Ce travail de thèse s’intègre dans la stratégie développée et brevetée par l’UMR 990 INSERM/UdA, qui consiste à exploiter l’affinité d’un vecteur ammonium quaternaire chargé positivement pour les protéoglycanes, afin d’acheminer des agents de diagnostic et/ou de thérapie, pour la prise en charge du chondrosarcome. Du fait de son abondante matrice extracellulaire de nature chondrogénique, de sa faible vascularisation et de son environnement hypoxique, le chondrosarcome est une tumeur chimio- et radio-résistante. Le seul traitement efficace à ce jour reste la chirurgie qui possède un taux de survie à 10 ans de seulement 21% en cas de rechute et dans les formes les plus graves. Dans ce contexte, une prodrogue cytotoxique activable en hypoxie dérivée du cyclophosphamide, de type nitroimidazole (8-QA) et possédant un ammonium quaternaire, a été développée et évaluée in vitro et in vivo, comparativement à son équivalent non « quaternisé » (8) et à un équivalent « quaternisé » mais non activable en hypoxie (10-QA). In vitro, les études par résonance plasmonique de surface (SPR) ont montré que les deux prodrogues « quaternisées », 8-QA et 10-QA possédaient une affinité plus importante pour l’agrécane que la prodrogue 8 ne possédant pas le vecteur ammonium quaternaire. Par la suite, nous avons développé un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) des cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS qui reproduit le microenvironnement hypoxique et riche en protéoglycanes retrouvé dans les tumeurs du cartilage in vivo. Les molécules activables en hypoxie 8-QA et 8 ont une activité cytotoxique supérieure en situation d’hypoxie qu’en normoxie, avec une résistance aux traitements augmentée pour le modèle de sphéroïde comparativement aux cellules cultivées en 2-D. In vivo, sur un modèle de xénogreffe de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées sur des souris SCID, modèle préalablement caractérisé en terme d’hypoxie (imagerie photoacoustique, échographie de contraste, Doppler) et de protéoglycanes, la molécule 8-QA entraine (i) une inhibition significative de la croissance tumorale de 62,1%, alors que la molécule 8 et la molécule 10-QA n’ont aucune activité in vivo ; (ii) une diminution des effets indésirables, améliorant ainsi l’index thérapeutique. La caractérisation de l’activité antitumorale sur les tumeurs prélevées a mis en évidence une diminution de l’activité mitotique, une augmentation de l’apoptose (p53S15) et une diminution de la prolifération (PCNA) pour les échantillons traités avec la molécule 8-QA. De plus les études d’immunohistochimie ont montré que cette molécule entraine une augmentation des dommages à l’ADN (marquage γH2Ax) retrouvés majoritairement dans les régions hypoxiques (marquage au pimonidazole). La dernière partie de ce travail de thèse a consisté à optimiser, chez des souris NUDE, de nouveaux modèles in vivo de chondrosarcome humain exprimant à la fois un environnement hypoxique et une matrice extracellulaire riche en protéoglycanes pour affiner la caractérisation de l’activité anticancéreuse de la molécule 8-QA. Pour cela nous avons développé un modèle de xénogreffe de sphéroïdes HEMC-SS implantés en situation sous cutanée et un modèle orthotopique de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées en position paratibiale. Après caractérisation, les premiers résultats d’efficacité antitumorale sur ces deux modèles ont confirmé une activité prometteuse de la molécule 8-QA. En conclusion, ces travaux de thèse auront permis de démontrer que l’exploitation des caractéristiques phénotypiques du chondrosarcome par une approche bi-spécifique est une stratégie prometteuse pour la prise en charge thérapeutique de cette pathologie, certes rare mais redoutable. Il a également contribué à montrer l’importance de l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement pour la réponse aux traitements de chimiothérapie. / This work takes place in the strategy developed and patented by our lab UMR 990 INSERM/UdA, that exploits the affinity of positively charged quaternary ammonium to proteoglycans, in order to address diagnostic and/or therapeutic agents for chondrosarcoma management. Due to its abundant chondrogenic extracellular matrix, its poor vascularization and its hypoxic microenvironment, chondrosarcoma is chemo- and radio-resistant. The only effective treatment remains surgical resection that could be at the origin of a 10-years survival rate of 21% in case of local relapse of high-grade tumors. In this context, a quaternary ammonium-conjugated hypoxia-activable prodrug, 8-QA, has been developed and