and two neurons at output layers was adopted to observe the root mean square error between the true and desired output over the entire training set. The percentage of correct classification was 87.5%, and only one compound was predicted wrong in the test set, which indicates that the model is robust and could be able to make predictions. The docking studies were carried out with two different programs in the approach of ligands: the Autodock and FlexX. The docking results on trypanothione reductase enzyme showed that all studied compounds stay at second hydrophobic pocket in the outer region of the active site called the Z-site. The residues that could be specifically involved in the binding of ligands are Lys62, Thr66, Thr397, Thr463, Leu399, Ser464, Glu466 and Glu467, where the residues Thr66, Thr463 and Leu399 are conserved in different trypanothiones and could be used for the development of selective inhibitors against to the parasite enzyme.

Introdução: A morte súbita é a principal causa de morte na doença de Chagas, correspondendo de 55 a 65% dos casos. Observa-se que parte destas, ocorre em pacientes com função ventricular esquerda (FEVE) preservada, levando a acreditar que fatores desestabilizadores do substrato arritmogênico exercem um importante papel nestes eventos. Evidências já demonstraram a depressão parassimpática como fator contribuinte na gênese de arritmias diversas em presença de cardiopatia isquêmica. Assim, insiste-se na necessidade de se identificar precocemente quais os pacientes, no contexto da cardiopatia chagásica crônica, apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de eventos arrítmicos complexos. Acredita-se que a avaliação autonômica identifique subgrupos distintos de risco. O presente estudo teve como objetivo determinar a sensibilidade do barorreflexo (SBR) em pacientes com doença de Chagas, nas formas indeterminada (GI) e arritmogênica com taquicardia ventricular não sustentada (GII) e com taquicardia ventricular sustentada (GIII) e, secundariamente, avaliar a associação entre a severidade da arritmia ventricular com o grau de comprometimento da SBR. Métodos: 42 pacientes foram submetidos à monitorização cardiovascular não invasiva pelo sistema Task Force ® onde foi determinada a SBR, utilizando o método da fenilefrina e analisada a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) no domínio do tempo por meio da eletrocardiografia dinâmica de 24horas e a FEVE, por meio da ecocardiografia. Resultados: Observou-se diferença estatística significativa entre os grupos em relação à SBR em resposta à fenilefrina. O GIII apresentou o menor valor de SBR (6,09 ms/mmHg) quando comparado aos GII (11,84ms/mmHg) e GI (15,23ms/mmHg). Após comparação múltipla entre os grupos, verificou-se diferença significativa entre GI e GIII (p= 0,01). Quando se correlacionou SBR e densidade de extra-sístoles ventriculares (EV), observou-se que todos os pacientes portadores de baixa densidade de EV (< 10/hora) apresentavam SBR preservada (6,1ms/mmHg).Em contrapartida, entre aqueles com alta densidade de EV (>10/hora) somente 59% tinham SBR preservada (p=0,003). Nos pacientes com SBR deprimida (3,0-6,0 ms/mmHg) houve maior densidade de EV (p=0,01). Pacientes com SBR preservada apresentaram tanto função ventricular normal como moderadamente comprometida (66,7% com FEVE<40% e 79,5% com FEVE40%; p=0,62). O mesmo observou-se em pacientes com SBR moderadamente deprimida, (15,4% com FEVE<40% e 33,3% com FEVE40%; p=0,46). Não foi verificada correlação entre SBR e VFC. Ao se aplicar o modelo de regressão logística, observou-se que somente a SBR influenciou o aparecimento da taquicardia ventricular sustentada (p=0.028). Conclusão: A SBR está preservada na forma indeterminada da doença de Chagas e diminuída na forma arritmogênica. O comprometimento da SBR é progressivo e acompanha a evolução da doença, sendo mais intenso nos pacientes com arritmias ventriculares mais complexas. O grau de disfunção autonômica não se correlacionou com a função ventricular, mas, sim, com a densidade e a complexidade das arritmias / Introduction: Sudden death is the main cause of death in Chagas disease, corresponding to 55 to 65% of the cases. Some of these occur in patients with normal or almost normal left ventricular function (LVF), leading us to believe that factors that destabilize the arrhythmogenic substrate play an important role in these events. Evidences show parasympathetic depression to be a contributing factor in the genesis of diverse arrhythmias in the presence of ischemic heart disease. Thus, we insist on the need of an early identification of the patients, in the context of chronic Chagas heart disease, that are at increased risk of developing complex arrhythmic