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The analysis of potentially harmful biological particles is imperative for the mitigation of disease. As a result, there is a growing need for tools which can characterize, detect, and separate biological particles for the alleviation of a multitude of disease. One powerful technique for the analysis of cells is the use of dielectrophoresis (DEP) forces for the manipulation of particle movement. DEP is a particle transport phenomenon, induced by the presence of non-uniform electric fields. The dependence on intrinsic electrical properties of cells, have enabled DEP force to be utilized for numerous biological analyses. This thesis presents the investigation of breast cancer, pathogen, neuronal and glial cells and their DEP profiles. The drug response of various breast cancer cell lines when exposed to a variety of chemical stimuli were analyzed using shifts in their DEP profiles in relation to control groups. These results were supplemented with gene expression analysis to identify biophysical changes which could contribute to the DEP shifts. Additional experiments were conducted for the monitoring of pathogens. Live/dead bacteria mixtures were evaluated using an integrated system with DEP enrichment and impedance spectroscopy. Another application of DEP which was investigated was the separation of heterogeneous mixtures. Through the use of a novel microfluidic channel design, the separation of simulated circulating tumor cells (CTCs) from diluted blood and neuron cells from glial cells was demonstrated. The wide range of applications examined in this thesis highlights the versatility of DEP and the flexibility of the reported devices. / MS / Microscale technology can be utilized for the identification, characterization and sorting of biological material in a plethora of biomedical applications. One promising technique which is capable of cell manipulation is dielectrophoresis (DEP). DEP is a microscale force which causes particles to be attracted or repelled by specific geometries in microchannels. The DEP force is produced by the application of electric fields and can be utilized to analysis biological cell populations. This is because biological particles have unique electrical properties based on their cell morphology. Distinctions in their external protrusions and internal structures contribute to their electrical properties and can be identified in their DEP profiles. Based on this concept a variety of biomedical applications of DEP was explored. Chapter 2 and 3 describe the investigation of cells when exposed to various drugs. Drug induced responses were characterized based on their shifts in their DEP profiles. Chapter 4 presents the a rapid and low-cost live/dead assay for bacteria in aqueous samples through DEP and impedance spectroscopy. In chapter 5, the development of a DEP platform for cell sorting is reported. The wide range of biomedical applications which were explored demonstrate the useful nature of the DEP phenomenon.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent une source de matériel tumoral accessible de manière non invasive, susceptible de fournir des informations cliniques et fondamentales. Ces cellules issues de tumeurs primitives ou métastatiques représentent une population hétérogène d’éléments très rares circulant dans le sang. La personnalisation des traitements en oncologie repose sur la caractérisation moléculaire de biopsies tumorales mais celles-ci peuvent être difficiles à réaliser ou peu informatives. De ce fait, la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des CTC présente un double intérêt, clinique pour identifier des biomarqueurs de sensibilité à des traitements, et fondamental pour étudier les mécanismes qui sous-tendent leur potentiel à initier des tumeurs.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part de caractériser par séquençage de l’exome (WES) les CTC à l’échelle de cellule unique de patients atteints de cancers de la prostate (PCa) métastatiques et d’autre part d’établir puis caractériser des modèles de xénogreffes dérivés de CTC (CDX) chez des patients atteints de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ou de PCa.Pour répondre au premier objectif, nous avons développé une méthode expérimentale globale incluant trois approches technologiques permettant d’enrichir et d’isoler des CTC individuelles de différents phénotypes (épithélial, épithélio-mésenchymateux et mésenchymateux), d’amplifier la totalité du génome (WGA) et de le séquencer. Le WES a été réalisé pour 34 échantillons de CTC sélectionnés