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Antecedentes El 15,9% de la población de Catalunya era inmigrante en el 2011. A pesar del reconocimiento legal del derecho a la atención sanitaria y del desarrollo de políticas específicas, las investigaciones sobre acceso a los servicios de salud (SS) de la población inmigrante (PI) en España apuntan hacia posibles barreras de acceso. Sin embargo, la evidencia existente es escasa, a menudo contradictoria y pocos factores quedan esclarecidos. Objetivo general Analizar, desde la perspectiva de la PI, los elementos que influyen en su acceso a los SS de Catalunya. Metodología Estudio cualitativo, fenomenológico descriptivo, basado en el marco conceptual de Aday y Andersen. El área de estudio comprende Barcelona, Lleida, Girona y Baix Empordà, y la población de estudio la PI residente en estos lugares. La muestra fue teórica, basada en diferentes perspectivas y relaciones con los SS (usuarios, mediadores de salud y representantes de asociaciones de inmigrantes); y diferentes procedencias (Pakistán, Rumanía, Senegal, Marruecos y Colombia). El tamaño final fue de 37 personas, determinado por saturación del discurso. Se realizaron entrevistas individuales semiestructuradas (2008-2009), grabadas y transcritas literalmente. Se realizó un análisis narrativo de contenido, los datos se segmentaron por informante, colectivo, y temas, y las categorías de análisis se generaron de manera mixta. Hubo triangulación de informantes y de analistas, y el proceso se documentó sistemática y detalladamente. Resultados La mayoría considera fácil el acceso, independientemente de la situación administrativa y laboral, y destacan la gratuidad de la atención. No obstante, la entrada al sistema es fácil solo si se dispone de tarjeta sanitaria (TS), cuya obtención se dificulta por la exigencia de empadronamiento y afiliación a la Seguridad Social, y el miedo a ser identificados por las autoridades. Además, emergen barreras que dependen de los SS y de la PI. En relación a SS: insuficiente provisión de información; horarios de atención primaria incompatibles; tiempos de espera excesivos; deficiente calidad técnica percibida; barrera lingüística; trato incorrecto y actitud negativa del profesional. En relación a la PI: desconocimiento de los SS y los idiomas locales; dificultad para ausentarse del trabajo y cumplir las bajas laborales; y rol social de la mujer. Aparece la percepción de discriminación en los SS. En consecuencia acuden a farmacias, urgencias hospitalarias, asociaciones y oenegés o centros privados; utilizan TS de otra persona; se automedican; y pagan por la atención pública y privada; retrasando la atención y empeorando la enfermedad. Conclusiones El acceso de los inmigrantes a los SS en Catalunya es fácil, pero se ve dificultado por elementos relativos a los SS y potenciados por características de la PI. La TS se configura como elemento clave, pero su obtención se basa en requisitos controvertidos y con frecuencia inalcanzables. El desconocimiento relacionado con la falta de provisión de información limita el acceso, y aunque es compensado parcialmente por el círculo social, éste no puede ni debe sustituir al sistema como fuente de información. La dificultad para ausentarse del trabajo se debe a la precariedad laboral y las prácticas abusivas e ilícitas de los empleadores, por lo que es necesario trasladar este conocimiento a las autoridades competentes y adecuar los horarios de los SS. La barrera lingüística, la falta de competencia cultural y la mala calidad técnica percibida deben ser tenidas en cuenta en la formación de profesionales y los recursos de mediación. Estos resultados denotan el incumplimiento de las leyes y la falta de implementación de las políticas, por lo que éstas deben ser revisadas, reforzadas, y mantenidas. El uso de las urgencias hospitalarias es consecuencia de muchas de estas barreras, por lo que su reducción conllevaría una mayor adecuación de la utilización de urgencias. / Background 15.9% of the Catalan population was immigrant in 2011. Despite the legal recognition of the right to health care and the development of specific policies, research on access to health services (HS) of the immigrant population (IP) in Spain point to possible barriers to access. However, the evidence is scarce, often contradictory and few factors have been clarified. Main objective To analyze, from the IP perspective, the elements that influence their access to HS in Catalonia. Methodology Qualitative and phenomenological study, based on the conceptual framework of Aday and Andersen. The study area included Barcelona, Lleida, Girona and Baix Empordà, and the study population was defined as the IP living in these places. The theoretical sample was based on different perspectives and relationships with the HS (users, healthcare cultural mediators and immigrant associations’ representatives), and different countries of origin (Pakistan, Romania, Senegal, Morocco and Colombia). The final size was 37 people, determined by saturation of the information. Semi-structured interviews were conducted (2008-2009), recorded and transcribed verbatim. A narrative content analysis was performed; data were segmented by informant, country of origin and themes; and categories of analysis were generated both based in the topics of the guide and the ones that emerged from the data. To enhance the quality of the analysis, triangulation of informants and analysts was carried out, and the process was systematically documented in detail. Results Most informants find it easy to access the HS regardless of their administrative and labour situation, and stress the access free of charge. However, entrance to the healthcare system is easy only if you have a health insurance card (HC), whose acquisition is hampered by the requirement of registration and Social Security affiliation, and the fear of being identified by authorities. In addition, barriers appear related to the HS and to characteristics of IP. Regarding the HS the following barriers appear: insufficient provision of information; primary care opening time; excessive waiting times; poor technical perceived quality of care; language barriers; unfair treatment and negative attitude of the professional. And in relation to the IP: ignorance of the HS and local languages, difficulty to leave work and comply with sick leave, and social role of women. There was also a perception of discrimination related to the HS. Due to these barriers, immigrants go to pharmacies, emergency departments, charitable associations or private institutions; use the HC of someone else; self-medicate; and pay for public and private care, thus delaying care and worsening the disease. Conclusions Access of immigrants to the HS in Catalonia is easy, but hampered by elements of the HS further intensified by features of the IP. The HC is configured as a key element, but its acquisition is based on requirements controversial and often unreachable. Lack of knowledge related to the lack of provision of information limits access, and although the social network partially assumes this provision, it cannot and should not replace the system as a source of information. The difficulty for missing work is due to job insecurity and abusive and illegal practices of employers; therefore it is necessary to transfer this knowledge to the competent authorities and adjust the opening times of HS. The language barrier, lack of cultural competence and perceived poor technical quality must be taken into account in the training of professionals and mediation resources. These results indicate non-compliance with laws and lack of policy implementation, so these must be reviewed, reinforced and maintained. As a result of many of these barriers immigrants use hospital emergency departments; their reduction would thus lead to greater adequacy of the utilization of the emergency departments.