events. It is possible that autonomic assessment allows the identification of distinct risk subgroups. The objective of this study was to determine the baroreflex sensitivity (BRS) in patients with the indeterminate form of Chagas disease, (GI), and with the arrhythmogenic form of Chagas disease with nonsustained ventricular tachycardia (GII) and sustained ventricular tachycardia (GIII) and to assess the correlation between the severity of ventricular arrhythmia and the degree of BRS impairment. Methods: Forty-two patients were subjected to noninvasive cardiovascular monitoring using the Task Force® system. The phenylephrine method was used to determine BRS, 24- hour dynamic electrocardiography was used to analyze heart rate variability (HRV) over time and echocardiography was used to determine LVF. Results: A statistical difference was observed between the groups regarding their BRS to phenylephrine. GIII presented the lowest BRS value (6.09 ms/mmHg) when compared with GII (11.84ms/mmHg) and GI (15.23ms/mmHg). After multiple comparisons among the groups, a significant difference was found between GI and GIII (p=0.01). When BRS was correlated with ventricular extrasystole (VE) density, all patients who had low VE density (<10/hour) had preserved BRS (6.1ms/mmHg). On the other hand, only 59% of those with high EV density (>10/hour) had preserved BRS (p=0.003). In patients with moderately depressed BRS (3.0-6.0 ms/mmHg) there was a greater density of EV (p=0.01). Patients with preserved BRS had preserved or moderately compromised LVF (66.7% with LVF<40% and 79.5% with LVF40%; p=0.62) as had patients with moderately depressed BRS (15.4% with LVF<40% and 33.3% with LVF40%; p=0.46). There was no correlation between BRS and LVF. When the logistic regression model was applied, only BRS influenced the presence of sustained ventricular tachycardia (p=0.028). Conclusion: BRS is preserved in indeterminate Chagas disease and diminished in the arrhythmogenic form. The BRS impairment is progressive as the disease progresses, being more evident in patients with more complex ventricular arrhythmias. The degree of autonomic dysfunction did not correlate with ventricular function but with the density and complexity of the arrhythmias

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde pública, afetando principalmente a população de baixa renda, o que a torna negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente, existe apenas um fármaco disponível para o tratamento, o benzonidazol, porém este apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. O ácido ursólico, um triterpeno de origem natural, possui atividade tripanocida, porém, sua solubilidade aquosa baixa limita sua biodisponibilidade. Para o aumento da biodisponibilidade tem destaque o uso das dispersões sólidas, onde fármacos lipofílicos são dispersos molecularmente ou no estado amorfo em carreadores hidrofílicos, acarretando um aumento do perfil de dissolução. Neste trabalho, dispersões sólidas e misturas físicas contendo ácido ursólico foram preparadas com os carreadores polietilenoglicol 6000, Gelucire 50/13 e dióxido de silício coloidal, Poloxamer 407 e caprato de sódio, empregando as técnicas de fusão e evaporação do solvente. Os sistemas foram caracterizados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia do infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria exploratória diferencial, microscopia em hot stage e difratometria de raios-X. Em outra etapa, os produtos foram avaliados quanto à solubilidade aquosa, perfil de dissolução in vitro, citotoxicidade em linhagem celular LLC-MK2, e atividade tripanocida em modelo animal. Em conjunto, os resultados mostraram que o fármaco não teve suas propriedades afetadas pela manipulação em misturas físicas, mantendo sua estrutura cristalina. Por outro lado, os experimentos de difratometria de raios-X e as observações microscópicas em hot stage revelaram a alteração do ácido ursólico para o estado amorfo, principalmente para os sistemas preparados pelo método do solvente, enquanto que algumas formulações manipuladas pelo método da fusão exibiram alterações polimórficas. Além disso, evidenciaram-se interações intermoleculares do tipo ligações de hidrogênio para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente. As alterações do fármaco observadas para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente aumentaram sua solubilidade e melhoraram seu perfil de dissolução comparado às dispersões sólidas pelo método da fusão e misturas físicas, sendo este aumento maior para os sistemas compostos por Poloxamer 407 + caprato de sódio, seguido por Poloxamer 407, Gelucire 50/13 + dióxido de silício coloidal e PEG 6000, o que pode ser atribuído ao poder tensoativo