studied in vitro and in vivo respectively to its non-quaternary ammonium conjugated derivative, 8, and to a quaternary ammonium-conjugated non-hypoxia activable 10-QA. In vitro, surface plasmon resonance (SPR) studies evidenced that the two quaternary ammonium-conjugated derivatives, 8-QA and 10-QA, highlighted a higher affinity for aggrecan than non-quaternary ammonium conjugated prodrug 8. We have then developed a 3-D culture model (spheroid) of human chondrosarcoma HEMC-SS cell line that was demonstrated to reproduce the hypoxia and proteoglycan-rich microenvironment similar to in vivo cartilaginous neoplasms. Hypoxia-activated prodrugs, 8 and 8-QA, exhibited a higher cytotoxic activity in hypoxia as compared to normoxia, associated to an increased resistance for 3-D culture respectively to 2-D cells. In vivo, on human HEMC-SS xenograft model implanted on SCID mice and previously characterized in term of hypoxia (photoacoustic and contrast echographic imaging, Doppler), 8-QA derivative induced (i) a significant inhibition of tumor growth of 62,1% while 8 and 10- QA derivatives did not exhibit any antitumor activity; (ii) a decrease of side effects, both improving the therapeutic index. Mechanistic analysis on tumors sampled evidenced a decrease of mitotic activity and proliferation (PCNA), an increase of apoptosis (p53S15) for 8-QA treated tissues. Interestingly, immunohistochemistry studies highlighted that 8-QA caused DNA damages (evidenced by γH2Ax marker) which are mainly localized in hypoxic areas (pimonidazole staining). Finally, we optimized, on NUDE mice, new in vivo human chondrosarcoma models highly expressing simultaneously a hypoxic and proteoglycan-rich microenvironment in order to refine the characterization of 8-QA antitumor activity. For this, we developed a xenograft model of HEMC-SS spheroid implanted subcutaneously and an orthotopic model of HEMC- SS cells inoculated in paratibial location. After characterization, first results of antitumor efficacy on these two models confirmed the promising activity of 8-QA derivative. To conclude, this work demonstrates the proof of concept that exploiting the phenotypic features of chondrosarcoma by a bi-selective approach, is a promising innovative strategy for the therapeutic management of this pathology, relatively rare but redoubtable. This work also demonstrates the role of tumor cell interactions with their environment for tumor growth and response to chemotherapy treatments.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une stratégie de vectorisation d’agents diagnostiques et thérapeutiques, vers les protéoglycanes du chondrosarcome, via une structure chimique de reconnaissance : un ammonium quaternaire. Nous nous sommes intéressés aux deux aspects de la prise en charge du chondrosarcome : l’aspect diagnostique par imagerie scintigraphique et l’aspect thérapeutique. Pour l’imagerie, nous avons validé l’intérêt du radiotraceur 99m Tc-NTP 15-5 dans le diagnostic précoce, le staging et le suivi de la réponse au traitement dans un modèle de chondrosarcome de rat. Ce dernier démontre une accumulation spécifique et rapide au niveau du tissu tumoral, et ce, dès les stades précoces de la pathologie. Actuellement en phase de transfert vers la clinique pour la pathologie de l’arthrose, nos résultats ont permis de proposer une extension de l’application au chondrosarcome. Pour la thérapie, nous avons confirmé, in vitro, que la greffe du vecteur ammonium quaternaire, sur un agent alkylant, le melphalan, ne modifiait pas son activité cytotoxique. In vivo, les résultats obtenus avec le dérivé ammonium quaternaire du melphalan, ont mis en évidence un ralentissement net de la croissance tumorale associée à une diminution considérable du syndrome myélodysplasique associé au traitement. Ces résultats prouvent tout l’intérêt de la vectorisation pour l’amélioration de l’index thérapeutique et nous ont permis de valider la preuve de concept pour la vectorisation d’agent cytotoxique. Une autre approche de thérapie a consisté à greffer le vecteur sur des dérivés du cyclophosphamide clivables en hypoxie. Parmi les composés synthétisés, l’un d’entre eux a montré, in vitro, un différentiel de cytotoxicité hypoxie/normoxie intéressant. Son évaluation in vivo dans le modèle de xénogreffe de chondrosarcome HEMC-SS a démontré une inhibition importante de la croissance tumorale. En nous intéressant à l’environnement hypoxique de la tumeur, nous offrons ainsi une approche encore plus spécifique de la thérapie. L’ensemble de ces travaux offrent un véritable espoir pour le management du chondrosarcome, pathologie certes