Los anticuerpos naturales, que han demostrado ser capaces de controlar la diseminación de virus y bacterias, así como mejorar la capacidad de respuesta del huésped contra microorganismos, también reaccionan de forma cruzada con antígenos de otras especies (xenoanticuerpos). Estos anticuerpos pueden tener potenciales efectos deletéreos para el huésped como los dirigidos contra galactosa α-1-3 galactosa (α-Gal) que favorecen la sepsis por enterobacterias. Por otro lado, la xenoinmunización con células endoteliales, ha demostrado potenciales aplicaciones biomédicas como la capacidad de desarrollar un efecto anti-angiogénico y anti-tumoral. En este estudio se investigó: a) el efecto de los anticuerpos anti-α-Gal en la sepsis que se produce en ratones knockout para α-Gal (α-Gal KO) tras ligadura y punción de ciego (CLP); b) el impacto de la xenoinmunización en la sepsis que se produce en la rata tras realizar una CLP; c) las características de xenoanticuerpos presentes en la rata tras una xenoinmunización, especialmente la reacción cruzada de los mismos con otras especies y microorganismos; d) el impacto de la xenoinmunización en la angiogénesis y tumorogénesis de ratones RIP-Tag2. Los ratones α-Gal KO de nuestra colonia alcanzan espontáneamente elevados niveles de anticuerpos anti-αGal que pueden ser inhibidos de manera específica con la molécula GAS914. En el modelo de sepsis por CLP en estos ratones, la inhibición de los anticuerpos anti-αGal con GAS914 antes de la CLP conduce a una mayor supervivencia tras la sepsis. Sin embargo, la inhibición de los anticuerpos anti-αGal con GAS914 a partir de las 12 h tras la CLP, no mejora la supervivencia de la sepsis. La xenoinmunización de ratas con 3 inyecciones de sangre de hámster (SH) o cerdo (SC) a días alternos (d.a.) en la misma semana produce xenoanticuerpos naturales de predominio de IgM. Por el contrario, la inmunización de ratas con 3 inyecciones de sangre xenogénica a intervalos de 15 días (s.a.) genera xenoanticuerpos anti-hámster o anti-cerdo de predominio IgG. La CLP en rata Lewis con aguja de 19G produce una sepsis poco grave, y caracterizada por un patrón de disminución de citocinas. La inmunización previa a la CLP con SH o SC a d.a. conduce a una disminución de la supervivencia de los animales, mientras que a s.a. no muestra diferencias respecto al control. La inmunización con S.H d.a puede inducir una disminución de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias, que se asocia con una supervivencia de las ratas, o un aumento de las mismas, particularmente de leptina, que implica la mortalidad del animal. Los xenoanticuerpos producidos en la rata por la inmunización con SH o SC reaccionan de forma cruzada con Enterococcus faecalis pero no con Escherichia coli, aislados en la sangre de ratas tras la CLP. Además, los xenoanticuerpos anti-hámster y anti-cerdo reaccionan de forma cruzada con células de hámster o de cerdo, cuando no se han utilizado en la inmunización, así como células humanas y de conejo. Anticuerpos contra melibiosa y ramnosa parecen los responsables de la reacción cruzada de los xenoanticuerpos en rata con E. faecalis. La xenoinmunización con sangre o células endoteliales humanas, pero no con SC, produce xenoanticuerpos IgM e IgG que reaccionan de forma cruzada con células endoteliales y tumorales de ratones RIP-Tag2, inhibiendo in vivo la angiogénesis tumoral en estos animales. Sin embargo, la xenoinmunización con SC en ratones también induce xenoanticuerpos IgG que reaccionan de forma cruzada con células humanas. Se concluye que algunos xenoanticuerpos naturales contra carbohidratos pueden favorecer la sepsis causada por enterobacterias, por lo que su depleción podría ser una estrategia preventiva de la misma, mientras que los anticuerpos anti-carbohidrato producidos por xenoinmunización con hematíes tienen un efecto anti-angiogénico y podrían investigarse como inmunoterapia del cáncer. / Natural antibodies may react with antigens of other species (xenoantibodies) and have potential deleterious effects for the host, like antibodies against galactose α-1-3galactose (αGal) that boosts enterobacterial sepsis. On the other hand, xenoimmunization with endothelial cells may generate an anti-angiogenic and anti-tumor effect in the host. Here, we report that mice αGal KO produce spontaneously high levels of anti-αGal antibodies that can be specifically inhibited with GAS914. In a cecal ligation puncture (CLP) sepsis model in this mice, inhibition of anti-αGal antibodies with GAS914 before CLP increased survival after sepsis. However its inhibition 12h after CLP, did not improve animal survival. Xenoimmunization of rats with 3 injections of hamster (HB) or pig blood (PB) every other day (q.o.d.) or every other week (q.o.w.) produce natural xenoantibodies, (meanly IgM) or induced xenoantibodies (mainly IgG), respectively. CLP in Lewis rats with 19G needle produce a less severe sepsis, characterized by a pattern of reduction of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines and minimal mortality. Xenoimmunization previous to CLP with HB or PB q.o.d. decreases animal survival, whereas q.o.w. does not show differences respect to control. Xenoimmunization with HB q.o.d. may decrease pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, which is associated with rat survival, or can increase the same, particularly leptin, which is associated with animal mortality. Xenoantibodies present in rat by HB or PB immunization cross-reacted with Enterococcus faecalis, isolated in the rat blood after the CLP. Also, these xenoantibodies were cross-reacted with hamster or pig cells, when they were not used in the immunization, as well as human and rabbit cells. Anti-melibiose and anti-rhamnose antibodies appeared to be responsible of xenoantibodies cross-reactivity in rat with E. faecalis. Xenoimmunization of mice RIP-Tag2 with human blood or endothelial cells, but not with PB, produce cross-reactive xenoantibodies against tumor and endothelial cells, which inhibited in vivo tumor angiogenesis in these animals. Xenoimmunization with PB in mice RIP-Tag2 induced cross-reactive xenoantibodies with human endothelial cells. In conclusion, some natural anti-carbohydrates xenoantibodies can boost sepsis caused by enterobacteria, whereas induced xenoantibodies after red blood cell exposure may have antiangiogenic effects, which may lead to potential applications of these antibodies as immunotherapy.

