Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente usado como um organismo modelo para os aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Neste trabalho, foi investigado o papel funcional de uma ciclina de N. crassa (PCL-1), codificada pela ORF NCU08772 e ortóloga a Pcl10 de Saccharomyces cerevisiae. Na levedura, a proteína Pcl10, em conjunto com a proteína quinase dependente de ciclina Pho85, fosforila a enzima glicogênio sintase, a enzima regulatória da síntese de glicogênio. A fosforilação resulta na inativação da enzima e, portanto, em diminuição do acúmulo de glicogênio. A linhagem pcl-1 de N. crassa apresentou um atraso na germinação dos conídios e um retardo na progressão do ciclo celular quando comparado com a linhagem selvagem, sugerindo que esta ciclina pode regular o desenvolvimento e a divisão celular. Além disto, a linhagem nocauteada acumulou níveis mais elevados de glicogênio que a linhagem selvagem indicando o papel na regulação do metabolismo deste carboidrato. A fosforilação da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN) foi analisada na linhagem nocaute através de análises de atividade enzimática, e os resultados mostraram que a GSN apresentou baixo índice de fosforilação, portanto alta atividade durante o crescimento, um resultado que pode explicar o alto acúmulo de glicogênio observado. Este resultado foi confirmado por análise de 2D-PAGE seguida por western blot, utilizando anticorpos anti-GSN. GSN apresentou na linhagem mutante isoformas m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Co-orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Valéria Valete / Banca: Rafael Victorio Carvalho Guido / Banca: Érico Tosoni Costa / Resumo: eIF5A é a única proteína conhecida que contém o resíduo do aminoácido incomum hipusina (hidroxiputrescina-lisina). Este resíduo de hipusina é essencial para a função de eIF5A e é formado pela modificação de um resíduo específico de lisina em uma reação póstraducional, dependente da poliamina espermidina. A modificação no resíduo de lisina para a formação da hipusina é chamada de hipusinação, que ocorre em duas etapas: primeiramente, a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) transfere o radical 4-aminobutil proveniente da espermidina para um resíduo específico de lisina em eIF5A (posição 50 em mamíferos); em seguida, este é hidroxilado pela desoxi-hipusina hidroxilase (DOHH). Muitos autores têm demonstrado que a inibição da hipusinação pelo inibidor de DHPS GC7 ou o silenciamento de eIF5A leva à inibição da proliferação celular em vários tipos de células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais, e também induzem um efeito anti-inflamatório, evidenciado em modelo murino de diabetes e sepse. Este trabalho buscou utilizar a linhagem transformada de macrófagos RAW 264.7 para entender melhor os mecanismos pelos quais GC7 possui sua atividade. De forma complementar, foi também testado o efeito de GC7 em macrófagos de cultura primária e também em ratos. Como esperado, demonstramos aqui que GC7 inibe de maneira importante a hipusinação em linhagem RAW 264.7 e que, no entanto, este tratamento com GC7 não compromete a viabilidade celular nem altera significativamente o proteoma de células RAW 264.7. Por outro lado, GC7 inibe a produção e liberação da citocina pró-inflamatória TNF-α sem alterar os níveis de mRNA desta citocina, indicando uma modulação pós-transcricional, mais provavelmente no nível traducional, dada a função de eIF5A no processo de síntese proteica. De forma bastante interessante, este efeito de inibição na liberação de TNF-α... / Abstract: eIF5A is the only known protein containing the unusual amino acid residue hypusine (hydroxiputrescine-lysine). This hypusine residue is essential for eIF5A function and it is formed by modifying a specific lysine residue in a posttranslational reaction dependent on the polyamine spermidine. The modification of the lysine residue for the formation of hypusine is called hypusination, which occurs in two steps: first, the enzyme deoxyhypusine-synthase (DHPS) transfers the 4-aminobutyl moiety from spermidine to a specific lysine residue in eIF5A (position 50 in mammals); then it is hydroxylated by deoxyhypusine-hydroxylase (DOHH). Many authors have demonstrated that inhibition of hypusination by the DHPS inhibitor GC7 or silencing eIF5A leads to inhibition of cell proliferation in several types of mammalian cells, including tumor cell lines, and also induce an anti-inflammatory effect, as evidenced in a murine model of diabetes and sepsis. This study aimed to use the macrophage cell line RAW 264.7 to better understand the mechanisms by which GC7 has its activity. Complementarily, its was also