rare mais néanmoins redoutable. / Our strategy consists in using the quaternary ammonium function, that exhibits a high affinity for proteoglycans of extracellular matrix, as a selective carrier to chondrosarcoma of (i) radioisotopes for a targeted in vivo imaging or (i) cytotoxics for a targeted therapeutic approach. For diagnosis application, a radiotracer radiolabeled with 99m Tc ( 99m Tc-NTP 15-5) was designed and tested in vivo in an orthotopic Swarm chondrosarcoma model. For therapeutic application, a quaternary ammonium derivative of melphalan, Melphalan-AQ, was synthesized and assessed in vitro (cytotoxic activity, cell cycle distribution) and in vivo in the orthotopic Swarm chondrosarcome model (antitumor efficacy, toxicity). Since chondrosarcoma is characterized by hypoxia, research was focused on the vectorization of hypoxia-activated prodrugs. For diagnosis, 99m Tc-NTP 15-5 radiotracer highly accumulated in tumoral tissue at very early stage of pathology while no palpable nor measurable tumor could be assessed. For therapy, chondrosarcoma bearing rats treated with Melphalan-AQ showed a significant tumor growth inhibition with associated heamatological side effects being significantly reduced as compared to Melphalan. Among all phosphoramidate-AQ derivatives synthetised, one was selected on the basis of cytotoxic activity improvement under hypoxia respectively to normoxia. In vivo, this compound demonstrated a significant tumoral growth inhibition in the hypoxic HEMC-SS chondrosarcoma model. This work underlines the potential of the proteoglycans vectorization strategy developed in our lab, for a targeted management of chondrosarcoma including: (i) the first and only radiopharmaceutical able to provide in vivo a specific diagnosis and staging of the tumoral pathology of cartilage and (ii) a promising targeted antineoplastic approach exploiting both the chondrogenic and hypoxic features of chondrosarcoma.

Les cucurbitacines et les parabènes sont des substances d'origine naturelle appartenant à la famille des triterpéniques cycliques et des esters de l'acide-hydroxybenzoïque, respectivement. Ils sont connus pour posséder chez l'homme plusieurs effets pharmacologiques potentiellement intéressants. Le but de ce travail est d'étudier la biotransformation d'une série de trois cucurbitacines et de cinq parabènes dans le foie humain in vitro, essentiellement par glucuronoconjugaison et hydrolyse et caractériser l'effet cytotoxique des cucurbitacines sur une lignée cellulaire du chondrosarcome humain SW 1353. Les résultats ont montré que les cucurbitacines I et D sont plus cytotoxiques que la cytochalasine D vis-à-vis SW 1353 et entraînent l'apoptose des cellules après 12h de traitement à 1 µM alors que la cucurbitacine E présente une cytotoxicité à 10 µM. L'étude in vitro de biotransformation chez l'homme montre que les cucurbitacines sont surtout sulfo- et glucuronoconjuguées (méthodes radiochimiques) par les isoformes de la famille 1A essentiellement. La cucurbitacine E est également activement hydrolysées (Km 22 µM et Vmax 571 nmol/mg /min) en cucurbitacine I dans le foie humain. Par contre, ces substances sont très faiblement hydroxylées. Les acides oléanolique, ursolique et l'érythrodiol, de structure apparentée aux cucurbitacines, sont aussi glucuronoconjuguées au même taux dans les microsomes hépatiques humains mais avec des affinités 100 fois plus élevées. Les parabènes sont rapidement hydrolysés par des estérases dans les microsomes hépatiques humains en acide 4-hydroxybenzoïque, et leur hydrolyse diminue avec la longueur de la chaîne alkyle. Les parabènes, l'acide caféique, le tyrosol et l'hydroxytyrosol, de structure apparentée aux parabènes, sont activement glucuronoconjuguées par les UGTs des familles 1A et 2B. Cependant, l?acide 4-hydroxybenzoïque n'est pas un bon substrat pour les UGTs / Cucurbitacins and parabens are natural compounds belonging to cyclic triterpenoid and alkyl ester of 4-hydroxybenzoic acid, respectively. They are known for their potential valuable pharmacological effects. The aim of this work was to study the biotransformation of a series of three cucurbitacins and six parabens in human liver, in vitro, essentially by glucuronidation and hydrolysis reactions, and by comparision with other natural substances structurally related, and to characterize the cytotoxicity effect of cucurbitacins on a human chondrosarcoma cell line, SW 1353. The results showed that cucurbitacins I and D showed more cytotoxicity than cytochalasin D and led to cell apoptosis after 12h of treatment at 1 ?M. Cucurbitacin E showed its cytotoxic