La Alta Presión Hidrostática (APH) es una tecnología no térmica capaz de extender la vida útil de los alimentos al mismo tiempo que mantiene sus características nutricionales y organolépticas. El queso fresco es una variedad no madurada, de coagulación enzimática o ácida, y que generalmente es consumido poco después de su elaboración. El queso fresco tradicional es obtenido por coagulación enzimática y es un medio ideal para el crecimiento bacteriano, ya que en su fabricación no se utilizan fermentos lácticos, posee una elevada actividad de agua y un alto contenido en proteína y grasa. El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la APH para extender la vida útil de un queso fresco tradicional obteniendo un producto de alta calidad. Para este propósito, se realizó un estudio preliminar con quesos comerciales de pequeño formato (80 g) a nivel de planta piloto con el fin de determinar la capacidad de la APH para inhibir el crecimiento de microorganismos causantes de deterioro. Los quesos fueron tratados a 300 y 400 MPa (5 min a 6°C) y se evaluaron diferentes parámetros microbiológicos, de de composición y físico-químicos durante su almacenamiento en frío. Los resultados mostraron que la APH no modificó la composición del queso fresco y produjo sólo pequeños cambios en el color (más amarillo) y la textura (más firme), cuando se comparó con un queso no tratado. Además, la aplicación de 300 y 400 MPa aumentó la vida útil de los quesos a 14 y 21 días, respectivamente. La siguiente fase fue determinar la vida útil de un queso comercial (250 g) tratado a 500 MPa (5 min a 18°C) bajo condiciones industriales siguiendo también su evolución microbiológica, de composición, físico-química y sensorial durante 21 días de almacenamiento en frío. En este caso, los quesos presurizados alcanzaron una vida útil de entre 19 y 21 días al compararlos con los quesos no tratados que fue de entre 7 y 8 días. Sin embargo, el tratamiento de 500 MPa afectó significativamente a las características de color, textura, microestructura y sensoriales del queso, pero no así su preferencia por parte de un panel de catadores. Es importante destacar que la APH fue capaz de mantener las características de aroma del queso a lo largo de su vida útil, retrasando la formación de compuestos volátiles responsables de sabores extraños. Adicionalmente, se realizó un ensayo de inoculación con Listeria spp. con el fin de evaluar la efectividad de la APH (300-600 MPa durante 5 min a 6°C) para asegurar la inocuidad alimentaria. Se seleccionaron tres cepas bacterianas (L. monocytogenes Scott A y CECT 4031, y su marcador, L. innocua CECT 910) para estudiar la inactivación y la generación de daño sub-letal después del tratamiento y su evolución durante 15 días de almacenamiento a 4°C. Con el tratamiento de 300 MPa no se consiguió inactivar ninguna de las cepas inoculadas. Sin embargo, tanto los tratamientos de 500 MPa y 600 MPa se lograron importantes reducciones de Listeria spp. Por otra parte, la presurización del queso fresco entre 300-600 MPa no produjo significativamente daño sub-letal, apreciándose diferencias en el comportamiento entre las cepas estudiadas. Así, se observó que L. monocytogenes CECT 4031 fue la más sensible a la APH y Scott A la más resistente. En los quesos tratados el crecimiento de esta bacteria durante el almacenamiento en frío no fue inhibido. Los recuentos en los quesos tratados a 300 MPa no fueron distintos a los del queso control para todas las cepas y nivel de inoculo utilizados. / High pressure processing (HPP) is a non-thermal technology able to extend the shelf-life of a number of food products while maintaining their sensory and nutritional quality. Fresh cheese is unripened rennet or acid-coagulated type and is usually consumed after manufacturing. Traditional fresh cheese is obtained by rennet coagulation and it may serve as an ideal medium for bacterial proliferation, since no starter culture is added, and considering its high water activity and its high protein and fat contents. The main objective of this thesis was to evaluate the effect of HPP technology for extending the shelf-life of a starter-free fresh cheese, and in order to obtain a high quality product. For this purpose, a preliminary study at pilot plant scale using small commercial cheeses (80 g) was carried out with the aim to determine the HPP capacity to inhibiting the outgrowing of spoilage microorganisms. In this sense, cheeses were treated at 300 and 400 MPa (5 min at 6ºC) and their microbiological, compositional and physico-chemical evolution during cold storage was evaluated. Results indicated that HPP did not affect cheese composition and provoked only little changes in colour (more yellow) and textural (firmer) properties of fresh cheese when compared with untreated cheese. Besides, 300 and 400 MPa were able to extend fresh cheese shelf-life to 14 and 21 days, respectively. The next step was to determine the shelf-life of commercial fresh cheeses (250 g) treated at 500 MPa (5 min at 18ºC) at industrial scale, by following their microbiological, compositional, physico-chemical and sensorial evolution during cold storage of 21 days. This time, pressurised cheeses achieved a shelf-life of about 19-21 days compared to 7-8 days of the untreated cheese. However, 500 MPa significantly affected colour, microstructural, textural and sensory characteristics, but the preference for the treated cheese was not affected. It is also worth noting that HPP was able to maintain the aroma characteristics of cheese throughout its shelf-life, leading to a delay in the formation of volatile compounds responsible for off-flavours. Additionally, an inoculation study with Listeria spp. was carried out in order to evaluate the effectiveness of the HPP (300-600 MPa for 5 min at 6°C) to assure food safety. Three bacterial strains (L. monocytogenes Scott A and CECT 4031, and its surrogate L. innocua CECT 910) were selected to study the initial inactivation achieved, the sublethal damage generated and microbial growth during 15 days of storage at 4°C. Treatment at 300 MPa did not inactivate any of the strains inoculated. Conversely, 500 and 600 MPa were effective to achieve significant reductions of pathogen counts in fresh cheese. On the other hand, treatment of fresh cheese within the range of 300-600 MPa did not produce significant sublethal injury. Regarding behaviour differences among Listeria strains, it was observed that L. monocytogenes CECT 4031 was the most sensitive and L. monocytogenes Scott A the most resistant to HPP. Finally, growth during cold storage was not prevented since viable cells remain after the treatment. Counts of cheeses treated at 300 MPa were not different from untreated cheese counts, for all strains and inocula level used. On the other hand, differences in rate of growth among strains were observed. Scott A strain showed the lowest rate for all conditions studied. These results confirm that the fresh cheese, due to their characteristics of pH and aw, is able to support growth of Listeria spp.