dos três primeiros carreadores. As formulações mostram-se seguras até a concentração de 128 ?M do fármaco, através da avaliação da citotoxicidade. Por último, o ursólico teve um aumento significativo da atividade tripanocida para a formulação composta pelo tensoativo Poloxamer 407 junto com o promotor de absorção oral caprato de sódio, manipulada pelo método do solvente, sugerindo o aumento da biodisponibilidade do fármaco. / Chagas disease represents a severe problem in public health, affecting mainly the low-income population, making it neglected by the pharmaceutical industry. Currently, there is only one drug available for treatment, benznidazol, however, it presents limited efficacy and is associated with several side effects. Ursolic acid, a naturally occurring triterpene, presents trypanocidal activity, but its low water solubility limits the bioavailability. To increase the biovailability, solid dispersions, where lipophilic drugs are molecularly or in the amorphous state dispersed in hydrophilic carriers, can play an important role, resulting in enhanced dissolution profile of the drug. In this work, solid dispersions and physical mixtures containing ursolic acid were prepared with Polyethyleneglycol 6000, Gelucire 50/13 and silicon dioxide, Poloxamer 407 and sodium caprate as carriers, employing the fusion and solvent evaporation techniques. The products were characterized through scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry, hot stage microscopy and X-ray diffractometry. In another step, the formulations were evaluated regarding the aqueous solubility, in vitro dissolution profile, citotoxicity using LLC-MK2 cell line, and trypanocidal activity in animal model. Together, results showed that the drug did not suffer any change in its properties when in physical mixture. On the other hand, X-ray diffractometry and hot stage microscopy revealed a transition from the crystalline to the amorphous state for ursolic acid, especially for the products prepared by the solvent method. In the fusion method, some formulations exhibited a polymorphic change. Moreover, we identified intermolecular interactions between drug and carrier by hydrogen bonding in the products prepared by the solvent method. These changes observed for solid dispersions prepared by the solvent method resulted in increased water solubility and dissolution profile and these effects were higher for the products prepared with Poloxamer 407 + sodium caprate, followed by Polomer 407 alone, Gelucire 50/13 + silicon dioxide and PEG 6000, which can be attributed to the surfactant property of the three first carriers. The formulations were safe up to 128 ?M of the drug, showed by the citotoxicity evaluation. Very importantly, we highlight that ursolic acid had a significant increase in the trypanocidal activity for the product prepared with the surfactant Poloxamer 407 and the penetration enhancer sodium caprate, prepared by the solvent method, suggesting that in this composition ursolic acid was more bioavailable.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

A Doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi1, transmitida aos humanos principalmente pelas fezes contaminadas de insetos triatomídio. Esta patologia permanece endêmica na América Latina com grande impacto socioeconômico. O envolvimento cardíaco é a principal causa de morte, sendo que a fisiopatologia e a evolução clínica da doença não são completamente compreendidas e a estratificação de risco permanece desafiadora. A presença de disfunção miocárdica associada ou não à doença arterial aterosclerótica vem acompanhada de áreas de fibrose miocárdica e tem se mostrado como importante fator de pior prognóstico. Ressonância Magnética (RM) é um método já consagrado na detecção de fibrose miocárdica pela técnica de realce tardio (RT). Os objetivos deste trabalho foram: identificar e quantificar a área de realce tardio em pacientes com Cardiopatia Chagásica e disfunção contrátil do ventrículo esquerdo por meio da Tomografia Coronária; associar a extensão do RT pela tomografia com a FE do ventrículo esquerdo, medida pela ecocardiografia; determinar se há ou não associação da presença e extensão do realce tardio com a presença de coronariopatia significativa; determinar a presença de aterosclerose coronária neste subgrupo de pacientes chagásicos por meio do escore de cálcio; e identificar a presença de coronariopatia obstrutiva nesta população. Foram selecionados 36 pacientes com o diagnóstico confirmado de Doença de Chagas e disfunção ventricular (FE< 50%) confirmada pela ecocardiografia que respeitaram os critérios de inclusão e exclusão, e que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os pacientes foram submetidos