effect at 10 µM. The in vitro study of cucurbitacins biotransformation in man showed that these substances are sulfated, glucuronidated (radiochemical methods). Moreover, cucurbitacin E was actively hydrolyzed (Km 22 µM and Vmax 571 nmol/mg protein/min) leading to cucurbitacin I in man liver. On the other hand, they are weakly hydroxylated. Oleanolic acid, ursolic acid and erythrodiol, chemically related to cucurbitacins, were glucuronidated at the same rate in human liver microsomes, however, with affinities 100 times greater. Parabens were quickly hydrolyzed in human liver microsomes by esterases and hydrolysis decreased with side chain length. Parabens, caffeic acid, tyrosol and hydroxytyrosol were actively glucuronidated by the UGTs of both families 1A and 2B. However, p-hydroxybenzoic acid is not a good substrate for UGTs

En raison d’une abondante matrice extracellulaire chondrogénique, peu vascularisée et hypoxique, le chondrosarcome, cancer du cartilage, est une tumeur chimio et radiorésistante. Une stratégie bispécifique s’appuyant sur deux caractéristiques spécifiques du chondrosarcome, une forte densité de charges négatives, ainsi qu’une hypoxie chronique sévère de la matrice extracellulaire, est actuellement développée au laboratoire et consiste à fonctionnaliser une prodrogue activée en hypoxie avec un ammonium quaternaire (AQ). Sur la base de résultats précliniques, une prodrogue, ICF05016, a été identifiée et fait actuellement l’objet d’une étude d’optimisation.Ce projet vise à identifier des relations structure-activité dans une série de moutardes phosphorodiamidates vectorisées par une fonction AQ. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à faire varier la nature des substituants de la fonction ammonium quaternaire ainsi que la longueur du bras espaceur séparant cette dernière de la moutarde. Ainsi, 27 dérivés ont été synthétisés par une séquence commune multi-étapes impliquant la phosphorylation d’un dérivé 2-nitro-5-hydroxyméthylimidazole.Un screening par résonance plasmonique de surface a permis de mettre en évidence 12 composés plus affins envers l’aggrécane que le composé de référence ICF05016. Cette étude a révélé une dépendance importante entre l’affinité à l’aggrécane et la nature de l’ammonium quaternaire, les composés benzyléspossédant tous des affinités supérieures. In vitrosur cultures cellulaires HEMC-SS, les composés ont affichés des ratios de cytotoxicité normoxie vs hypoxie (HCR)supérieurs à celui du lead ICF05016, et notamment le composé benzylé31f.Avec une constante de dissociation à l’aggrécane de 2,10 µM et un différentiel de cytotoxicité normoxie/hypoxie équivalent à celui de l’évosfosfamide en étude clinique, la composé 31f a été évalué en termes de stabilité et de clivage en conditions réductrices, mimant l’hypoxie tumorale. Démontrant une excellente stabilité sur 24 heures dans un tampon phosphate, le composé 31f s’est révélé être réduit par réduction chimique ou enzymatique via une nitroréductase, et ce avec une cinétique rapide. Ce dernier a été ainsi identifié au terme de l’évaluation in vitro et de cet axe de recherche comme un nouveau « lead ».Dans une seconde partie, nous avons choisi de moduler l’halogène et la position des bras alkylants portés par la moutarde phosphorodiamidate. Compte tenu de l’instabilité des composés de la série bromée, par rapport à la série chlorée, les analogues bromés des composés ICF05016 et 31f n’ont pu faire l’objet d’une évaluation in vitro. Pour les isomères de type moutarde ifosfamide, l’instabilité des précurseurs phosphoramidiques et les difficultés de synthèse inhérentes à l’introduction d’une fonction amine secondaire sur un chlorure de phosphoryle préalablement fonctionnalisé, nous ont contraints à réorienter nos travaux vers des structures issues d’une étape de chimie de click, permettant d’introduire le bras vecteur portant la fonction amine tertiaire indépendamment de l’étape de phosphorylation. Cette séquence réactionnelle pourrait être étendue à la synthèse de nouveaux analogues du composé 31f, identifié lors de ces travaux. / Due to an abundant chondrogenic, poorly vascularized and particularly hypoxic extracellular matrix, chondrosarcoma, a malignant cartilaginous tumour, is chemo- and radio-resistant. A dual targeted therapy leveraging specific chondrosarcoma hallmarks, an extensive cartilaginous extracellular matrix, namely the high negative fixed charge density and severe chronic hypoxia,was investigatedby conjugation of a hypoxia-activated prodrug (HAP) to quaternary ammonium (QA) functions. Based on preclinical results, animidazole prodrug, ICF05016, was