tested the effect of GC7 in primary culture of macrophages and in rats. As expected, we show here that GC7 inhibits hypusination in RAW 264.7 cells and, on the other hand, this treatment with GC7 does not compromise cell viability nor significantly alter the proteome of RAW 264.7 cells. Moreover, GC7 inhibits the production and release of TNF-α without affecting mRNA levels of this cytokine, indicating a posttranscriptional modulation, most probably at the translational level, given the eIF5A function in the process of protein synthesis. Interestingly, this inhibitory effect on TNF-α release was also observed in primary cultures of macrophages and in vivo in rats. It was also examined the GC7 ability to inhibit cell proliferation of RAW 264.7 cells, which occurs prior to the S phase of the cell cycle and does not... / Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T06:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247927.pdf: 8834158 bytes, checksum: c3e72e9ec789411c05b1fa2447c78080 (MD5) / A proposta para este trabalho foi investigar as propriedades antitumorais de um composto isolado de WE, a dihidrocucurbitacina B (DHCB), sobre células de melanoma murino B16F10. Nos ensaios do MTT e incorporação de timidina triciada para investigar a viabilidade e proliferação celular, os resultados demonstraram que tanto a fração diclorometânica de WE (WEDC) quanto DHCB reduzem de maneira significativa a proliferação sem alterações marcantes na viabilidade das células B16F10 em cultura, porém DHCB foi menos citotóxica. O mesmo perfil não foi observado em células de fibroblasto murino NIH3T3, onde DHCB promoveu efeito apenas nas maiores concentrações. Antiinflamatórios não esteroidais (Indometacina e Naproxeno) exibiram efeito inibitório sobre a viabilidade e proliferação de células B16F10 apenas em concentrações mais elevadas. Além disso, células B16F10 não expressaram COX-2 nas condições avaliadas. Este fato direcionou nosso estudo para a investigação do efeito da DHCB sobre eventos relacionados à proliferação celular. Análises da expressão de proteínas que participam no controle do ciclo celular revelaram que DHCB foi capaz de reduzir a expressão de ciclina A e principalmente ciclina B1. Ensaios de citometria de fluxo para observar as fases do ciclo celular demonstraram que DHCB promoveu um atraso na progressão do ciclo celular, acumulando as células na fase G2/M, este fato foi acompanhado pelo surgimento de células poliplóides. Ainda por citometria de fluxo, foi observado que DHCB não induz apoptose no ensaio de incorporação de Anexina V-FITC. O surgimento de células poliplóides foi confirmado por imunofluorescência e demonstrou ainda que DHCB promove importantes alterações na distribuição dos filamentos de actina, bem como, nos pontos de adesão focal, concentrando-os. Nos experimentos in vivo, a administração de DHCB por via oral foi capaz de reduzir ambos, o crescimento tumoral e a formação de metástase em pulmão induzidos pela inoculação de células B16F10 em camundongos. Nossos resultados revelam que DHCB reduz a taxa proliferação das células B16F10 devido, pelo menos em parte, à diminuição da expressão de ciclinas, principalmente ciclina B1 e ao dano na distribuição e/ou formação do citoesqueleto de actina, inibindo com isso a citocinese, mas não a cariocinese. Além disso, DHCB foi efetiva quando administrada por via oral em camundongos e não foram observados efeitos adversos como sangramentos, diarréia ou outra alteração comportamental. De maneira geral, nossos resultados sugerem que DHCB apresenta potenciais perspectivas para utilização na terapia de combate ao câncer.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:31:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320339.pdf: 2205000 bytes, checksum: da7248619a58600198bc8e13a2b84fa8 (MD5) Previous issue date: 2013 / O Trypanosoma (Herpetosoma) rangeli é um protozoário hemoflagelado de ciclo heteroxênico. Apesar de não ser patogênico para o hospedeiro mamífero, incluindo seres humanos, infecções por este parasito podem dificultar o diagnóstico da doença de Chagas. Vários aspectos relativos ao curso da infecção do T. rangeli no hospedeiro mamífero são controversos, incluindo o mecanismo de invasão e multiplicação celular neste hospedeiro. A enzima Oligopeptidase B (OpB) está fortemente relacionada com o processo de invasão celular e patogenicidade de vários tripanosomatídeos, sendo um alvo promissor para o desenvolvimento de quimioterápicos. A OpB de T. rangeli é codificada por uma ORF de 2.139 pb que é traduzida para um polipeptídeo de 713 aminoácidos com 80.2 kDa de massa molecular. A sequência aminoacídica da OpB de T. rangeli, que corresponde a família das prolil