a angiotomografia coronária com a técnica de realce tardio e escore de cálcio. Todos os pacientes completaram o protocolo sem efeitos adversos com dose de radiação média de 11,17 +- 1,26 mSv e com exames interpretáveis. Observadores cegos e independentes, sem conhecimento prévio dos dados clínicos ou dos exames, realizaram análise visual e quantitativa do grau de estenose coronária, do escore de cálcio e do realce tardio. A média da idade foi de 57,5+- 8, dos quais 61,1% eram mulheres. A média da FE foi de 38,19 +- 6,91. Foram encontradas 2 lesões significativas (>50%) em 2 pacientes. A média do escore de cálcio foi de 19,06 +- 40,72. A fibrose miocárdica foi observada em 86,1% dos 36 pacientes e sua quantificação foi realizada de acordo com o esquema de segmentação miocárdica segundo a orientação da American Hear Association. A partir dos nossos achados, concluímos que, por meio da Tomografia coronária, é possível identificar áreas de fibrose miocárdica em pacientes chagásicos, que a quantidade de fibrose é inversamente proporcional à fração de ejeção ventricular esquerda (r= 0,52 p = 0,0011) e que a fibrose segue um padrão de localização específico da doença. Nossos achados permitem também inferir que a fibrose miocárdica nesse grupo de pacientes não se correlaciona à presença de obstruções coronárias, sendo o padrão de realce tardio diferente daquele observado em portadores de doença arterial coronária. Não houve correlação entre o escore de cálcio e áreas de fibrose vistas pela técnica de realce tardio (r= 0,04 p= 0,80). Desta forma, a tomografia pode ser uma alternativa à RM para a pesquisa de fibrose em pacientes chagásicos, aspecto que pode ser particularmente relevante naqueles que apresentam contraindicação formal à realização deste exame. / Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi1. It is transmitted to humans mainly by the infected feces of triatomine insects. This pathological condition remains endemic in Latin America, posing a major socioeconomic impact on the region. Cardiac involvement is the principal cause of death of patients, given that the physiopathological mechanism and clinical evolution of the disease are not fully understood and risk stratification remains a challenge. Whether associated with arteriosclerotic vascular disease or not, the presence of myocardial dysfunction is accompanied by areas of myocardial fibrosis and has emerged as an important factor associated with poor prognosis. Magnetic resonance (MR) imaging is a well-established method of detecting myocardial fibrosis by the delayed enhancement (DE) technique. Objectives: The objectives of this thesis are to identify and quantify DE areas on left ventricular contractile dysfunction patients with chagasic cardiopathy using coronary tomography, to associate tomography DE extension with left ventricular ejection fraction (EF) measured by echocardiography, to determine whether the presence and extension of DE are associated with the presence of significant coronaropathy, and to identify the presence of obstructive coronaropathy in chagasic patients. Background: Methods: Thirty six patients with confirmed Chagas disease and ventricular dysfunction diagnosis (EF < 50%), as verified by echocardiography. All the patients underwent coronary computed tomographic (CT) angiography using DE technic. All the patients successfully completed the protocol with a mean radiation dose of 11.17 1.26 mSv, without adverse effects and undergoing measurable tests. Independent observers blinded to the clinical data or examinations of the patients performed visual and quantitative analyses of the degree of coronary stenosis, and DE. Results: The mean age was 57.5 8 years, and 61.1% of them were female. The mean EF was 38.19 6.91%. Two significant lesions (>50%) were identified in two patients. Myocardial fibrosis was observed in 86.1% of the 36 patients, and its quantification was assessed in accordance with the myocardial segmentation scheme and the American Heart Association guidelines The amount of fibrosis is inversely proportional to left ventricular EF (r = 0.52, p = 0.0011), and that the myocardial fibrosis in these patients follows the specific localization pattern of Chagas disease. Our findings reveal that myocardial fibrosis in this patient sub group was not related to coronary obstruction and that the DE pattern is different from the one found in patients who presented ischemic events. Computed tomography DE is also inversely related to left ventricle ejection fraction, another important prognosis marker. Therefore, computed tomography can provide an adequate alternative to MR in the assessment of myocardial fibrosis particularly in patients presenting formal contraindications to MR.

Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, o sistema endócrino exerce importante influência no direcionamento da resposta imune do hospedeiro. A prolactina é um dos diversos hormônios envolvidos em uma série de complexas interações com o sistema imunológico, participando diretamente do processo de imunorregulação. As pesquisas relacionadas com a administração de hormônios em modelos experimentais infectados por T. cruzi visam comprovar a modulação dos mecanismos de defesa por estas substâncias e contribuem para a busca de novas terapias auxiliares e melhorias no tratamento convencional da Doença de Chagas. O objetivo deste trabalho foi elucidar o papel da prolactina na modulação do sistema imune durante a fase aguda da doença de Chagas experimental, através da administração desta substância em ratos Wistar jovens infectados com a cepa Y de T.cruzi. O envolvimento e o perfil de ativação das células de defesa durante a infecção aguda foram analisados, utilizando-se ensaios de linfoproliferação, apoptose de linfócitos e análise de marcadores celulares. Além disso, outros parâmetros imunológicos também foram avaliados, entre eles, citocinas intracelulares IFN-?, TNF-?, IL-4 e IL-10, quimiocina MCP-1 e óxido nítrico. Os animais submetidos ao tratamento com prolactina apresentaram redução significativa na parasitemia sanguínea, bem como diminuição na apoptose celular e elevados percentuais de células essenciais na resposta imune do hospedeiro frente ao parasita. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho demonstram os efeitos estimulatórios da prolactina e corroboram a ideia da utilização de substâncias imunomoduladoras no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que possam promover o equilíbrio da resposta imune do hospedeiro frente à infecção, prevenindo os possíveis danos teciduais observados tanto na fase aguda como crônica da doença de Chagas. / During the course of infection by Trypanosoma cruzi, the host immune system is involved in distinct, complex interactions with the endocrine system, and prolactin (PRL) is one of several hormones involved in immunoregulation. Numerous studies have demonstrated that the modulation of the immune system with the administration of regulatory hormones in different experimental models infected with T. cruzi, are very important inciting the investigation of new therapies for Chagas\' disease. The role of PRL as a possible factor in the modulation of the immune response was the target of this study using as animal model young rats infected with the Y strain of T. cruzi, in the attempt to demonstrate the relationship between the neuroendocrine system and the immune response involved in the acute phase of the experimental Chagas\' disease. For this purpose, some immune parameters were analyzed: dosages of cytokines IFN-?, TNF-?, IL-4, IL-10 and chemokine MCP-1, phenotypic analysis of cell subsets by flow cytometry, production of nitric oxide, lymphoproliferation and apoptosis of splenocytes. Therapy with PRL caused a significant decrease in parasitemia during the acute phase. PRL also triggered an increase in the percentage of cells of the innate and adaptive immune response and decreased apoptosis. Thus, the data obtained in this study corroborate the idea of using substances such as PRL in the development of new therapeutic strategies that can modulate the inflammatory response, contributing to the balance of the host body against infection, preventing the possible tissue damage observed in both acute and chronic Chagas\' disease.

