Chagas disease is caused by the parasite Trypanosoma cruzi and transmitted by multiple triatomine vectors across the Americas. In Central America, the predominant vector is Triatoma dimidiata, a highly adaptable and genetically diverse Hemiptera. In this research, we used a novel reduced-representation DNA sequencing approach to discover community dynamics among multiple biotic factors associated with Chagas disease in Central America, and assess the infestation patterns of T. dimidiata after seasonal and chemical disturbances in Jutiapa, Guatemala. For our first study, we used a hierarchical sampling design to obtain multi-species DNA data found in the abdomens of 32 T. dimidiata specimens from Central America. We aimed to understand (1) the prevalence of T. cruzi infection, (2) the population genetics of the vector and parasite, (3) the blood meal history of the vector, and (4) gut microbial diversity. Our results indicated the presence of nine infected vectors harboring two distinct DTUs: TcI and possibly TcIV. We found significant clusters among T. dimidiata populations in countrywide and within-country levels associated with sylvatic ecotopes and diverse domestic genotypes. There was significantly higher bacteria species richness in infected T. dimidiata abdomens than those that were not infected, with further analysis suggesting that gut bacteria diversity relates to both T. cruzi infection and the local environment. We identified vertebrate blood meals from five T. dimidiata abdomens including chicken, dog, duck and human; however, additional detection methods are necessary to confidently identify blood meal sources. In our second study, we analyzed the GBS genotypes of 440 T. dimidiata specimens collected in two towns of Jutiapa, Guatemala. Our aim was to assess (1) the domestic population patterns that aid the recovery of T. dimidiata after an insecticide treatment in El Carrizal and (2) the seasonal changes that regulate the dispersal of the vector in the untreated communities of El Chaperno. Results showed that the insecticide application was effective at reducing the population abundance immediately after the application in El Carrizal; nevertheless, 18-month post-treatment the town-wide infestation and genetic diversity were recovering. Within-house relatedness among specimens recovered 18 months post-treatment, suggesting that the insecticide treatment failed to fully eliminate domiciliated colonies. In contrast, lack of change in abundance or genetic diversity in El Chaperno implied absence of dispersers from sources beyond the town periphery, while evidence of a decrease of relatedness among individuals implied dispersal among houses. After the insecticide treatment in El Carrizal, population reduction led to lack of genetic spatial autocorrelation; nevertheless, rapid dispersal into neighboring houses lead to autocorrelation 18 months after the insecticide treatment. This pattern was also observed in El Chaperno, where an increase in spatial autocorrelation during seasonal dispersal suggests spillover to close-by households. The creation of a novel genomics pipeline allowed us to understand community and dispersal patterns of T. dimidiata and other biotic factors important for the prevalence and transmission of Chagas disease at local and regional levels. Future studies should include complementary approaches for taxa verification (e.g. bacteria 16S barcoding, PCR-base detection), as well as expand the scope of local population analyses to peridomestic and sylvatic genotypes that could suggest a broader range of vector sources and region-wide patterns of temporal and spatial dispersion.