endopeptidases, apresenta similaridade de 89,9% com T. cruzi, 86% com T. brucei e 85,5% com T. evansi, estando o domínio catalítico característico da família bastante conservado entre estes organismos. A OpB é expressa nas formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli, sendo sua atividade mensurada através da emissão de fluorescência resultante da mobilização de Ca+2 da célula hospedeira em ensaios in vitro. Os extratos proteicos das formas tripomastigotas de T. rangeli apresentaram uma emissão de fluorescência estatisticamente significativa (p < 0,01) em relação aos controles. O tratamento dos extratos proteicos com o soro anti-OpB reduziu a emissão da fluorescência de todos os extratos, no entanto, apenas para os extratos das formas tripomastigotas de T. cruzi essa redução foi significativa. A OpBr teve uma emissão de fluorescência próxima do basal revelando ausência de atividade da proteína recombinante. A avaliação da expressão da OpB durante a interação parasitos/célula hospedeira mostrou um aumento significativo (p < 0,01) da expressão da OpB em T. rangeli após trinta minutos de interação em relação aos parasitos que não entraram em contato com as células. Estes resultados demonstram o envolvimento da OpB no processo de interação do T. rangeli com a célula do hospedeiro mamífero, constituindo um importante alvo de estudo para o esclarecimento do processo de interação parasito/célula. <br>

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-16. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:25:32Z : No. of bitstreams: 1 000849457_20170731.pdf: 545648 bytes, checksum: 90575185fe94167c07bbe0d306a7ff9b (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-07T14:09:16Z: 000849457_20170731.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-07T14:10:19Z : No. of bitstreams: 1 000849457.pdf: 2208144 bytes, checksum: a6f61d019afa7cae292e1dc8dce6f3fe (MD5) / eIF5A é a única proteína conhecida que contém o resíduo do aminoácido incomum hipusina (hidroxiputrescina-lisina). Este resíduo de hipusina é essencial para a função de eIF5A e é formado pela modificação de um resíduo específico de lisina em uma reação póstraducional, dependente da poliamina espermidina. A modificação no resíduo de lisina para a formação da hipusina é chamada de hipusinação, que ocorre em duas etapas: primeiramente, a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) transfere o radical 4-aminobutil proveniente da espermidina para um resíduo específico de lisina em eIF5A (posição 50 em mamíferos); em seguida, este é hidroxilado pela desoxi-hipusina hidroxilase (DOHH). Muitos autores têm demonstrado que a inibição da hipusinação pelo inibidor de DHPS GC7 ou o silenciamento de eIF5A leva à inibição da proliferação celular em vários tipos de células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais, e também induzem um efeito anti-inflamatório, evidenciado em modelo murino de diabetes e sepse. Este trabalho buscou utilizar a linhagem transformada de macrófagos RAW 264.7 para entender melhor os mecanismos pelos quais GC7 possui sua atividade. De forma complementar, foi também testado o efeito de GC7 em macrófagos de cultura primária e também em ratos. Como esperado, demonstramos aqui que GC7 inibe de maneira importante a hipusinação em linhagem RAW 264.7 e que, no entanto, este tratamento com GC7 não compromete a viabilidade celular nem altera significativamente o proteoma de células RAW 264.7. Por outro lado, GC7 inibe a produção e liberação da citocina pró-inflamatória TNF-α sem alterar os níveis de mRNA desta citocina, indicando uma modulação pós-transcricional, mais provavelmente no nível traducional, dada a função de eIF5A no processo de síntese proteica. De forma bastante interessante, este efeito de inibição na liberação de TNF-α... / eIF5A is the only known protein containing the unusual amino acid residue hypusine (hydroxiputrescine-lysine). This hypusine residue is essential for eIF5A function and it is formed by modifying a specific lysine residue in a posttranslational reaction dependent on the polyamine spermidine. The modification of the lysine residue for the formation of hypusine is called hypusination, which occurs in two steps: first, the enzyme deoxyhypusine-synthase (DHPS) transfers the 4-aminobutyl moiety from spermidine to a specific lysine residue in eIF5A (position 50 in mammals); then it is hydroxylated by deoxyhypusine-hydroxylase (DOHH). Many authors have demonstrated that inhibition of hypusination by the DHPS inhibitor GC7 or silencing eIF5A leads to inhibition of cell proliferation in several types of mammalian cells, including tumor cell lines, and also induce an anti-inflammatory effect, as evidenced in a murine