O controle do parasita na fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi se dá principalmente por uma resposta mediada por anticorpos, uma resposta celular TH1 e uma resposta mediada por linfócitos T CD8. Na fase crônica, co-existem linfócitos T CD8 com fenótipo CD8Low CD45RCLow (CD8LL que apresentam marcadores de células sensibilizadas pelo antígeno) junto com células CD8High CD45RCHigh (CD8HH, que em grande parte apresentam fenótipo de célula naive). Células CD8High CD45RCLow (CD8HL) podem ser também observadas. As células CD8LL se apresentam no camundongo independente da cepa de T. cruzi infectante. Verificou-se que na sua grande maioria as células CD8LL tem fenótipo de células em repouso, baixa expressão de CD62L baixa expressão de CD127 (CD62LLOWCD127LOW), sendo estas as características de células efetoras de memória (EM). Este tipo celular ainda pode chegar a expressar marcadores de células NK de significado incerto. Observa-se, na análise funcional, que na estimulação in vitro das células CD8 com anticorpos anti-CD3/CD28 há uma recuperação baixa de CD8 por provável morte por AICD. Este fato é reforçado pelo aumento da ligação à anexina nas células sobreviventes, bem como através da expressão de CD69. Estudos anteriores relataram que o número de células CD8 diminuía após desafio in vivo com o parasita; porém o observado foi uma diminuição das células CD8LL na estimulação inespecífica in vivo com Poli-IC, um ligante de TLR-3. O desafio in vivo com antígeno de tripanossoma na cavidade pleural ocasiona uma migração preferencial de células CD8 e entre estas migram células de fenótipos CD8LL e CD8HL. No entanto, ao contrário do esperado, este estímulo resulta em uma diminuição da expressão de CD69 nas células CD8 infiltrantes. Visando determinar in vivo o papel protetor das células CD8, em um primeiro momento células de baço total foram tranferidas para camundongos sadios e, após a infecção com T. cruzi, observou-se um controle parcial da infecção, caracterizado por um retardo no pico de parasitemia e diminuição na intensidade de infecção, evidenciando um papel protetor parcial in vivo. Na determinação de fatores envolvidos na geração e manutenção das células CD8LL, observou-se que os camundongos deficientes em CD28, INOS ou CD4 têm geração normal de células CD8LL. Os camundongos IL-12p40-KO têm uma deficiência parcial na geração de células CD8LL. Já os camundongos deficientes em INF-gama, por sua vez, possuem uma deficiência acentuada destas células, apesar de que a diminuição poderia se dever a um aumento da necessidade periférica. Por outro lado, os camundongos IL-12p40-KO e INF-gama-KO desenvolvem um quadro neurológico sub-agudo progressivo, onde as células CD8 infiltrantes na medula espinhal apresentam um fenótipo misto CD8LL e CD8HL, e não são anérgicas, por sinal. / The control of the parasite in the chronic phase of infection by Trypanosoma cruzi occurs mainly by an antibody response mediated by a TH1 response and a cellular response mediated by CD8 T lymphocytes. In the chronic phase, co-exist with CD8 T lymphocyte phenotype CD8Low CD45RCLow (CD8LL showing markers of cells sensitized by antigen) with cell CD8High CD45RCHigh (CD8HH which have largely naive cell phenotype). Cells CD8High CD45RCLow (CD8HL) can also be observed. CD8LL cells were present in mice independent of the strain of T. cruzi infecting. It was found that in most cells CD8LL cell phenotype is at rest, low expression of CD62Llow expression of CD127 (CD62LLOWCD127LOW), which are the characteristics of effector memory cells (MS). This cell type can still get to express markers of NK cells of uncertain significance. There is, in functional analysis, which in vitro stimulation of CD8 cells with anti-CD3/CD28 antibodies there is a low recovery of CD8 by probable death IACD. This fact is reinforced by the increase in connection anexina cells survived, and through the expression of CD69. Previous studies reported that the number of CD8 cells decreased after in vivo challenge with the parasite, but the observed was a decrease in cell CD8LL the nonspecific stimulation in vivo with poly-IC, a ligand of TLR-3. The challenge with