sur des critères de qualité du WGA, ainsi que pour les biopsies de métastases correspondantes chez sept patients. Deux patients présentant une hétérogénéité phénotypique de leurs CTC, ont été analysés en profondeur. Nous avons mis en évidence des mutations partagées entre les CTC et les biopsies tumorales correspondantes ainsi que des mutations uniquement retrouvées dans les CTC. Ces mutations spécifiques aux CTC sont présentes dans tous les phénotypes et affectent particulièrement les gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette, la réparation de l’ADN ou l’invasion. L’existence de mutations communes entre les CTC de différents phénotypes suggère une relation phylogénique entre ces cellules mais une évolution divergente pendant le processus métastatique. Ce travail est soumis pour publication.Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons implantés les CTC de 67 patients atteints de CBNPC et 24 patients atteints de PCa chez des souris immunodéprimées. Nous avons établis quatre CDX de CBNPC et un CDX de PCa. La caractérisation de ces modèles, des biopsies tumorales, des CTC collectées au moment de la xénogreffe, des CDX et des lignées cellulaires établies à partir du CDX, ont révélé que les CTC, le CDX et les lignées cellulaires « miment » le phénotype et le profil mutationnel des biopsies tumorales. La caractérisation plus approfondie de l’une des lignées cellulaires montre la présence d’un stress réplicatif et d’une instabilité génomique élevée. Ce résultat nous oriente sur l’hypothèse d’un rôle éventuel de l’instabilité génomique dans la tumorigénicité des CTC.Dans ce travail, nous avons montré que le profil mutationnel des CTC présente de fortes similitudes avec les biopsies tumorales des patients dans les patients atteints de PCa étudiés. De plus, nous avons observé l’existence de mutations spécifiques aux CTC, non détectées dans les biopsies tumorales. Également, nous montrons que des CTC issues de CBNPC et de PCa sont tumorigéniques in vivo et qu’elles reflètent le profil mutationnel des biopsies tumorales des patients. Ces modèles constituent des outils originaux et intéressants pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et stratégies anti-cancéreuses, et comprendre les mécanismes qui supportent le potentiel des CTC à initier des tumeurs. / Circulating tumor cells (CTCs) represents an non invasive source of tumor material which may provide clinical and basic information. These cells derived from primary or metastatic tumors represents an heterogeneous population of very rare events which circulates in the blood. Oncology personnalized medicine is based on biopsies molecular characterization but these are sometimes which difficult to realize and poorly informative. Thereby molecular and functional characterization of CTCs presents a double interest, clinical to identify treatments biomarkers sensitivity and basic to study mechanisms underlying their tumor inititiating cell (TIC) potential. The two goals of my thesis were on the one hand to characterize by whole-exome sequencing (WES) at the single level the CTCs from patients with metastatic prostate cancers (mPCa) and on the other hand to establish and characterize CTC-derived xenografts (CDX) from patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) or mPCa. For the first goal we developped a global workflow which include three technological approaches to enrich and isolate individual CTCs from different phenotype (epithelial, epithelial and mesenchymal, mesenchymal), to perform whole genome amplification (WGA) and to sequence them. WES was performed on 34 CTC samples selected according to WGA quality and on corresponding metastasis biopsies from seven patients. Two patients with phenotypic heterogeneity of CTCs were deeply analyzed. We highlighted shared mutations between CTCs and matched biopsies as well as mutations only detected in CTCs. These private CTC mutations are detected in all phenotype and particularly affect genes invlved in cytoskeleton remodeling, DNA repair or invasion. The existence of common mutations between CTCs from various phenotype suggests a phylogenic link between these cells but a divergent evolution during metastatic process. This work is submitted for publication. For the second goal, we implanted CTCs from 67 NSCLC patients and 28 mPCa patients in immunocompromised mice. We established four NSCLC CDX and one mPCa CDX. The characterization of tumor biopsies, CTCs collected at the time of xenograft, CDX and CDX-derived cell lines revealed that CTCs, CDX and cell lines miror the phenotype and mutational landscape of