model of diabetes and sepsis. This study aimed to use the macrophage cell line RAW 264.7 to better understand the mechanisms by which GC7 has its activity. Complementarily, its was also tested the effect of GC7 in primary culture of macrophages and in rats. As expected, we show here that GC7 inhibits hypusination in RAW 264.7 cells and, on the other hand, this treatment with GC7 does not compromise cell viability nor significantly alter the proteome of RAW 264.7 cells. Moreover, GC7 inhibits the production and release of TNF-α without affecting mRNA levels of this cytokine, indicating a posttranscriptional modulation, most probably at the translational level, given the eIF5A function in the process of protein synthesis. Interestingly, this inhibitory effect on TNF-α release was also observed in primary cultures of macrophages and in vivo in rats. It was also examined the GC7 ability to inhibit cell proliferation of RAW 264.7 cells, which occurs prior to the S phase of the cell cycle and does not...

Micronúcleos são estruturas constituídas por material cromatínico contido por um envoltório nuclear e menores que o núcleo principal. Apesar do amplo uso do teste do micronúcleo na avaliação do potencial genotóxico de diversas substâncias, os trabalhos cujas preocupações sejam elucidar o mecanismo de formação dessas estruturas, seu conteúdo e a fase do ciclo celular em que surgem, são raros. O objetivo do presente trabalho foi estudar a cinética de surgimento de micronúcleos em células A549, provenientes de carcinoma de pulmão humano, submetidas à sincronização. Após duplo bloqueio por ausência de soro fetal bovino e adição de vincristina ao meio, o surgimento de micronúcleos foi acompanhado com o auxílio de um marcador para fase S. Os resultados obtidos indicam que micronúcleos podem surgir tanto durante a mitose quanto na intérfase e possuem capacidade de replicação de DNA, independentemente do núcleo principal. A capacidade de escapar ao duplo bloqueio permite sugerir que o ponto de checagem de ligação ao fuso mitótico em A549 não é funcional. Também foram observadas seqüências amplificadas de EGFR no interior dos micronúcleos. A interpretação do significado dos micronúcleos é importante para a definição de sua relação com a expulsão de oncogenes em células tumorais ou de outras seqüências amplificadas. / Micronuclei are structures composed by chromatin material contained in the nuclear envelope and smaller than the main nucleus. Micronucleus test has been widely used in the genotoxic potential evaluation of different compounds. Although a few report concerning on the mechanism of micronucleus genesis, its DNA sequences content and the cell cycle phase when they arise. The aim of this work was to analyze the kinetic of micronuclei in A549 cells from human lung carcinoma submitted to cell cycle synchronization. After double blocking by fetal bovine serum deprivation and vincristine treatment, micronucleus formation was monitored with a S-phase marker. The results have showed that both in the mitosis and in the interphasic phase, micronuclei may arise and they were able to replicate its DNA. This process seemed to be independent of main nucleus. Cellular ability to escape from double blocking suggests that mitotic spindle checkpoint in A549 is not functional. Moreover, EGFR sequences were detected into the micronucleus. It is important to elucidate the micronucleus meaning to describe precisely its association with elimination of oncogene or other amplified sequences from the tumor cells.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3132_1.pdf: 3125724 bytes, checksum: 3bf874d76ef407eac106e41b1d8b6065 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Canais iônicos são proteínas integrais, formadoras de poros na membrana plasmática das células e são de extrema importância para as funções intra e extracelulares. Os poros ajudam no transporte rápido e seletivo dos íons, nutrientes e metabolitos pela membrana plasmática, portanto estão diretamente relacionados a diferentes funções no organismo como, transmissão sináptica, contração muscular, secreção hormonal, regulação do volume celular, proliferação celular e diferenciação. Podemos classificar os canais iônicos de acordo com seu principal estímulo para ativação: temos os canais ativados por ligantes intracelulares, canais ativados por ligantes extracelulares, canais de potássio e cloreto ativados por cálcio, canais sensíveis a ácidos e canais dependentes de voltagem (Na+, K+, Ca+ e Cl-). Os canais iônicos têm sido extensamente estudados, e novas informações vêm sendo acumuladas nos últimos anos, mostrando a importância da participação destes canais em processos relacionados à