Orientador: Artur Torres Cordeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T07:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ranzani_AmericoTavares_M.pdf: 3887425 bytes, checksum: 3ae590890f0f321ec227cb9c0967c6de (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Tripanossomíases são enfermidades associadas à infecção por protozoários do gênero Trypanosoma. Estas doenças são normalmente tratadas com medicamentos de alta toxicidade e baixa eficiência. A pesquisa de novos compostos que atuem de maneira específica contra alvos metabólicos pré-estabelecidos pode levar ao desenvolvimento de fármacos mais eficientes no tratamento destas enfermidades. A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) é um alvo metabólico validado experimentalmente em Trypanosoma brucei. A G6PD catalisa o primeiro passo da via de síntese de pentoses que supre a célula com ribose-5-fosfato para síntese de bases nitrogenadas e NADPH para biosíntese de lípideos, colesterol e neutralização de espécies reativas de oxigênio. O esteróide desidroepiandrosterona (DHEA) e seus análogos são conhecidos inibidores incompetitivos da enzima humana e recentemente foram caracterizados também como potentes inibidores da G6PD de T. brucei e T. cruzi. Estes esteróides também apresentam efeito citotóxico à forma sanguínea de T. brucei e à forma epimastigota de T. cruzi. Em conjunto, estes resultados sugerem que esteróides análogos do DHEA devam ser explorados como uma nova classe de fármacos antiparasitários. Apesar de já haver estruturas da enzima, o sítio de ligação destes esteróides não é conhecido, informação que ajudaria no desenho racional de novos inibidores. Assim, este projeto teve como objetivo principal a identificação do sítio de inibição por cristalografia. Conseguiu-se estabelecer um protocolo de expressão, purificação e cristalização para a G6PD humana. Testou-se a co-cristalização, seeding e soaking com os esteróides DHEA, epiandrosterona (EA) e 16-bromo-epiandrosterona (16BrEA) com os substratos da enzima, além de outros complexos com frutose-6-fosfato, glucosamina-6-fosfato e NADPH. Na tentativa de diminuir a atividade da enzima para facilitar a cristalização com os substratos e os esteróides, fez-se o mutante D200N, que além de ser menos ativo, também apresentou uma menor inibição pelos esteróides. A enzima humana se apresenta como um equilíbrio de dímero e tetrâmero, não se sabendo a influência destes estados na atividade da enzima. Assim, para favorecer somente um estado oligomérico, foram avaliadas mutações na interface do tetrâmero. A mutação A277C permite a formação de uma ponte dissulfeto com a C294, estabilizando o tetrâmero. A mutação E347A é capaz de desestabilizar o tetrâmero, favorecendo a forma dimérica. Embora não tenha sido possível obter a estrutura da enzima com os esteróides, conseguiu-se pela primeira vez apontar para um resíduo importante para a inibição, o que abre oportunidade para investigações futuras que podem levar à descrição do sítio de inibição / Abstract: Trypanosomiases are infectious diseases caused by protozoan parasites from genus Trypanosoma. Such diseases are currently treated with low effective and highly toxic drugs. The research of novel compounds which inhibits validated metabolic targets might lead to the development of more efficient drugs to such neglected diseases. The enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) was experimentally validated as a metabolic target in T. brucei bloodstream form. G6PD catalyzes the first step of the pentose phosphate pathway (PPP), which supplies the cell with ribose-5-phosphate for synthesis of nucleotides and NADPH for biosynthesis of lipids, cholesterol and detoxification of reactive oxygen species. The steroid Dehydroepiandrosterone (DHEA) and analogues are known uncompetitive inhibitors of the human G6PD and recently they were also characterized as potent inhibitors of T. brucei and T. cruzi G6PD. It was also demonstrated that these steroids are toxic to cultured T. brucei bloodstream form and T. cruzi epimastigote form. Together these results suggest that DHEA derivatives must be explored as a novel anti-parasite drug class. Although the structure of the enzyme is solved, the binding site of these steroids is unknown, information that would help in the rational design of new inhibitors. So, the main goal of this project was the identification of the inhibition site by crystallography. It was established an expression, purification and crystallization protocol for the human G6PD. It was tried the co-crystallization, seeding and soaking of the steroids DHEA, epiandrosterone (EA) and 16-bromo-epiandrosterone (16BrEA) with the substrates of the enzyme, beyond other complexes with fructose-6-phosphate, glucosamine-6-phosphate and NADPH. Attempting to diminish the enzyme activity to facilitate the crystallization with the substrates and the steroids, it was made the mutant D200N, which not only is less active, but it's also less