Les lesions de medul·la espinal són imprevisibles i devastadores per a aquells que les pateixen. Les conseqüències d’aquestes lesions comporten l’aparició de símptomes positius i negatius, especialment per sota del nivell de la lesió. Els dèficits són sensorials, motors i autonòmics, i inclouen fenòmens com la hiperreflèxia i la espasticitat. Curiosament, la manca de sensibilitat no és incompatible amb l’aparició de dolor neuropàtic, que es presenta sovint després de les lesions medul·lars. Aquesta modalitat de dolor està causada per la lesió o la disfunció d’elements del sistema nerviós, i les opcions per tractar-lo són limitades i només efectives en alguns casos. En aquesta tesi hem caracteritzat l’aparició de signes de dolor així con els dèficits motors i funcionals després d’una contusió espinal en rata. Els nostres resultats indiquen la persistència dels símptomes de dolor i els dèficits funcionals, i també destaquen la important plasticitat present als segments medul·lars que no han estat afectats directament per la lesió. Els segments lumbars, per exemple, poden influir en l’aparició i el manteniment de la hiperalgèsia i la hiperexcitabilitat central. A l’última part d’aquesta tesi hem administrat dos tractaments farmacològics amb la intenció de modular alguns d’aquests elements plàstics per tal de poder reduir els signes de dolor neuropàtic. / Las lesiones de medula espinal son imprevisibles y devastadoras para aquellos que las sufren. Entre sus consecuencias se encuentran síntomas positivos y negativos, especialmente por debajo del nivel de la lesión. Los déficits son sensoriales, motores y autonómicos y incluyen fenómenos como la hiperreflexia y la espasticidad. Curiosamente, la pérdida de sensibilidad no es incompatible con la aparición de dolor neuropático. Esta modalidad de dolor está causada por la lesión o disfunción de elementos del sistema nervioso, y tiene limitadas opciones de ser tratado, ya que los tratamientos sólo son efectivos en algunos casos. En esta tesis hemos caracterizado la aparición de signos de dolor y los déficits funcionales después de una contusión medular en la región torácica en ratas. Nuestros resultados indican la persistencia de los síntomas de dolor y los déficits funcionales, y destacan la importancia de la plasticidad de los segmentos medulares que no han sido directamente lesionados. Los segmentos lumbares, por ejemplo, pueden influir notablemente en la aparición y el mantenimiento de la hiperalgesia y la hiperexcitabilidad central. En la última parte de esta tesis hemos usado dos fármacos con la intención de modular alguno de estos elementos plásticos para poder así reducir los signos de dolor neuropático. / Spinal cord injury (SCI) is a devastating and unexpected event that greatly influences the life of those who suffer it. SCI consequences include the appearance of positive and negative signs, especially below the lesion site. These include the loss of autonomic, sensory and motor function, amongst other symptoms such as hyperreflexia and spasticity. Curiously, despite the loss of sensitivity below the injury site, SCI are normally accompanied by the appearance of neuropathic pain. This modality of pain is caused by the lesion or the dysfunction of elements of the nervous systems, and the treatment options are scarce and only effective in some cases. In this thesis we have characterized the appearance of neuropathic pain signs, as well as motor and functional deficits, in a model of spinal cord contusion in rats. Our main results indicate the persistence of pain signs and functional deficits, as well as highlight the important plasticity of those segments not directly affected by the injury itself. These segments, such as the lumbar segments, can really influence the development of hyperalgesia and central hyperexcitability. In the last part of this thesis we have tested two different pharmacological treatments in order to modulate some of these plastic elements to ameliorate the neuropathic pain signs.

In the last years our research has been focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cells, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in fetal and neonatal murine hepatocytes, as well as in liver tumor cells, and chronic exposure of these cells to TGF-β iinduces a process of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT). In the present work we wanted to identify TGF-β-regulated genes that being involved in EMT and cell invasion could also participate in the control of growth, apoptosis and/or differentiation. Firstly we analyzed the role of genes regulated by TGF-β and implicated in EMT that might participate in apoptosis control in hepatocytes, focusing on Snail and SPARC. Inhibition of Snail, through targeting knock-down with specific siRNA, impairs TGF-β-induced EMT in murine hepatocytes and significantly enhances their apoptotic response, which indicates that Snail plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Snail downregulation impairs the TGF-β-induced EGFR ligands expression and inhibits the phosphorylation of Akt, Erks and c-Src family, which is coincident with activation of mitochondrial-dependent apoptotic events and an earlier Smad3 phosphorylation in TGF-β-treated cells. We also demonstrate a role for Snail in sensitizing murine hepatocytes to cell death by anoikis, which is a relevant phenomenon in metastatic processes. Snail1 downregulation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells, which are partially or fully resistant to TGF-β suppressor effects, restores the apoptotic response to TGF-β. TGF-β induces SPARC expression in FaO rat liver tumor cells but not in neonatal murine untransformed hepatocytes. SPARC inhibition, through targeting knock-down with specific siRNA, reveals a role for SPARC in mediating TGF-β-induced EMT in liver tumor cells. Furthermore, SPARC knock-down significantly enhances the TGF-β-induced apoptotic response. Interestingly, SPARC effects might be mediated by Snail, since SPARC silencing impairs Snai1 up-regulation by TGF-β in FaO cells. We next wanted to study the tumorigenesis of FaO cells after in vitro chronic treatment with TGF-β for 4 weeks (TβT-FaO). For this, we injected these cells through both subcutaneous and intrasplenic procedures. Liver tumor formation derived from intrasplenic injection of FaO cells induced a multifocal highly proliferative hepatocarcinoma in all mice, whereas parallel inoculation of TβT-FaO cells promoted low proliferative unifocal and heterogeneous hepatic lesions which showed higher staining for phospho-Smad2. Detailed analysis of tumors revealed lesions with bile duct characteristics and lesions with a dedifferentiated (hepatoblast) phenotype. Primary culture of tumor cells from both FaO- and TβT-FaO-induced intrasplenic lesions indicated that only cells obtained from FaO-induced tumors undergo apoptosis in response to TGF-β, whereas TβT-FaO-derived tumors contain cells that are fully resistant. Analysis of the phenotype of tumors and their derived cells showed that intrasplenic injection of TβT-FaO cells may produce cholangiocarcinoma-like and hepatoblastoma-like tumors. In summary, chronic in vitro TGF- β treatment of FaO cells changed their tumorigenic potential. Tumor growth was slower but cells are resistant to apoptosis. Futhermore, phenotype of lesions reflected a stem-like phenotype which provokes the appearance of less differentiated tumors (hepatoblastomas) or transdifferentiation to a different liver tumor lineage (cholangiocarcinomas). / En el trabajo actual hemos querido identificar genes regulados por TGF-β que estando implicados en EMT e invasión celular puedan también participar en el control del crecimiento, apoptosis y/o diferenciación, centrándonos en Snail y SPARC. La inhibición de la expresión de Snail impide la EMT inducida por TGF-β en hepatocitos murinos y aumenta su respuesta apoptótica, indicando un papel importante de Snail confiriendo resistencia a la muerte inducida por TGF-β. El TGF-β también induce señales anti-apoptóticas, mediadas por la activación del EGFR. La cancelación de Snail impide la inducción mediada por TGF-β de los ligandos del EGFR e inhibe la fosforilación de Akt, ERKs y familia c-Src, hecho coincidente con la activación de eventos apoptóticos dependientes de la mitocondria y con una fosforilación temprana de Smad3 en las células tratadas con TGF-β. También demostramos el papel de Snail en la sensibilización de los hepatocitos a la muerte celular por anoikis. La disminución de los niveles de Snail1 en células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), restaura la respuesta apoptótica al TGF-β. El TGF-β induce la expresión de SPARC en las células tumorales FaO de hepatoma de rata pero no en los hepatocitos neonatales murinos no transformados. La inhibición de la expresión de SPARC revela un papel de SPARC en la inducción de EMT y en la respuesta apoptótica mediada por TGF-β en células tumorales hepáticas. A continuación quisimos estudiar el potencial tumorogénico de las células FaO después de un tratamiento in vitro crónico con TGF-β durante 4 semanas (TβT-FaO). Inyectamos estas células en ratones inmunodeprimidos para provocar la formación de tumores tanto subcutáneos como ortotópicos (inyección intraesplénica). La inoculación intraesplénica de células FaO indujo un carcinoma hepatocelular multifocal altamente proliferativo en todos los ratones, mientras que la inoculación paralela de células TβT-FaO promovió la formación de lesiones unifocales, heterogéneas y con baja proliferación que mostraron un fuerte marcaje para Smad2 fosforilado. Un análisis detallado de los tumores mostró lesiones con características de ducto biliar y lesiones con un fenotipo desdiferenciado (hepatoblastos). El cultivo primario de las células provenientes de estos tumores indicó que sólo las células obtenidas de los tumores FaO sufren apoptosis en respuesta al TGF-β, mientras que los tumores derivados de los TβT-faO contienen células que son completamente resistentes. En resumen, el tratamiento crónico in vitro con TGF-β de las células FaO cambió su potencial tumorogénico. El crecimiento tumoral fue más lento pero las células son resistentes a la apoptosis. Además, el fenotipo de las lesiones refleja un fenotipo tipo célula progenitora que provoca la aparición de tumores menos diferenciados o la transdiferenciación a una línea tumoral hepática distinta.