identified and provided the basis for a lead optimization study.This project was designed to identify structure-activity relationships in a series of QA-targeted phosphorodiamidate mustard conjugates. In a first part, a series of 27 conjugates, with different QA function and length of the alkyl linker, was synthesizedvia a common multi-step sequence involvingphosphorylation of a key 2-nitroimidazole alcohol intermediate. Then, biomolecular interactions between these QA derivatives and aggrecan were assessed using thesurface plasmon resonance technology. This screeningrevealed that the affinity depends more on the natureof the QA function, rather than on the linker length. The most promising results were obtainedwith QA bearing a benzyle group. Twelves compounds were then evaluated in terms of hypoxia selective cytotoxicityonthe HEMC-SS cell line. For all prodrugs, an overall improvement in hypoxic selectivity compared with the ICF05016 was obtained and the positive impact of thebenzyle QA function was again highlighted. With a dissociation constant of 2.10 µM in the SPR experiment and an attractive hypoxic selectivity, compound 31fwas further selected for a stability and reductive activation study. Activation of the prodrug and phosphoramide mustard release under reductive chemical conditions, and nitroreductase-based activation were demonstrated. From this study, compound 31f emerged as the most effective PG-targeted HAPs. In a second part, the nature of the halogen and the position of the alkylating arms carried by the phosphorodiamidic mustard were modified. Given the high instability of the final compounds of the brominated series, compared to the chlorinated series, brominated analogs of the compounds ICF05016 and 31fcould not be obtained with sufficient purity to be evaluated in vitro.For ifosfamide-like isomers, the design of the prodrugs was modified due to the instability of the phosphoramidic precursors or difficulties of introducing a secondary amine function on a phosphoryl chloride previously functionalized.A click chemistry approach was developed to tether the spacer arm carrying the tertiary amine function independently of the phosphorylation step and could be extended to the synthesis of triazoleanalogues of the new lead 31f.

Les pathologies modifiant l’intégrité de la matrice cartilagineuse (arthrose, arthrite, pathologies des disques intervertébraux, chondrosarcome…) sont caractérisées par un diagnostic tardif dû à l’absence d’un marqueur spécifique du cartilage. Notre unité de recherche développe depuis quelques années un radiotraceur à base de 99mTc capable de se lier aux protéoglycanes, un des constituants essentiels du cartilage. Son utilisation en tomographie par émission monophotonique (TEMP) a permis de mettre en évidence sa capacité à cibler spécifiquement les protéoglycanes du cartilage. Les travaux présentés dans cette thèse s’inscrivent dans la continuité de cette étude. De nouveaux radiotraceurs à base de cuivre-64 ont été synthétisés avec pour objectif de réaliser une imagerie fonctionnelle et quantifiable du cartilage en tomographie par émission de positons (TEP). La structure de base de ces radiotraceurs combine une partie vectrice ciblant spécifiquement les protéoglycanes du cartilage (fonction ammonium quaternaire) et une partie chélatante affine de l’ion cuivrique (polyazamacrocycle). Nos études préliminaires montrent que ces radiotraceurs pourraient permettre un diagnostic précoce et un suivi longitudinal des pathologies du cartilage. / Pathologies altering the integrity of the cartilaginous matrix (osteoarthritis, arthritis, intervertebral discs diseases, chondrosarcoma…) are characterized by a delayed diagnosis due to the absence of a specific marker of cartilage. Since several years, our research unit developed a radiotracer based on 99mTc able of binding proteoglycans, one of the essential constituents of the cartilage. Its use in single photon emission tomography (SPECT) had enabled to demonstrate its ability to specifically target the cartilage proteoglycans. Works reported in this thesis are a follow-up to this study. New radiotracers based on copper-64 were synthesized with the aim to achieve functional and quantifiable cartilage imaging in positron emission tomography (PET). The basic structure of these radiotracers combines a carrier function specifically targeting cartilage proteoglycan (quaternary ammonium function) and a chelating moiety for cupric ion (polyazamacrocycle). Our preliminary studies show that these radiotracers could allow early diagnosis and a longitudinal follow-up of cartilage diseases.