inhibited by the steroids. The human enzyme is in equilibrium between dimer and tetramer, being unknown the effect of these states to the enzyme activity. This way, to favor one oligomer state, it was assessed mutations at the tetramer interface. The mutation A277C allows the formation of a disulfide bond with the C294, stabilizing the tetramer. The mutation E347A is able to destabilize the tetramer, favoring the dimer. Although it was not possible to determine the structure of the enzyme with the steroids, for the first time it was shown the involvement of a residue in the steroid inhibition, which makes possible future investigations that can lead to the inhibition site description / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestre em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

O selênio (Se) é um micronutriente importante na dieta de mamíferos e tem sido descrito com importante papel na função imune. É constituinte de mais de 25 selenoproteínas na forma do aminoácido selenocisteína, sendo este elemento crítico na manutenção do sistema de defesa antioxidante. Uma dieta complementar com Se pode ser benéfica no tratamento de doenças correlacionadas com altos níveis de estresse oxidativo, como a doença de Chagas, enfermidade negligenciada causada por Trypanosoma cruzi. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do Se em ratas Wistar prenhas infectadas pela cepa Y de T. cruzi. O tratamento com Se desencadeou aumento no peso e comprimento fetal, bem como no diâmetro e peso placentário. Também foi observada diminuição da parasitemia. Não ocorreram alterações significativas nas concentrações de NO e no número de ninhos de amastigotas no coração. A avaliação histológica das placentas mostrou elevado número de ninhos de amastigotas nos animais do grupo infectado e tratado. A redução da concentração de citocinas pró-inflamatórias e de populações de células T desencadeou uma resposta voltada ao padrão Th-2, característico da gestação, fato que provavelmente contribuiu no aumento do parasitismo placentário encontrado nos animais tratados com Se. Assim, é possível que a administração de Se, durante a prenhez, poderia alterar a resposta imune placentária local, favorecendo a instalação do parasita. Mais estudos são necessários para avaliar a interação entre o Se e a doença de Chagas durante a prenhez. / The selenium (Se) is an essential micronutrient in the diet ofmammals and has an important role in the immune function. A range of 25 selenoproteinshas Sein its structure and most of them in the form of amino acid selenocysteine, being this element involved in the in maintenance of the antioxidant defense. Diet with Se is beneficial in the treatment of diseases correlated with high levels of oxidative stress, like Chagas\' disease, a neglected illness caused by Trypanosoma cruzi. The objective of this study was to evaluate the effects of selenium in the immune response of pregnant Wistar rats infected withtheY strain of T. cruzi. Se treatment triggered enhanced fetal weight and length and placental diameter and weight. It was observed decreased parasitemia. No significant alterations in NO concentrations and amastigote nests in heart were observed. The histological evaluation of placenta displayed an enhanced number of amastigote nests in infected and Se treated animals. The reduction of pro-inflammatory cytokines and T cell populations triggered a Th-2 immune response, which is the hallmark of the gestation period. This fact probably led to the raise in parasite nests in placenta of infected and Se treated animals. So it is possible that the Se supplementation during pregnancy could impair the local placental immune response. Further studies are needed to assess the interaction between selenium and the acute Chagas\' disease during pregnancy.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor λgt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com β-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em λEMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector λgt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as β-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a λEMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

A doença de Chagas acomete entre 6 e 7 milhões de pessoas ao redor do mundo e acredita-se que a mesma seja responsável por 10.000 mortes/ano. A disponibilidade limitada de testes sorológicos sensíveis, específicos e rápidos para a doença dificulta o diagnóstico e o início precoce do tratamento em áreas endêmicas e não endêmicas. Neste estudo, realizou-se a validação de um teste imunocromatográfico rápido para detecção de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). O desempenho do kit foi comparado ao de um kit comercial que utiliza a mesma metodologia (Comercial A) e às técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Foram testadas 664 amostras de soro, as quais foram classificadas como reagentes e não reagentes considerando os resultados concordantes entre as metodologias de ELISA e IFI. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade de 98,5% e especificidade de 99,7%. Utilizando uma amostragem menor (n = 395), o desempenho desse teste rápido foi comparado ao do kit Comercial A. Nesta análise, o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou uma sensibilidade de 98,1% e especificidade de 99,6%, ao passo que os valores de sensibilidade e especificidade encontrados para o kit Comercial A foram 98,7% e 99,6%, respectivamente. Por utilizarem antígenos recombinantes em suas composições e serem realizados em uma única etapa, os testes imunocromatográficos apresentaram sensibilidade inferior aos testes sorológicos convencionais. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade inferior ao kit Comercial A, o que pode ser explicado pelo volume menor de amostra utilizado no primeiro kit e pela reatividade do antígeno recombinante impregnado nos testes. Quando comparado com a literatura, nota-se que o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou desempenho similar ou superior ao de outros testes rápidos disponíveis no mercado (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). A sensibilidade analítica do teste avaliado foi de 0,235 UI/mL, e o kit mostrou ser mais específico frente a amostras reagentes para leishmaniose tegumentar do que a técnica de IFI. O teste manteve seu bom funcionamento oito meses após sua fabricação e após ter sofrido estresse de temperatura. Os resultados desse estudo sugerem que o kit Imuno-Rápido Chagas é capaz de detectar anticorpos da classe IgG anti-T. cruzi, apresentando valores de sensibilidade e especificidade comparáveis aos de outros testes comerciais. Sendo assim, o kit pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas. / Around 6 to 7 million people are infected by Chagas disease worldwide, and it is believed that this disease is responsible for 10,000 deaths/year. The lack of sensitive, specific and rapid serological tests for the disease hampers the diagnosis and the start of early treatment in endemic and non-endemic areas. This study validated a rapid immunocromatographic test for detection of IgG antibodies anti-T. cruzi (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). The kit\'s performance was compared to a commercial kit that uses the same methodology (Comercial A), to ELISA and to Indirect Immunofluorescence technique (IFI). A total of 664 serum specimens were tested, which were classified as reactive or non-reactive according to concordant results between ELISA and IFI. The sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.5% and 99.7%, respectively. The performance of this rapid test was compared to Comercial A using a smaller sampling (n = 395). At this analysis, the sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.1% and 99.6%, while the sensitivity and specificity of Comercial A kit were 98.7% and 99.6%, respectively. The immunochromatographic tests have shown lower sensitivity compared to conventional serological tests probably because they use recombinant antigens in their system and are performed in one-step. The Imuno-Rápido Chagas kit has shown lower sensitivity than Comercial A kit, which can be explained by the smaller amount of sample that is used in the first kit and by reactivity of the recombinant antigens used in the tests. Once compared to literature, Imuno-Rápido Chagas kit had the same or better performance than other commercial rapid tests available in the market (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). The analytical sensitivity of the evaluated test in this study was 0.235 IU/mL, and the kit has shown a higher specificity than IFI regarding cutaneous leishmaniasis reactive samples. The test has maintained its good performance eight months after its manufacturing and after a temperature stress. The results of this study indicate that Imuno-Rápido Chagas kit is able to detect IgG antibodies anti-T. cruzi, showing sensitivity and specificity values comparable to other commercial tests. Therefore, the kit can be used to help on diagnosis of chronic phase of Chagas disease.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas (DC) persiste como um importante problema de saúde na América Latina, onde o envolvimento cardíaco é responsável pela elevada morbidade e mortalidade. A identificação dos pacientes de maior risco representa, portanto, um grande desafio. A ressonância magnética cardiovascular (RMC) é uma metodologia de elevada acurácia na avaliação da morfologia e da função ventricular e permite a detecção da fibrose miocárdica pela técnica do realce tardio, podendo ser útil na estratificação de risco dos pacientes chagásicos. OBJETIVOS: Avaliar as características morfológicas e funcionais dos ventrículos esquerdo e direito nas formas clínicas da DC; avaliar a fibrose miocárdica pela RMC e sua relação com as formas clínicas da DC; investigar o valor prognóstico da fibrose miocárdica, através de sua