La presente tesis doctoral tiene como objetivos principales valorar el efecto del tipo de carbohidratos en el alimento sobre el engrasamiento de la canal, en dos razas porcinas: el cerdo ibérico y el landrace. En una primera fase experimental se utilizaron 48 cerdos (88,4 kg PV), 24 Ibéricos y 24 Landrace, a los que se administraron dos raciones que diferían en las principales fuentes de carbohidratos: maíz (Dieta MZ), altamente digestible, o maíz-sorgo y bellota (Dieta SB), más resistente a la digestión enzimática y con mayor tendencia a ser fermentada. Cuando los animales alcanzaron un peso vivo medio de 110 kg, se sacrificó a la mitad. La segunda fase se llevó a cabo con los 24 animales restantes, 12 ibéricos y 12 landrace (108 kg PV). Se mantuvieron los tratamientos dietéticos, incrementando el aporte de bellota en la dieta SB en detrimento del maíz. El sacrificio se realizó a un peso vivo medio de 135 kg.Durante el periodo experimental, los cerdos ibéricos manifestaron una superior ingestión voluntaria (entre un 25 y 35%: P < 0.01), que les impuso los peores índices de transformación. Entre dietas experimentales no se observaron diferencias en los rendimientos productivos, salvo en la segunda fase experimental donde el incremento del aporte de bellota provocó un descenso de la ingestión voluntaria (P = 0,08). La digestibilidad ileal de la materia orgánica fue superior en los cerdos landrace que en los ibéricos (P < 0,05) y con la dieta MZ que con la SB (P < 0.01). La fermentación en el tracto digestivo posterior de los animales permitió compensar en parte estas diferencias, salvo en el caso del cerdo ibérico alimentado con SB, que continuó presentando los menores coeficientes de digestibilidad para el tracto digestivo total. Esta incapacidad por parte del cerdo ibérico para fermentar todo el substrato alcanzaba su intestino grueso vino determinada, principalmente, por la superior velocidad de tránsito de la digesta en su compartimento digestivo, calculada con el marcador inerte. Todas estas diferencias entre razas y entre dietas afectaron a la extensión y tipo de fermentación en el intestino grueso. En concreto, se observaron diferencias en la concentración y el perfil de ácidos grasos volátiles. También en la concentración de bases púricas, como medida cuantitativa de la flora microbiana presente, y en la actividad enzimática de esta flora microbiana frente a diferentes substratos de carbohidratos. En general, los cerdos landrace tuvieron una mayor presencia microbiana en el ciego (P < 0,05), y menor en el colon (P < 0.05) que los cerdos ibéricos. Sin embargo, la flora microbiana presente en el ciego de los cerdos ibéricos presentó una mayor actividad in vitro frente a todos los substratos de carbohidratos analizados.Con referencia al engrasamiento, los cerdos ibéricos presentaron una mayor actividad enzimática lipogénica que los cerdos landrace, tanto en el depósito subcutáneo como en el intramuscular. Estos resultados se correspondieron con un superior (P < 0,001) espesor de la grasa dorsal y contenido de grasa intramuscular. Además, la grasa del cerdo ibérico se caracterizó por tener un menor contenido de AG poliinsaturados y superior de monoinsaturados. Entre dietas, no hubo diferencias importantes salvo una tendencia (P = 0,07) en el espesor de la grasa subcutánea dorsal, superior para la ración MZ que para la SB. Como conclusión, es evidente la participación genética en muchas de las diferencias que definen al cerdo ibérico y al landrace. Sin embargo, el tipo de carbohidratos de la ración puede promover en cada raza diferentes estrategias digestivas para su aprovechamiento. Como resultado, también podrían tener cierta influencia en el metabolismo lipídico, aunque de forma diferente para cada raza. / This current thesis has as main objectives to assess the effect of the source of dietary carbohydrates on the carcasse fatness in two different swine breeds: the Iberian and the Landrace pigs. In one first experimental phase 48 pigs were used (88.4 kg LW), 24 Iberian and 24 Landrace, which were fed with two experimental diets differing in the main sources of carbohydrates: maize (Diet MZ), highly digestible, or maize-sorghum and acorn (Diet SB), more resistant to the enzymatic digestion and with a higher tendency to be fermented. When animals reached an average body weight of 110 kg, the half of them were slaughtered. The second experimental phase were developed with the rest of pigs, 12 iberian and 12 landrace (108 kg LW). Dietary treatments were maintained, increasing the proportion of acorn in the diet SB in spite of maize. Pigs were slaughtered at an average body weight of 135 kg.Along the experimental period, Iberian pigs showed a higher voluntary feed intake (about 30%: P < 0.01), promoting worse feed:gain ratios. Between experimental diets were not observed differences in productive performances, except for a lower feed intake in pigs fed diet SB in the second experimental phase (P = 0,08), when acorn proportion was increased. Ileal digestibility of the organic matter was higher in landrace than in iberian pigs (P < 0,05) and in diet MZ than in SB (P < 0.01). Fermentation in hindgut allowed to compensate these differences in part, except for Iberian pigs fed diet SB, which showed the lowest digestibility coefficients in the whole of the digestive tract. The lower ability to ferment the whole of the substrate that reached the hindgut by Iberian pig was mainly associated to the lower transit time of digesta throughout its digestive compartment, calculated based on an indigestible flow marker.All these differences between breeds and diets affected to the extent and type of fermentation in the hindgut. In particular, differences were observed in the volatile fatty acids concentration and profile. Differences were also observed in purine bases concentration, as a quantitative value of the microflora, and in enzymatic activity of this microflora against different carbohydrate substrates. Landrace pigs showed a higher microflora concentration in caecum (P < 0,05), and lower in colon (P < 0.05) than Iberian pigs. However, microflora in caecum of Iberian pigs showed a higher in vitro activity against all carbohydrate substrates analysed. In reference to the fatness, Iberian pigs showed a higher lipogenic enzymatic activity than Landrace ones in both, subcutaneous and intramuscular depots. These results were associated with a higher (P < 0.001) backfat thickness and intramuscular fat content. Moreover, the Iberian pig fat had a lower polyunsaturated and higher monounsaturated FA contents. Between diets, there were not differences except for a tendency (P = 0,07) in backfat thickness, higher for diet MZ than for diet SB. In conclusion, it is evident a genetic contribution in many differences between Iberian and Landrace pigs. However, the type of dietary carbohydrates can promote in each breed different digestive strategies to their digestion. As a result, carbohydrates also could influence in lipid metabolism, although in different way depending on breed.