homeostase, como também sua contribuição na proliferação e diferenciação celular. Nesse trabalho procuramos identificar os níveis de RNAm em quatro tipos de canais iônicos, canal de potássio de alta condutância ativado por cálcio (MaxiK), canal aniônico dependente de voltagem (pl-VDAC), Canal de cloreto ativado por cálcio (CLCA1) e Canal de potássio dependente de voltagem (hEAG1) nas células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, a partir da geléia de Wharton (hwCTMs), nas diferentes fases do ciclo (G0/G1, S e G2/M) e diferenciação celular (adipo- e osteogênica), visando contribuir no processo de terapia celular. O RNA total de hwCTMs foi extraído utilizando RNeasy mini kit (QIAGEN). O RNA transcrito em cDNA com superScript reverse (Invitrogen). PCR em Tempo Real foi realizada no ABI prisma 7500 (Applied Biosystems) usando supermix UDG (Invitrogen). Em acordo com os dados publicados, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas das células comprovadas por coloração histoquímica (alizarin red S) onde se observou o aparecimento células alongadas com presença de granulações escuras (cristais de hidroxiapatita) na matriz extracelular. A comprovação da diferenciação adipogênica foi feita por coloração histoquímica com oil red O, mostrando células com morfologia mais arredondada e presença de vacúolos de gordura. Estabelecemos que entre os quatro canais estudados, dois, CLCA1 e hEAG1, não se expressaram, enquanto a expressão dos MaxiK e pl-VDAC foi consideravelmente alto atingindo ~10% do valor de housekeeping gene Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Encontramos que a expressão dos MaxiK e pl-VDAC aumentaram durante a progressão do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M) nas hwCTMs. Detectamos que a diferenciação muda a expressão dos canais MaxiK e pl-VDAC de maneira oposta: o canal MaxiK aumenta enquanto que o pl-VDAC diminui. Os dados ampliam o conhecimento sobre os tipos dos canais iônicos e o nível da expressão nas hwCTMs aumentando a compreensão da biologia de células-tronco mesenquimais

Orientador: Sara Teresinha Ollala Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luzo_AngelaCristinaMalheiros_D.pdf: 6304878 bytes, checksum: b63321671c0c64c404503f26c1bd336a (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A reconstituição da linhagem hematopoiética é um procedimento comum no tratamento de várias doenças hematológicas e não hematológicas. A medula óssea tem sido a principal fonte de obtenção de células tronco nos últimos 50 anos. Recentemente, células tronco obtidas de sangue periférico pós-mobilização e células mononucleares de sangue de cordão umbilical humano têm sido utilizadas com sucesso. Entretanto, as células tronco parecem ter características diferentes. Vários estudos foram publicados, recentemente, analisando a expressão gênica de sub populações de células tronco de linhagem hematopoiética de medula óssea, sangue periférico e de sangue de cordão. Tendo em vista que os procedimentos de terapia celular e transplante são realizados com a infusão de sangue total, o objetivo deste trabalho foi de analisar a expressão gênica das células mononucleares totais de sangue de cordão umbilical humano, a partir da técnica de análise seriada de expressão gênica (SAGE), e compará-Ia com a biblioteca de células mononucleares de medula óssea depositada on fine no Sagemap database. A expressão das proteínas de ciclo celular foi estudada através do método de "immunobfotting': a partir de células de sangue de cordão de recém nascidos prematuros e de termo, submetidas a cultura líquida de curta duração e em cultura em meio sem i-sólido de metilcelulose, suplementados com fatores estimulantes de crescimento. As células foram analisadas de quatro em quatro horas durante 24 horas e após, a cada 24 horas até 96 horas. A leitura das culturas em metilcelulose foi realizada no 7° e no 14o. dia. A análise de expressão gênica das células mononucleares de sangue de cordão evidenciou: 44.924 tags totais (15.519 tags únicas; 7772 genes conhecidos; 3935 seqüências preditas ou anotadas e 3812 genes desconhecidos) A medula apresentou 36577 tags totais (13075 tags únicas, 6711 genes conhecidos; 3371 seqüências preditas ou anotadas e 2993 genes desconhecidos). A análise funcional foi realizada através dos programas Gene Ontofogy Consortium e David. A distribuição por categoria foi similar nas duas bibliotecas. A análise detectou 48 genes com diferença na abundância de expressão ~ 10 e :510 e classificados no programa UniGene. Trinta e cinco foram mais expressos em sangue de cordão e estavam relacionados com resposta imune, ciclo celular e migração trans endotelial (homing). A validação do SAGE foi realizada através do método de reação em cadeia da polimerase, em tempo real quantitativo (qPCR), em 11 genes diferencialmente expressos, confirmando os resultados obtidos em 10 dos 11 genes validados, apresentando uma porcentagem de confirmação de 90%. Os resultados de alfa, beta e gama globina foram comparáveis aos da ontogenia da linhagem hematopoiética. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, e NKG7 foram mais expressos em sangue de cordão e S100-A8 na medula óssea. A análise dos ensaios clonogênicos evidenciou um aumento significativo no número de colônias no i e no 14° dia nas culturas de sangue de neonatos prematuros, com significância estatística. Houve um aparecimento precoce das colônias no sétimo dia de cultura. As características morfológicas das culturas das células dos prematuros, no sétimo dia, eram semelhantes as das culturas de termo no décimo quarto dia. As culturas de prematuros no décimo quarto dia apresentavam grande quantidade de fibroblastos e se assemelharam, em número e morfologias, às de recém nascidos de termo com vinte e um dias de cultura. A análise da expressão das proteínas de ciclo celular demonstrou aumento de expressão de p130 à partir de 4 horas, cumulativo, desaparecendo ou diminuindo a partir de 24 horas. A expressão de p107 ocorreu após as 24 horas de cultura, acumulando até 96 horas. Entretanto, as expressões de p130 e p 107 foram maiores nas células de sangue de cordão que nas da medula óssea. Estes resultados sugeriram que as células de sangue de cordão umbilical de recém nascidos prematuros poderiam apresentar uma rápida progressão em ciclo celular. Os resultados aqui obtidos abrem novas perspectivas na caracterização funcional destes genes que poderão contribuir para um maior conhecimento da biologia das células de sangue de cordão umbilical / Abstract: Haematopoietic reconstitution is a common procedure for many haematological and non-haematological diseases. Up to now, total mononuclear bone marrow cells have been the main source for this procedure. Lately, total mononuclear peripheral and cord blood cells have also been successfully used. Many studies of gene expression profile of bone marrow, peripheral or cord blood manipulated cells have been performed during the last few years but, as total mononuclear cells have usually been used in clinical practice, the present study had the aim to compare, using serial analysis of the gene expression (SAGE), cord blood mononuclear cells with the bone marrow mononuclear celllibrary already deposited in Sagemap database. The cell cycle proteins expression were analysed by immunoblotting proceeding with umbilical cord blood cells from premature and full term neonates, submitted to clonogênic assays performed with short liquid culture and semi-solid methylcellulose culture, supplemented with growth factors. The cells were collected and analysed each four hours during the first 24 hours. Then, they were collected and analysed each 24 hours till 96 hours Cord blood revealed 44.924 tags (total) representing 15.519 unique tags (7772 known genes; 3935 sequence predicted or annotated; 3812 no matches). Bone marrow showed 36577 tags (total) representing 13075 unique tags (6711 known genes; 3371 sequence predicted or annotated; 2993 no matches). Genes were annotated using Gene Ontology Consortium. Category distribution was similar in both libraries. We found 48 genes with fold change difference ~ 10 and ~ 10 and UniGene number. Thirty-five were most expressed in cord blood and were related with immune response, cell cycle and homing. SAGE validation was performed by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) of 11 differentially expressed genes confirming the SAGE results in 10 genes with a confirmation rate of 90%. Alpha, beta and gamma globin results were comparable with haematopoiesis ontogeny. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, and NKG7 were most expressed in cord blood and S100-A8 in bone marrow. Fourteen highly expressed genes were function described. The semi-solid cultures analysis demonstrated that the cells of premature neonates had an early growth of CFU-E/BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM on the 7thday of culture, and the number of these colonies on the 7thand 14thday of culture was higher than fuI! term neonate's cells culture with statistic significance. The morphological characteristics on ih day of culture were comparable to those from full term neonates obtained on the 14thday. The premature cells cultures on the 14thday showed even fibroblasts and were comparable to those of full term neonates on the 21st day in terms of number and morphology of the colonies. The cell cycle protein