L’hadronthérapie par ions carbone représente une modalité de radiothérapie alternative très attractive du fait des propriétés physiques et biologiques de ce type de particules. Les chondrosarcomes, tumeurs radio-résistantes à différentiation cartilagineuse, sont en première ligne pour le traitement par ions carbone. Cependant, les effets secondaires sur les tissus sains environnants sont peu ou mal connus. Ce projet a pour but l’étude des effets directs des ions accélérés dans un modèle 3D de cartilage sain et pathologique proche de l’homéostasie humaine et le développement de nouveaux outils de calculs d’efficacité biologique relative (EBR). Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux séquelles radio-induites sur le cartilage articulaire dans un contexte d’hadronthérapie par ions carbone. En culture 2D physioxique (2% d’O2), l’efficacité biologique relative des ions carbone (transfert d’énergie linéique ou TEL intermédiaire) comparée aux rayons X a été évaluée à 2,6. Ceci a été corrélé à une plus forte induction de sénescence radio-induite. Cependant, cet effet différentiel n’a pas été retrouvé en utilisant un modèle 3D de cartilage articulaire. L’efficacité biologique relative des ions accélérés semble donc surévaluée, en utilisant des cultures en monocouche, par rapport à la 3D. Dans un deuxième temps, un modèle 3D de chondrosarcome a été développé pour des études d’hadronbiologie. Après plusieurs obstacles techniques, des méthodes d’extraction protéique et d’immunohistochimie ont été mises au point. Une nouvelle méthode d’évaluation de l’EBR en 3D basée sur la cinétique d’induction de la protéine γ-H2AX a été proposée. / Hadrontherapy using carbon ions has many advantages due to physical and biological properties of this type of particle. Chondrosarcoma, a cartilaginous radio-resistant tumor, has been successfully treated using carbon ions. However, potential side effects to the surrounding healthy tissues are still poorly known. This project aims to study the direct effects of carbon ions in a 3D model of healthy articular cartilage and chondrosarcoma close to human homeostasis, in order to provide new tools for the evaluation of the relative biological effectiveness (RBE).The first part of the project was dedicated to the evaluation of carbon ions-induced impact on articular cartilage in the context of chondrosarcoma treatment. Compared to X-rays, the relative biological effectiveness of intermediate-LET carbon ions scored 2.6 in 2D monolayer culture. This was correlated with a stronger induction of cellular senescence. However, this differential effect was not reproduced using a 3D model of articular cartilage. Thus, the relative biological effectiveness of accelerated ions is probably overestimated using monolayer cultures (2D), compared to 3D. In the second part of this work, we developed a 3D chondrosarcoma model for hadronbiology studies. Protein extraction and immunohistochemistry protocols were developed. A new RBE evaluation method based on γ -H2AX repair kinetic in 3D, was proposed.

Le chondrosarcome (CHS) est caractérisé par une grande chimio et radiorésistance ; il y a un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette tumeur. Parmi celles-ci, certaines approches d'immunothérapie pourraient être d'un grand intérêt. Nous étudions actuellement l'implication du système immunitaire dans la progression du CHS et la réponse thérapeutique à la fois sur des échantillons humains et dans le modèle de chondrosarcome de rat (SRC).Dans le CHS humain et de rat, des infiltrats immunitaires composés de lymphocytes et macrophages ont été identifiés dans la zone péritumorale. L’infiltration immunitaire est en corrélation avec l’évolution de la tumeur (grade, envahissement et taille). L'expression de PD1 et PDL1 ont été détectée dans les infiltrats immunitaires et cellules tumorales du CHS chez l’homme et le rat. Le niveau d'expression PD-L1 en corrélation avec la survie des patients et le taux de rechute. Dans le model SRC, la déplétion sélective de lymphocytes T a entrainé une accélération de la progression tumorale, tandis que la déplétion de macrophages l’a ralenti. Les splénocytes isolés de rats porteurs de CHS ont montré une cytotoxicité spécifique dirigée contre les cellules de chondrosarcome (27%), qui a diminué de manière significative avec des rats appauvrie en CD3 (11%). La voie de signalisation PI3K/mTOR ne peut pas être associée à une immunothérapie car elle induit une action immunosuppressive in vivo.L'environnement immunitaire contribue à la progression du CHS à la fois chez l’homme et chez le rat, ce qui suggère que une approche immunomodulatrice avec des anticorps bloquant PDL1 pourrait être testée pour le CHS / Chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiation and there is an urgent need in developing new therapeutic strategies for this malignancy; among these, some immunotherapy approaches could be of great interest. We are currently investigating the immune system implication in chondrosarcoma progression and therapeutic response both on human samples and in rat chondrosarcoma model (SRC). In human and rat chondrosarcoma, immune infiltrates composed of lymphocytes and macrophages were identified in the peritumoral area. Immune infiltrates composition was found correlated with tumors characteristics and evolution (grade, invasiveness and size). Expression of PD-1 and PD-L1 was detected in CHS immune infiltrates, both in human and rat (and on tumor cells). PD-L1 expression level correlated with patients survival and relapse rate. In SRC, T lymphocytes depletion resulted in an accelerated tumor progression, while CD163+ macrophages depletion slowed down tumor progression. Splenocytes isolated from CHS bearing SRC showed a specific cytotoxicity directed against chondrosarcoma cells (27%), which significantly decreased in CD3 depleted SRC (11%). The immune environment contributes to CHS progression in both human and animal models, this associated with expression of immune checkpoint PD1/PDL1 suggest that immunomodulatory approaches with PD-L1 blocking antibody could be applied in CHS; this approach is currently being tested in SRC

Le chondrosarcome (CHS), cancer du cartilage est une tumeur chimio- et radiorésistance dont le seul traitement efficace reste la chirurgie. Une prodrogue vectorisée et activable en hypoxie, ICF05016, est actuellement développée par l’UMR 1240, et évaluée en préclinique comme potentielle alternative théra-peutique pour ce cancer. La structure de cette molécule regroupe i) une moutarde cytotoxique, ii) un vecteur ammonium quaternaire chargé positivement possédant un tropisme pour l’aggrécane, protéoglycane majoritaire de la matrice extracellulaire tumorale, iii) une gâchette de type 2-nitroimidazole permettant une activation sélective en situation d’hypoxie, une des caractéristiques principales du CHS.Ces travaux de thèse ont consisté à pharmaco-moduler cette prodrogue bispécifique ICF05016 en modifiant la position du vecteur ainsi que la nature de l’agent cytotoxique. Ainsi sept prodrogues vectorisées ont été synthétisées présentant une chaine vectrice N,N,N-triméthylpropylaminium soit en C-4, soit en N-1 du cycle imidazole. Leur activation par réduction chimique, mimant l’hypoxie, ainsi que leur affinité pour l’aggrécane ont été confirmées in tubo par des analyses de RMN 31P et de SPR, toutefois elles se sont avérées non sélectives en termes de cytotoxicité (CI50 comprises entre 15 et 1 µM, et ce, quelles que soient les conditions d’oxygénation) et faiblement sensibles à une bio-réduction enzymatique. La fonctionnalisation par un vecteur ammonium quaternaire de la gâchette 2-nitroimidazole annihile donc l’activation en hypoxie des prodrogues.Cette stratégie a ensuite été étendue au cancer de la prostate en remplaçant le vecteur ammonium quaternaire par un ligand de type urée affin pour l’antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA). La première molécule synthétisée, qui possède un espaceur triazole, a démontré une affinité pour le récepteur PSMA, par une étude de compétition avec un radioligand, ainsi qu’une activation in tubo par bioréduction enzymatique. Toutefois aucune cytotoxicité n’a été constatée sur les lignées LNCaP-Luc et PC3-Luc. Une seconde molécule combinant un espaceur triazole avec une séquence peptidique identifiée pour la molécule PSMA-617, actuellement en cours d’essai clinique, est actuellement développée mais sa synthèse doit être optimisée, notamment au niveau de l’étape de cycloaddition 1,3-dipolaire. / Chondrosarcoma (CHS), the malignant tumor of the cartilage, is a chemo- and radio-resistant cancer. Surgical resection is still considered the mainstay of treatment of this pathology. A dual targeted hypoxia-activated prodrug, ICF05016 was developed by the UMR 1240 and evaluated in preclinical studies as a potential therapeutic alternative for CHS. The latter is a nitroheteroaryl-based compound designed as follows: a phosphorodiamidic mustard functionalized with a quaternary ammonium (QA) used as targeting function, and a 2-nitroimidazole group to trigger fragmentation and then release the bis-alkylating mustard anion by bioreduction under hypoxic conditions, chemical hallmark of CHS.This project deals with the pharmacomodulation of ICF05016, more specifically by modification of the position of the targeting moiety as well as the nature of the cytotoxic agent. Seven QA-targeted prodrugs have been synthesized with N,N,N-trimethylpropylaminium tethered to the imidazole either in the C-4, or the N-1 position. These prodrugs were cleaved in vitro under chemical reductive conditions, which mimic in vivo hypoxia conditions. In addition, the binding of these derivatives to aggrecan was highlighted by surface plasmon resonance. In vitro assays on human CHS cells (H-EMC-SS) demonstrated quite equivalent cytotoxicities, whatever the oxygen conditions used and their evaluation as substrate of an oxygen-insensitive nitroreductase revealed the almost total lack of activation. A QA targeting moiety grafted on the trigger seems to alter hypoxia activation.New prodrugs with prostate specific membrane antigen (PSMA)-targeting ligand were synthesized to extend this HAP strategy to prostate cancer. The first tested compound, having a triazole spacer, presented selective affinity for PSMA in an in vitro binding experiment as well as activation under enzymatic reduction. However, no cytotoxicity was observed on LNCaP-Luc and PC3-Luc cells. The synthesis of a prodrug combining the spacer of PSMA-617, currently in clinical trial, and a propyltriazole moiety, was initiated but the 1,3-dipolar cycloaddition still need to be optimized.