Antecedents del tema: La mesura de la força muscular es molt útil en la rehabilitació. Tant per planificar-la com per monitoritzar-la. Igualment es una eina fonamental en l’avaluació del dany corporal o seqüeles. La dinamometria isocinètica és una eina fiable de mesura de la força muscular dinàmica. No obstant per la seva validesa s’ha de garantir que el subjecte avaluat faci un esforç màxim. En certes poblacions (com ara els pacients laborals) avaluar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova esdevé crucial per les possibles implicacions mèdico-legals. En diferents articulacions i accions i, en concret, pel que fa a rotadors externs d'espatlla s'ha trobat que la diferència entre les ràtios excèntric-concèntric a velocitat alta i baixa (DEC) és un bon paràmetre per identificar esforços submàxims en una població de voluntaris sans. No obstant això, no es tenen dades sobre la seva utilitat en pacients laborals reals. Hipòtesi: El DEC és un paràmetre vàlid per estimar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs a una població de pacients laborals reals. Objectius: Analitzar el comportament, i eventual utilitat, del DEC en una mostra de pacients reals afectats de patologia de l'espatlla i avaluats mitjançant dinamometria isocinètica al final del procés de rehabilitació. Metodologia: Estudi observacional de 74 pacients laborals amb patologia musculoesquelètica d'espatlla avaluats mitjançant dinamometria isocinètica de rotadors externs al costat afecte i contralateral. La prova es realitza a 30º/s i 120º/s a modalitat concèntrica i excèntrica .Es recullen dades demogràfiques (edat, sexe i pes), clíniques (diagnòstic, durada del procés i situació funcional a l'alta) i dinamomètriques (Pic de moment de força, Ràtios excèntrics concèntrics, DEC i dèficits comparant extremitat afecta i sana). Les dades s'analitzen per separat per a dones i homes i en relació al resultat del DEC. Resultats: Utilitzant el nivell de tall de DEC marcat per l'estudi previ en subjectes sans (0.81) la proporció de pacients etiquetats de no col•laboradors, especialment dones, era enorme. Per tant es va decidir usar els valors de l'extremitat sana per avaluar l'afectació. Aplicant aquest criteri, cinquanta-dos pacients van mostrar el costat afecte uns valors de DEC dins dels rangs considerats com normals i, per tant, es van etiquetar de col• laboradors. Deu tenien uns DEC superiors al límit superior i es van considerar no col•laboradors. Finalment hi havia 12 pacients amb uns valors de DEC extremadament baixos que es van considerar com no col•laboradors. La comparació entre sexes va mostrar una gran diferència significativa proporció de col•laboradors a favor dels homes . En els col•laboradors els dèficits registrats dels pacients sense incapacitat al final del procés mostraven uns valors molt significativament més baixos que els pacients que van acabar en incapacitat. Conclusions: El DEC pot ser una bona eina pel mesurament del nivell de col•laboració -i per tant per assegurar la validesa- durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs d'espatlla en pacients laborals. No obstant això, es necessiten més estudis en dones i poblacions no laborals per definir millor la seva utilitat. La validesa de la dinamometria isocinètica, i implícitament la del DEC, en poblacions laborals es indicada per relació significativa entre els dèficits de força analitzats i el nivell d’incapacitat. / Introduction: Muscle strength measurement is crucial in rehabilitation Planning and results assessment. Isokinetic dynamometry is a reliable and valid strength measurement tool. However, its validity depends on the veracity of the measurements. Among other factors, patient collaboration during test performance is crucial. Thus an estimate of collaboration is highly desirable. The DEC (High and low velocity eccentric to concentric ratios difference) has been proven to be an efficient tool to assess maximility of effort in a number of joints and actions. However, its usefulness in real patient shoulder external rotator effort measurement has not been previously assessed. Hypothesis: The DEC is a valid parameter to assess the collaboration level in work injury patient during shoulder external rotator isokinetic tests. Objectives: to analyze DEC behavior and usefulness in maximality of effort assessment in a sample of shoulder work injury patient undergoing rehabilitation. Methods: Observational study of 74 shoulder injury patients evaluated through shoulder external rotator isokinetic tests. Concentric and eccentric performances of injured and uninjured sides were recorded at 30 and 120º/s. Results: Fifty-two patients had their injured side DEC values within the normal range and were thus labeled as maximal performers. Ten patients had higher than cutoff DEC values, indicating submaximal effort whereas 12 patients had exceedingly low DEC values. Gender comparison showed a significantly different proportion of maximal performers. Strength deficits registered in patients demonstrating maximal performance correlated with the final outcome. The findings support the application of the DEC for determination of the extent of weakness of shoulder external rotators in male patients. Conclusion: In terms of shoulder external rotators status in male worker injury, the results support the application of isokinetic tests both in the clinical and medico legal sense. However, the gender discrepancy warrants further research.

