Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

Resumo não disponível

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La chitotriosidase (CHIT1) est une chitinase humaine appartenant à la famille glycosyl hydrolase 18 (GH18) qui hydrolyse la chitine. CHIT1 présente plusieurs caractéristiques enzymatiques conservées dans la famille GH18 qui ne sont pas complètement comprises. Pour renforcer nos connaissances sur le mécanisme catalytique de CHIT1 et de la famille GH18, j'ai amélioré la résolution des structures obtenues par diffraction de rayon-X du domaine catalytique de CHIT1. Ces structures correspondent à la forme apo de CHIT1, pseudo-apo ainsi qu’en complexe avec la chitobiose ont été obtenues à des résolutions comprises entre 0.95Å et 1.10Å. Mes résultats m’ont permis de proposer un nouveau mécanisme d’hydrolyse des chaines chito-oligosaccharidiques. En outre, grâce à une nouvelle stratégie de cristallisation, la première structure cristalline de CHIT1 complète a pu être obtenue à une résolution de 1.95Å. Mon étude donne de nouvelles perspectives sur le mode d'action de CHIT1 et les caractéristiques enzymatiques conservées dans la famille GH18. / Chitotriosidase (CHIT1) is a human chitinase belonging to the glycosyl hydrolase family 18 (GH18), a highly conserved enzyme family. GH18 enzymes hydrolyze chitin, a N-acetyl glucosamine polymer. CHIT1 is characterized by many enzymatic features that are conserved in GH18 and not completely understood. To increase our knowledge on the catalytic mechanism in CHIT1 and GH18 family, I improved the X-ray resolution crystal structure of CHIT1 catalytic domain in apo and pseudo apo forms as well as in complex with a synthetic substrate to a resolution range between 0.95Å and at 1.10Å. My results allow me to suggest a new mechanism for chito-oligosaccharide chains hydrolysis. Moreover, thanks to a new a crystallogenesis strategy, I obtained the first crystal structure of full length CHIT1 at 1.95Å resolution. My study presents many structural and mechanistic aspects of CHIT1 which gives new insights onto its mode of action and shed light into the conserved enzymatic features in GH18 chitinase family.