Il a été montré que la cavitation acoustique pouvait se révéler utile dans l'administration de médicaments pour de nombreuses applications biologiques et médicales. Cette thèse commence par une présentation de la cavitation ultrasonore et des mécanismes d'action mis en jeu pour la délivrance de médicaments. A la fin de ce cette synthèse, un dispositif à deux transducteurs ultrasonores disposés de manière confocale est présenté pour résoudre certains des problèmes actuels dans le domaine. Il est ensuite mis en oeuvre dans différentes études de faisabilité. La thèse est organisée en 5 chapitres : 1. L'utilisation de la cavitation acoustique dans un contexte biomédical est présentée ici dans une revue générale. Ce chapitre comprend l'état de l'art pour la génération de cavitation, les techniques expérimentales qui sont actuellement mises en oeuvre pour la mesure de la cavitation, et les approches cliniques et précliniques pour l'utilisation de la cavitation in vivo pour différents types de tissu biologique. 2. Le dispositif ultrasonore utilisé pour toutes les études de cette thèse est ensuite décrit. Il est caractérisé acoustiquement et comparé avec un simple transducteur dans le but de démontrer son efficacité pour la génération de la cavitation. Cette comparaison est d'abord faite par une quantification chimique du niveau de cavitation. A puissance constante, le dispositif à deux transducteurs confocaux est bien plus efficace pour générer de la cavitation. Les causes de cette observation, notamment la réduction de la propagation non-linéaire et la stabilisation du nuage des bulles par les forces Bjerknes, sont ensuite étudiées par des mesures acoustiques, des simulations de pression en régime linéaire et un suivi par une caméra ultra rapide des nuages de bulles induits. 3. Le prototype confocal est utilisé in vivo sur des tumeurs sous cutanées en conjonction avec des liposomes. Dans un premier temps, des essais sous IRM démontrent la possibilité de larguer le contenu des liposomes localement par la cavitation inertielle délivrée par le dispositif. Une seconde étude avec une formulation liposomale de doxorubicine a permis de démontrer l'amélioration de la réponse thérapeutique de la chimiothérapie après application de la cavitation inertielle.. 4. Une étude de faisabilité de l'interférence de l'ARN (RNAi) sur un petit nombre d'animaux est réalisée avec le dispositif confocal et des molécules de siRNA encapsulées dans des liposomes Les expériences sont conduites in vivo avec une xénogreffe de tumeur de sein humain. Après une phase de réglage des paramètres ultrasonores pour limiter la toxicité du traitement, on observe une inhibition significative du gène ciblé. 5. Une deuxième étude de faisabilité est réalisée pour étudier la potentialisation de la chimiothérapie avec l'évérolimus dans un modèle de chondrosarcome de rat. Les traitements ultrasonores et les chimiothérapies sont répétés. Sur un petit nombre d'animaux, on montre l'innocuité du traitement ultrasonore, et l'efficacité en conjonction avec l'agent anti tumoraux, évérolimus / Acoustic cavitation has been shown to be a useful tool in drug delivery for many different biological tissues and indications, and this thesis aims to contribute to the knowledge of cavitation from a drug delivery perspective. This thesis seeks to synthesize the current knowledge and practice concerning acoustic cavitation in a biomedical context, and to present a high intensity confocal ultrasound (US) prototype to address some of the current problems in the field and to give a proof of concept for the therapeutic efficacy of such a prototype. The thesis is organized in 5 chapters: 1. The use of acoustic cavitation in a biomedical context is presented here in a general review. This review comprises the state of the art for cavitation generation, experimental techniques currently being implemented for the measurement of cavitation, and the clinical and preclinical approaches to the use of cavitation in vivo on a tissue by tissue basis. 2. The high intensity confocal US prototype used for all studies in this thesis is presented here. It is characterized in terms of the advantages it gives for the generation of cavitation. Enhancement of cavitation is first demonstrated chemometrically with a fluorescent dosimeter compared to a single transducer at the ultrasonic focus. The mechanisms for cavitation enhancement are then investigated with acoustic measurements, linear pressure simulations, and high speed camera data. 3. The confocal US prototype in used in conjunction with a liposomal formulation of doxorubicin is performed in which a therapeutic enhancement of tumor inhibition is presented. The mechanism of this enhancement is investigated with liposomally encapsulated lanthanide contrast agents and magnetic resonance imaging. 4. A small scale proof of concept for the use of RNA interference using the confocal prototype, and liposomally encapsulated siRNA molecules. The experiments are performed In vivo with a xenograft of human breast tumor. This study also includes data for the safety of the US exposure on a mouse treated one time. 5. Another small scale proof of concept of the use of the confocal device on potentiating chemotherapy with the drug everolimus in a rat chondrosarcoma model. The studies presented here also investigate the use of multiple US exposures on the same tumor in a combined drug / US treatment regimen