correlação com o escore de Rassi. MÉTODOS: Foram estudados 39 pacientes, sendo 20 do sexo masculino. A população de pacientes foi dividida em dois grupos: com cardiopatia aparente (CCA) e sem cardiopatia aparente (SCA). Todos os pacientes foram submetidos a estudo de RMC para avaliação morfológica e funcional; e detecção da fibrose miocárdica. Visando à obtenção do escore de Rassi, os pacientes realizaram avaliação clínica, eletrocardiograma, radiografia do tórax, ecodopplercardiograma e eletrocardiografia dinâmica de 24 horas (Holter). Os pacientes foram classificados, de acordo com o escore de Rassi, em: de baixo, de médio e de alto risco, e foi realizada a correlação desse escore com os parâmetros obtidos pela RMC. RESULTADOS: Os aspectos morfológicos e funcionais do VE apresentaram uma diferença significante entre as formas clínicas estudadas, e a quantificação de fibrose miocárdica na DC apresentou uma forte correlação com o escore de Rassi (r=0,76 p<0,001). CONCLUSÕES: O ventrículo esquerdo apresentou comprometimento morfológico e funcional no grupo com cardiopatia aparente; a extensão da fibrose miocárdica foi maior no grupo com cardiopatia aparente; a quantificação de fibrose miocárdica pela RMC apresentou forte correlação com o escore de Rassi, denotando o valor prognóstico da RMC nesse grupo de paciente chagásico / INTRODUCTION: Chagas disease (CD) still remains an important health problem in Latin America. One of the major challenges is to identify high risk patients. Considering that magnetic resonance imaging (MRI) has a very high accuracy to assess morphology and ventricular function and that myocardial delayed enhancement (MDE) technique is well established to detect myocardial fibrosis, we believe that MRI may have an important role to stratify patients with CD. OBJECTIVES: Evaluate morphological and functional ventricular characteristics, as well as the extent of myocardial fibrosis (MF) in patients with Chagasdisease, by magnetic resonance imaging (MRI); and search the prognostic value of myocardial fibrosis detected by MRI, comparing these findings with the recently developed Rassi`s score. METHODS: 39 patients were evaluated (male sex = 20), divided in two main groups: a) with apparent cardiomyopathy (AC) and without apparent cardiomyopathy (WAC). All patients were submitted to MRI, using the technique of myocardial delayed enhancement (MDE) and the results were compared with the Rassi`s score (RS), which was obtained by analyzing the following parameters: 12-lead electrocardiogram, chest x-ray, echodopplercardiography and 24-hour dynamic electrocardiography (Holter). Patients were stratified as belonging to the low, medium or high risk group, and then each one was compared with data obtained by MRI. RESULTS: Regarding the morphological and functional analysis, significant differences were observed in both groups (p< 0.001). Furthermore, there was a strong correlation between the extent of myocardial fibrosis and the Rassi`s score (r= 0.76). CONCLUSIONS: MRI is an important technique in the evaluation of patients with CD, stressing morphological and functional differences in all clinical presentations. The strong correlation with the Rassi`s score and the extent of myocardial fibrosis detected by MRI, emphasizes its role in the prognostic stratification of patients with CD

Fundamento: A ativação da cascata inflamatória está presente na insuficiência cardíaca(IC). Existe relação entre esta ativação e estado protrombótico nesta síndrome. Dentre as etiologias de IC, a cardiomiopatia chagásica (CMC) parece ter maior ativação inflamatória e prognóstico mais reservado, possivelmente por especial risco para fenômenos tromboembólicos. A relação entre atividade inflamatória e protrombótica na cardiomiopatia chagásica e em outras etiologias é obscura. Objetivo: Estudar o perfil de marcadores protrombóticos e proinflamatórios em pacientes com insuficiência cardíaca chagásica comparando-os com os de etiologia não-chagásica. Métodos: Corte transversal. Critérios de inclusão: fração de ejeção do VE (FEVE) < 45% e tempo de início de sintomas > 1 mês. Os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo 1(G1) sorologias positivas para Chagas e grupo 2(G2) sorologia negativa para Chagas. Dosou-se como fatores proinflamatórios: fator de necrose tumoral-alfa (TNF-), interleucina-6 (IL-6) e proteína C reativa (PCR) ultrassensível; fatores protrombóticos: dímero D, P-selectina solúvel, antígeno do fator de von Willebrand, fibrinogênio, complexo trombina-anti-trombina(TAT), fator tecidual(FT) e tromboelastograma(TEG). A amostra foi calculada para poder de 90%, assumindo-se diferença de 1/3 de desvio-padrão entre os grupos; p significativo se < 0,05. Análise estatística: teste exato de Fischer para comparação de proporções; teste t de student não-pareado para variáveis contínuas de distribuição normal e teste de Mann-Whitney para variáveis contínuas de distribuição assimétrica. Realizada análise de co-variância