El diagnóstico de la tuberculosis (TB) se basa en gran medida en métodos microbiológicos convencionales: a) un cribado mediante microscopía de bacilos ácido-alcohol resistentes que permite de forma rápida, sencilla y económica una primera orientación hacia el diagnóstico de TB en caso de que la baciloscopia sea positiva; y b) el cultivo de las muestras clínicas en medios específicos para micobacterias. El cultivo micobacteriano es el método considerado gold standard en el diagnóstico microbiológico de la TB, y además, permite obtener el aislamiento clínico con el que posteriormente se puede estudiar la sensibilidad a los fármacos antituberculosos o realizar análisis epidemiológicos. Sin embargo, estos métodos fenotípicos convencionales son insuficientes para un control eficaz de la tuberculosis, debido sobre todo a la baja sensibilidad de la microscopía y a la lentitud del cultivo micobacteriano. En este sentido se han desarrollado técnicas basadas en la amplificación genómica por PCR (polymerase chain reaction) y posterior estudio post-amplificación, fundamentalmente mediante hibridación en fase líquida o sólida, con sondas complementarias a los genes de interés, tanto para la detección del microorganismo como de su resistencia a los fármacos. En esta tesis se trata de evaluar, en un primer bloque, dos de los sistemas comerciales más recientes para el diagnóstico rápido de la TB. Uno de ellos es el sistema integrado de PCR a tiempo real, Xpert MTB/RIF (Cepheid, EEUU). Así se propuso determinar la eficacia de este sistema en casos de alta sospecha de tuberculosis y baciloscopia negativa, en nuestra área. En términos de sensibilidad se detectó un 78,2% de los casos de tuberculosis pulmonar y un 58,3% en los casos de tuberculosis extrapulmonar. Además, se determinó, en un estudio de rentabilidad potencial del uso en rutina de esta técnica, que el uso del Xpert MTB/RIF puede adelantar en una media de una semana el inicio del tratamiento antituberculoso, además de ahorrar recursos económicos en el diagnóstico (hasta 2000 euros). Por otro lado, la evaluación el sistema GenoQuick MTB (Hain LIfescience, Alemania) de PCR convencional y posterior hibridación rápida en fase sólida (lateral-flow dipstick), mostró a esta técnica como una alternativa a la previamente descrita al comprobarse que la sensibilidad obtenida en muestras con baciloscopia negativa fue de 78,1%, con una discreta mayor complejidad técnica pero también con un menor coste económico. Estos sistemas de PCR e hibridación se revelan como métodos muy útiles para la detección directa en muestra clínica de M. tuberculosis complex. Otro aspecto muy relevante, sobre el que también se ha investigado en los últimos años, es el de la detección de mutaciones genéticas implicadas en la resistencia a los principales fármacos antituberculosos. De esta forma se planteó, en un segundo bloque de la tesis, el diseño y desarrollo de un sistema propio de microarrays (sistemas miniaturizados de amplificación e hibridación con oligonucleótidos fijados en una matriz orgánica) para la detección rápida de la resistencia de algunos de los fármacos antituberculosos más importantes. Tras caracterizar las mutaciones presentes en los aislamientos resistentes de nuestra área y basándose también en las mutaciones más frecuentemente descritas en la literatura, se diseñaron dos microarrays de baja densidad y bajo coste, 1) para la detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la estreptomicina y las fluoroquinolonas (obteniéndose una sensibilidad del 92,5% y el 87,5%, respectivamente; y 2) al etambutol (con una sensibilidad y especificidad del 100%). Este sistema de microarrays se plantea como una buena alternativa a los sistemas comercialmente disponibles, al tener un coste económico menor y ofrecer la flexibilidad de añadir más o diferentes dianas de resistencia, en función del perfil de mutaciones de cada área geográfica. / Tuberculosis remains one of the biggest health threats, causing around 8.5 million of new cases and 1.5 million deaths worldwide, each year. The two cornerstones for the tuberculosis control are rapid diagnosis and rapid detection of drug resistance, allowing prompt initiation of the adequate pharmacological treatment and avoiding the spread of the disease to other individuals. Conventional microbiological methodologies for tuberculosis diagnosis are the smear microscopy and the mycobacterial culture. Nevertheless, the microscopy has low sensitivity especially in cases of extrapulmonary tuberculosis, and Mycobacterium tuberculosis complex culture is very slow. In the past two decades, molecular methodologies have emerged as valuable tools for rapid diagnosis in the field of tuberculosis. In the first block of the thesis, we determined the effectiveness of two techniques for direct detection of M. tuberculosis complex. The sensitivity of the Xpert MTB/RIF (Cepheid) was 78.2% in pulmonary samples and 58.3% in extrapulmonary specimens, all smear-negative. The sensitivity of the GenoQuick MTB (Hain Lifescience) was 78.1% among smear-negative specimens. Given the high economical cost of the Xpert MTB/RIF test, but once proven its advantages for rapid diagnosis, we tried to determine the potential cost-effectiveness of using this technique in daily routine, in an area of low-medium incidence of tuberculosis. In terms of economical costs, the performance of the Xpert MTB/RIF could save a median of 2,000 € among smearnegative patients. In the second part of the thesis, we developed and evaluated a low-cost low-density microarray (LD-SQ) designed for the detection of the main mutations most frequently described to be related to streptomycin, second-line anti-tuberculous injectable drugs (rrs and rpsL genes) and fluoroquinolones (gyrA gene). The microarray detected 92.5% of the mutations related to streptomycin and 87.5% to fluoroquinolones. We also characterized the most prevalent embB mutations related to resistance to ethambutol in our area, and developed a low-cost low-density microarray (LD-EMB) for the rapid detection of these mutations, obtaining a 100% of sensitivity and specificity. The microarray platforms developed for rapid detection of streptomycin, fluoroquinolones and ethambutol showed up as an alternative for rapid diagnosis of drug resistance, with the advantage, compared to other commercially available techniques, of being lower cost and including more targets and codon substitutions, as well as the flexibility to exchange them, depending on the needs of each setting.