antigen in vivo of trypanosome in the pleural cavity causes a preferential migration of CD8 cells and between the migrating cells CD8LL phenotypes and CD8HL. However, unlike the expected, this stimulation results in a decrease in the expression of CD69 on CD8 cells infiltrating. To determine the in vivo protective role of CD8 cells in a first time total spleen cells were transferred to healthy mice and after infection with T. cruzi, there was a partial control of infection, characterized by a delay in peak parasitemia and decrease in intensity of infection, indicating a partial protective role in vivo. In determining the factors involved in the generation and maintenance of cells CD8LL, it was observed that mice deficient in CD28, iNOS and generation have normal CD4 cell CD8LL. The mouse IL-12p40-KO have a partial deficiency in the generation of cells CD8LL. But the mice deficient in INF-gamma, which in turn have a marked deficiency of these cells, although the decrease could be due to increased peripheral need. Moreover, the mice IL-12p40-KO and INF-gamma-KO develop a progressive neurological sub-acute, where the infiltrating CD8 cells in the spinal cord showed a mixed phenotype CD8LL and CD8HL, and are not anergic, by signal.

A Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é o elemento mórbido mais importante da Doença de Chagas e sua elucidação se tornou fundamental. Estudos da imunologia da CCC demonstram que o sistema imune desempenha um papel duplo no curso da doença, agindo de forma a controlar as formas parasitárias e ainda promovendo lesão tissular. Porém, pouco se sabe do papel das células estruturais, tais como os cardiomiócitos, no curso da doença. Sabe-se que, em outras patologias cardíacas, o IFN-&#947;, citocina produzida em abundância no coração dos pacientes com CCC, determina o priming de diversas populações celulares, modulando positivamente a sua resposta. Cardiomiócitos HL-1 e animais C3H/HePas foram primados com IFN-&#947; e desafiados com LPS para a dosagem de citocinas, simulando quadro agudo e crônico de infecção. Neste trabalho, determinamos que o IFN-&#947; modula positivamente a produção de diversas citocinas in vitro por células HL-1 (IP-10, MCP-1, G-CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) e também in vivo no coração (IP-10, KC, G-CSF, LIF e IL-6). Além disso, in vitro, o IFN-&#947; foi capaz de diminuir a produção de VEGF e GM-CSF em relação aos grupos tratados apenas com LPS. Os dados corroboram a literatura e permitem concluir que os cardiomiócitos são capazes de participar ativamente da resposta inflamatória no coração e que são sensíveis aos produtos da mesma. O trabalho serve ainda de base para novos estudos sobre o perfil de citocinas expressas no coração no curso da infecção por T. cruzi e como os cardiomiócitos participam da resposta inflamatória em questão. / Chronic Chagasic Cardiomyopathy (CCC) is the most morbid element of Chagas Disease, the elucidation of its physiopathology being fundamental. However, little is known about the role of structural cells, such as cardiomyocytes, in the course of the disease. In other cardiac pathologies, it has been shown that IFN-&#947; determines the priming of several resident populations, positively modulating their response. In this work, HL-1 cardiomyocytes and C3H/HePas mice were primed with IFN-&#947; (in brief or extended protocols) and challenged with LPS, the cytokines produced being measured in the supernatants. We observed that IFN-&#947; positively modulates the in vitro production of many cytokines by HL-1 cells (IP-10, MCP-1, G- CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) and also their in vivo production at the heart (IP-10, KC, G-CSF, LIF and IL-6). Besides, IFN-&#947; was able to decrease the LPS-induced production of VEGF and GM-CSF by HL-1 cells. Our data allow us to conclude that cardiomyocytes actively participate in the inflammatory response of the heart, being sensitive to products released by professional immune cells. This work may serve as a basis for further studies on the profile of the cytokines secreted in the heart tissue along the course of cardiac inflammation.