expression analysis demonstrated the expression of p130 increased after the first 4 hours and accumulated, disappearing, or diminishing after 24 hours. On the other hand the p107 expression appeared after 24 hrs and accumulated until 96 hrs. However, the p130 and p107 expression was twofold higher in premature cells compared to full term cells. These results suggest that premature cells have a rapid exit from GO/G1 to S-phase Thus, homing, cell cycle differentiation, and immune response related genes seem to be highly expressed in cord blood cells. Further studies verifying the role of these genes may contribute for greater knowledge regarding cord blood cell biology / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_TatianadeArrudaCamposBrasilde_D.pdf: 2667585 bytes, checksum: 67a64b614fe46e32c061e0f43f20406e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para que a divisão celular ocorra é necessário que uma célula passe por algumas etapas que possibilitem esta divisão. Ao conjunto destes processos denomina-se ciclo celular. A regulação espacial e temporal destes processos é fundamental para a preservação celular e do material genético. Falha neste processo pode levar à morte celular ou a alterações genéticas causando divisão desregulada e crescimento de tumores. Dentre diversas proteínas envolvidas no ciclo celular, encontram-se as septinas. Até o momento, foram encontrados em humanos 14 diferentes genes para septinas. Septinas são proteínas ligadoras de GTP, primeiramente caracterizadas em leveduras, que estão associadas a eventos biológicos importantes em eucariotos. Neste trabalho foram selecionadas três septinas humanas para estudos funcionais e estruturais: septina 6, septina 8 e septina 10. Nossos resultados deram origem a três artigos que descrevem: I) estratégias de clonagem, expressão, purificação e caracterização preliminar da septina humana 8; II) a capacidade das septinas 2, 6, 8 e 11 em ligar e hidrolisar GTP, mas com diferentes níveis de atividade GTPásica, sendo a septina 2 humana capaz de hidrolizar GTP mais rapidamente que as demais septinas e III) a interação entre a septina 10 humana e a proteína Promyelocytic leukemia zinc finger (PLZF), cuja expressão em linhagens celulares hematopoiéticas resultam na supressão do crescimento e interrupção do ciclo celular. A interação da septina 10 com a proteína PLZF foi confirmada in vitro por experimento de pull-down e a localização celular da septina 10 mostra que esta septina é expressa no citoplasma da célula. Além disso, resultados preliminares mostram a relação da ligação de GTP e formação de filamentos pela septina 6 e diversas estratégias para a cristalização das septinas estudadas como: microseeding, streak-seeding, variações de pH, precipitantes e aditivos, metilação de lisinas e screening de tampões, cujos resultados não foram satisfatórios para a resolução de uma estrutura de septina humana / Abstract: A cell passes through some steps to enable for cell division and all these processes are called Cell Cycle. The spatial and temporal regulation of this process is crucial to maintaining cellular and genetic material. Failure in this process can lead to cell death or genetic changes causing division and unregulated growth of tumors. Among several proteins involved in cell cycle, there are the septins. To date, 14 different human genes coding for septins were found. Septins are GTP binding proteins first characterized in yeast, which are associated with important biological events in eukaryotes. In this study we selected three human septins to study functionally and structurally: septin 6, septin 8 and septin 10. Our results led to three articles that describe: i) strategies for cloning, expression, purification and preliminary characterization of human septin 8; ii) the ability of septin 2, 6, 8 and 11 to bind and hydrolyze GTP, but with different levels GTPase activity, human septin 2 is capable of hydrolyzing GTP faster than the other septins and III) the interaction between the human septin 10 and promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF), whose expression in hematopoietic cell lines results in growth suppression and cell cycle arrest. The interaction between septin 10 and PLZF was confirmed by in vitro pull down assay and the cellular localization of septin 10 shows that this septin is expressed in the cell cytoplasm. Furthermore, our studies preliminary results show the relation of GTP binding and filament formation of the septin 6 and several strategies for the crystallization of septins as micro-seeding, streak-seeding, variations in pH, precipitants and additives, methylation of lysine and screening of buffers, but the results were not