La calidad de los oocitos es sinónimo de competencia oocitaria y se define como la capacidad de un oocito para reanudar la meiosis, dividirse después de la fertilización, desarrollarse hasta la etapa de blastocisto, inducir la preñez y conseguir el nacimiento de un animal sano. La selección de los oocitos más competentes es un punto clave en los programas de producción in vitro de embriones (PIVE). El test de Azul de Cresol Brillante (BCB) es un método no invasivo que separa los oocitos que han finalizado su crecimiento (BCB+: citoplasma azul) de los oocitos con la enzima G6PDH activa o oocitos en proceso de crecimiento (BCB-: citoplasma incoloro). En esta tesis, hemos llevado a cabo 3 estudios para probar la capacidad del BCB en seleccionar los oocitos más competentes para la producción in vitro de embriones utilizando corderas como donantes de oocitos. Además se estudiará la competencia oocitaria en relación con el citoplasma y factores moleculares, sus respuestas a las diferentes técnicas de fecundación y nuevos medios de maduración para mejorar la PIVE. En el Experimento 1, se analizaron diferentes concentraciones del BCB (13, 26, 39 y 52 µM) y los oocitos fueron MIV-FIV y CIV. Se evaluó: diámetro de los oocitos, actividad mitocondrial, actividad del factor promotor de la maduración (MPF), la expresión de genes relacionados con el metabolismo (ATP1A1 y COX1) y la función constitutiva de la célula (CPEB y S100A10) y el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Los resultados mostraron que 13 µM de BCB es una concentración adecuada que diferencia los oocitos más grandes (BCB+: 123,66 µm), competentes para desarrollar hasta blastocisto (21%) y con más células (69,71±6,19) que los BCB- (106,82 µm, 9% y 45,91±3,35, respectivamente). La actividad mitocondrial fue mayor en los BCB+ que en los BCB- (3369 y 1565 unidades arbitrarias, respectivamente) y también la actividad de MPF (1,479±0,09 y 1,184±0,05 densidad óptica, respectivamente). La expresión de genes no mostró correlación con la calidad de los oocitos. El objetivo del experimento 2 fue mejorar la producción in vitro de los oocitos BCB- mediante la adición de insulina transferrina selenio y ácido ascórbico durante 12 y 24 h de la MIV. El MPF y el contenido de ATP se midieron antes y después de la MIV. Los resultados no mostraron diferencias en la producción de blastocistos entre los oocitos BCB-. El MPF y el ATP aumentaron en todos los grupos (P <0,001) después de la MIV. En el Experimento 3 se estudiaron técnicas de fecundación como la FIV, ICSI y la activación partenogénetica (AP) en los oocitos BCB+ y BCB-. Se analizó el contenido del ATP intracelular. Los oocitos BCB+ tuvieron un desarrollo hasta blastocito significativamente mayor tras la FIV y la AP (31,7% y 20,5%, respectivamente) que los BCB- (6,7% y 8,8%, respectivamente). Sin embargo los oocitos inyectados (ICSI) no mostraron diferencias en los blastocistos producidos entre los BCB+ y BCB- (14,3% vs 11,8%, respectivamente). Los oocitos BCB+ mostraron tener mayor concentración de ATP que los BCB-. Finalmente podemos concluir que el test del BCB es una metodología fácil, rápida y adecuada para seleccionar los oocitos de corderas más competentes. Los oocitos BCB+ mostraron una mayor producción de blastocistos, actividad mitocondrial y del MPF y mayor contenido de ATP que los BCB-. El test de BCB es un método útil para ser incorporado en los protocolos de PIVE cuando se trabaja con un gran y heterogéneo número de oocitos. Sin embargo este test es menos interesante cuando se trabaja con un pequeño número de oocitos, como en laparoscópica o ICSI. / The oocyte quality is used as synonymous of oocyte competence defined as the ability of an oocyte to resume meiosis, cleave following fertilization, develop to the blastocyst stage, induce a pregnancy and bring the offspring to term in good health. The selection of more competent oocytes is an important point in in vitro embryo production programs. The Brilliant Cresyl Blue (BCB) test has been successfully used as a non invasive methodology to classify oocytes according to their cytoplasm coloration as grown (BCB+: blue cytoplasm) or growing (BCB-: colorless cytoplasm) oocytes. To our knowledge there are no previous reports using this test to select competent oocytes in sheep. We have carried out 3 studies to test the ability of the BCB to select the most competent prepubertal sheep oocytes for in vitro blastocyst embryo production. Furthermore, we pretend to improve the knowledge about oocyte competence related to their cytoplasmic and molecular performances, their responses to different techniques of fertilization and to test new maturation media to improve the blastocyst production. In Experiment 1, different concentrations of the BCB test (13, 26, 39 and 52 µM) were analyzed. After BCB culture all of oocytes were IVM-IVF and IVC. The parameters assessed in this study were: oocyte diameter, mitochondrial activity, maturation-promoting factor (MPF) activity, mRNA relative expression (RE) of genes related to metabolism (ATP1A1 and COX1) and constitutive function of the cell (CPEB and S100A10) and the blastocyst development. The results showed that 13 µM BCB during 60 min could be a suitable concentration to differentiate largest (BCB+, 123.66 µm) and most competent oocytes to develop to the blastocyst stage (21%) and with a higher number of cells (69.71±6.19 S.E.M.) compared with non-stained BCB- oocytes (106.82 µm, 9% and 45.91±3.35 S.E.M., respectively). Mitochondrial activity, assessed by MitoTracker Orange CMTMRos probe, was significantly higher in BCB+ than in BCB- oocytes after in vitro maturation (3369 and 1565 Arbitrary Units, respectively) and the MPF activity, assessed by CDC2 kinase activity assay, showed significantly higher activity at metaphase II stage in BCB+ than in BCB- oocytes (1.479±0.09 and 1.184±0.05 optical density, respectively). The mRNA RE of the different genes analyzed in this work did not show a correlation with the oocyte quality. In Experiment 2, the objective was to improve blastocyst production of small (BCB-) oocytes by addition of Insulin Transferrin Selenium and Ascorbic Acid during 12 and 24 h of IVM. MPF and ATP content were measure before and after IVM. Results showed no differences in blastocyst production between BCB oocytes. The MPF and ATP increased in all groups (P<0.001) after the IVM. In Experiment 3, the aim was to test the blastocyst production after IVF, ICSI and PA of BCB+ and BCB- oocytes. ATP content was analyzed. BCB+ oocytes developed significantly higher up to the blastocyst stage after IVF and PA (31.7% and 20.5%, respectively) than BCB- (6.7% and 8.8%, respectively) oocytes. However, ICSI treated oocytes did not show these differences between BCB+ and BCB- oocytes (14.3% vs 11.8%, respectively). BCB+ oocytes had significantly more ATP content than BCB- oocytes. Finally we can conclude that the BCB test is an easy, fast and suitable methodology to select the more competent sheep oocytes. Good quality oocytes (BCB+) showed higher blastocyst production, mitochondrial and MPF activity and ATP content than BCB- oocytes. The BCB test is a useful method to be incorporated in the embryo production protocol where a large and heterogeneous number of oocytes are use to be in vitro fertilized. However, BCB test is less interesting when working with a small number of oocytes such as in Laparoscopic Ovum Pick Up (LOPU) or ICSI.