para ajuste de potenciais influências de co-variáveis. Resultados: Entre 16 de janeiro de 2008 e 08 de abril de 2009, 287 pacientes com IC crônica foram consecutivamente selecionados em nível ambulatorial ou de internação, sendo 138 no G1 e 149 no G2. O G1 apresentava maior porcentual de pacientes internados, de CF III/IV, PA sistólica mais baixa, maior freqüência de RHJ, ascite, menor fração de ejeção e níveis mais altos de BNP. Por outro lado, a prevalência de HAS, DM e DLP foi superior no G2. Dos marcadores proinflamatórios, o TNF- foi maior no G1, independentemente de outros fatores de gravidade(p<0,0001). A IL-6, apesar de maior no G1, sofreu maior influência de outras variáveis de gravidade do que da etiologia chagásica. Os níveis de PCR ultrassensível estavam elevados em ambos os grupos embora sem diferença entre eles. Dentre os fatores protrombóticos o dímero-D(p<0,0001), o fator de von Willebrand(p<0,0001) e a P-selectina(p=0,0262) foram mais altos no G1 que no G2. Os níveis de FT e TAT foram semelhantes. O fibrinogênio foi mais alto no G2 que no G1(p=0,0424), assim como os parâmetros do TEG - MA(p=0,0044), G(p=0,0022) e TG(p=0,001), embora todos estivessem dentro dos limites de referência na maioria dos pacientes em ambos os grupos. Na análise de co-variância apenas o dímero-D e a P-selectina mantiveram-se diferentes entre os grupos, sendo que os níveis de P-selectina estavam normais na maioria dos pacientes de ambos os grupos. Conclusões: A atividade proinflamatória esteve aumentada nos pacientes com IC chagásica e não-chagásica. A inflamação medida pelo TNF- foi independentemente maior entre chagásicos.Observou-se maior estado protrombótico entre chagásicos medido pelo dímero-D, independentemente de outros fatores de gravidade. / Background: Inflammatory cascade activation is present in heart failure (HF). This activation is closely related to a prothrombotic state in this syndrome. Among HF etiologies, Chagas cardiomyopathy (CCM) seems to have greater inflammatory activation and worse prognosis, possibly because of special risk for thromboembolic phenomena. The relation of inflammatory and prothrombotic activity between CCM and other HF etiologies remains unclear. Objective: To assess the profile of prothrombotic and proinflammatory markers in patients with chagasic in comparison to non-chagasic systolic heart failure. Methods: Cross sectional study. Inclusion criteria: LV ejection fraction (LVEF) < 45% and time of symptoms onset > 1 month. Patients were divided into two groups: group 1 (G1) positive Chagas serology and group 2 (G2) negative serology. Proinflammatory factors determined: tumor necrosis factor (TNF-), interleukin-6(IL-6) and ultrasensitive C-reactive protein (CRP); prothrombotic factors: D-dimer, soluble P-selectin, von Willebrand factor(vWF), fibrinogen, thrombin-anti-thrombin complex(TAT), tissue factor(TF) and thromboelastography(TEG). Sample was calculated for an 90% power, assuming a difference of 1 / 3 of the standard deviation; p significant if < 0.05. Statistical analysis: Fischer exact test for proportions, non-paired Students t test for parametric continuous variables and Mann-Whitney test for non-parametric continuous variables. Covariance analysis was performed to adjust for possible covariables influence on results. Results: From january 16th to april 8th 2009, 287 chronic HF patients were consecutively included, 138 in G1 and 149 in G2. G1 showed larger proportion of inpatients, higher III/IV functional class, lower systolic blood pressure, higher frequency of hepatojugular reflux, ascites, lower left ventricle ejection fraction and higher levels of B-type natriuretic peptide (BNP). On the other hand, G2 had higher proportion of hypertension, diabetes and hypercholesterolemia. Among proinflammatory markers, TNF- levels were higher in G1, independently of other prognosis variables (p<0,0001). Although IL-6 levels were higher in G1, there was greater influence of other prognosis variables than chagasic etiology itself. CRP levels were above reference values but there was no difference between G1 and G2. Among prothrombotic markers, D-dimer(p<0,0001), vWF(p<0,0001) and soluble P-selectin(p=0,0262) levels were higher in G1 than in G2. TF and TAT levels were similar in both groups. Fibrinogen levels were higher in G2 than in G1 (p = 0.0424), as well as TEG parameters MA(p=0,0044), G(p=0,0022) and TG(p=0,001), even though all of them were in normal reference range in most patients in both groups. D-dimer and soluble P-selectin kept different among groups in covariance analysis. However, soluble P-selectin levels were in normal reference range in both groups. Conclusions: Proinflammatory activity was increased in both groups. Inflammation measured by TNF- was independently greater among CCM patients. Greater prothrombotic state measured by D-dimer was observed in CCM patients independently of other prognosis variables.

As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.