satisfactory for the resolution of a human septin structure / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Karina Gottardello Zecchin, Edgard Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ortega_RoseMara_D.pdf: 2691297 bytes, checksum: ea4bceee611c0e68c84223cc02b8fd52 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Ácido graxo sintase (FASN - fatty acid synthase, EC 2.3.1.85) é a enzima metabólica responsável pela síntese endógena do ácido graxo saturado palmitato, a partir dos precursores acetil-CoA e malonil-CoA. Diversos estudos mostram que, em contraste com a maioria das células normais, FASN é altamente expressa em vários tipos de neoplasias malignas humanas, tais como as de próstata, mama e melanoma sendo que, em alguns destes tumores, a alta expressão de FASN está associada a um pior prognóstico. A inibição da enzima FASN resulta em inibição da proliferação e induz morte celular em diversas neoplasias malignas. Recentemente demonstramos que, in vitro, a inibição específica da atividade de FASN em linhagem celular de melanoma murino, B16-F10, induz a via intrínseca da apoptose, com liberação de citocromo c e ativação de caspase-3, assim como altera a composição dos ácidos graxos livres presentes nas mitocôndrias das células B16-F10. O objetivo deste trabalho foi investigar de que maneira a inibição farmacológica de FASN reduz a proliferação de células B16-F10, in vitro e in vivo, utilizando C75 como inibidor de FASN. O tratamento de células e animais com C75 reduziu significativamente a proliferação celular e induziu apoptose. Houve significativa redução de células na fase S do ciclo celular, com acúmulo de células de G0/G1, em comparação com os controles. Western blottings feitos a partir de extratos de células em cultura e de tumores intraperitoneais mostraram aumento de p21WAF1/Cip1, p27Kip1, redução de Skp2 e cdk2, sem mudanças nos níveis de cdk4, 6 e ciclina E após tratamento com C75. A especifidade destes resultados foi confirmada pela redução da atividade enzimática de FASN após tratamento com C75 e pelo silenciamento de FASN com RNAi. Efeito anti-tumoral de C75 foi sugerido pela formação de tumores subcutâneos de menor volume quando comparados aos tumores de animais controle. Nossos achados mostram que a proliferação de células de melanoma é dependente de FASN, e que sua inibição primeiramente altera os níveis de proteínas envolvidas na transição de G1 para S, para posteriormente induzir apoptose em células de melanoma B16-F10 / Abstract: Fatty acid synthase (FASN) is the metabolic enzyme responsible for the endogenous synthesis of the saturated long-chain fatty acid palmitate, from the precursors acetyl-CoA and malonyl-CoA. In contrast to most normal cells, the overexpression of FASN in several human malignancies, such as those of prostate, breast, ovary, melanoma, and soft tissue sarcomas has been associated with poor prognosis. FASN inhibition reduces cell proliferation by blocking DNA replication during S-phase, and induces apoptosis in several malignant neoplasias. We have previously shown that the specific inhibition of FASN activity significantly reduce proliferation and promote apoptosis, as demonstrated by the cytochrome c release and caspase-9 and -3 activation, as well as induces signi?cant changes in the free fatty acids composition of B16-F10 cells mitochondria. Here we investigated the events involved in cell cycle arrest subsequent to FASN inhibition with C75. C75 treatment significantly reduced melanoma cells proliferation and induced apoptosis in vitro and in mice. Cell cycle arrest after C75 treatment was evidenced by a significant increase in G0/G1 phase, as well as decline of the S phase, in comparison with untreated cells. Western blotting analysis showed significant accumulations of the tumor suppressor proteins p21WAF1/Cip1 and p27Kip1, together with decreased amounts of Skp2, essential for the proteasomal degradation of p27Kip1, and cdk2, a Ser/Thr protein kinase necessary for the G1/S transition, in C75-treated cells or mice tumors. The levels of other proteins involved in G1/S cell cycle progression, such as cyclin E, cdk4, and cdk6 were not affected by FASN inhibition. These results were confirmed by inhibition of FASN activity after C75 treatment and by RNAi for FASN. Antitumoral effect of C75 was suggested by reduced subcutaneous tumors volume when compared to controls mice. Our results suggest that melanoma murine B16-F10 cells proliferation is dependent on FASN activity, and its inhibition first modify the levels of some proteins involved in the transition G1?S of cell cycle, to finally induce apoptosis in neoplasic cells / Doutorado / Estomatologia / Doutora em Estomatopatologia