tumor biopsies. The more deeply characterization of one cell line show the presence of a high replicative stress and genomic instability. This result directs us to the hypothesis of a possible role of the genomic instability in CTC tumorigenicity.We demonstrated in this work that CTCs mutational landscape harbors high similairities with patients tumor biopsies in mPCa. Furthermore we observed CTC private mutations not detected in tumor biopsies. Also we showed that some CTCs from NSCLC and mPCa are tumorigenic in vivo and that these CTCs mirror mutational profile of patients tumor biopsies. These models are original and interesting tools to identify new therapeutic targets and anti-tumoral strategies and understand mechanisms underlying the TIC potential of CTCs.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules présentes en très faible proportion (une cellule pour un million de cellules normales) dans la circulation sanguine, et qui jouent un rôle important dans le processus de métastase responsable de la majorité des décès de patients atteints de cancer. La détection du cancer à un stade précoce augmente les chances de survie des patients. Le but de ce travail a été de développer un ensemble de technologies permettant de mieux caractériser et détecter les CTC.Nous avons concentré notre étude sur les cellules ayant un phénotype hybride, entre épithélial et mésenchymal, qui pourraient correspondre à des CTC de plus fort potentiel métastatique compte tenu du rôle joué par la transition épithelio-mésenchymateuse dans ce processus. Nous avons tout d’abord isolé, par immunofluorescence et cytométrie en flux, une lignée cellulaire de cancer (A549, le carcinome de poumon humain) co-exprimant la E- et la N-cadhérine, de sorte qu’elle puisse être utilisée comme modèle de CTC dans le développement de nouvelles techniques de détection. Nous avons en particulier adapté le système de microscopie de fluorescence et d’analyse d'images PathfinderTM à haut-débit de la société Imstar S.A. pour identifier efficacement quelques milliers de cellules A549 mélangées à du sang de patient, après une étape de filtration par la taille. Afin d’améliorer l’identification des cellules hybrides, nous avons évalué la technique de transfert de Förster résolue en temps qui pourrait révéler avec un excellent rapport signal/bruit la présence à la membrane cellulaire d’agrégats compacts de N- et E-cadhérines. Enfin, afin d’augmenter le nombre de biomarqueurs simultanément détectés par immunofluorescence nous avons contribué à la mise au point de nanocristaux semi-conducteurs fluorescents conjugués avec un anticorps dirigé contre une protéine d'intérêt. Au final, nos résultats fournissent un ensemble de technologies qui pourront être utilisées pour améliorer la détection et la caractérisation des CTC. / Circulating tumor cells (CTCs) are rare cells (one in millions of normal cells) in blood circulatory system playing a key role in the process of metastasis, which is responsible for the majority of death of patients with cancer. Detecting cancer at early stage can give patients higher chances of survival. The aim of this work is to develop a set of technologies capable of characterizing and detecting the CTCs. We restricted our study to CTCs with hybrid phenotype, between epithelial and mesenchymal, that could correspond to circulating cells with the highest metastatic potential, considering the relation of the Epithelial to Mesenchymal Transition to cancer. Using immunofluorescence and flow cytometry, we first isolated a cancer cell line (A549, human lung carcinoma) co-expressing E- and N-cadherin, which is further used as a CTC model in the development of new detection techniques. In particular, we showed that the high throughput automated fluorescence microscope and image processing Imstar S.A. PathfinderTM system can recover efficiently a few thousands of A549 cells spiked in a blood sample, after an initial size-filtering step. We also used time-gated Fluorescence Resonant Energy Transfer to investigate the presence of E- and N-cadherin clusters at the cell membrane that could enhance the detection sensitivity of hybrid phenotype. Finally, in view of increasing the number of simultaneous biomarkers detection by immunofluorescence we contributed to the development of fluorescent semiconductor nanocrystals conjugated with antibody directed against the protein of interest. Altogether, our results provide a set of technologies that can be used to improve the detection and characterization of CTCs.

"Circulating tumor cells (CTCs) are cells released into the bloodstream from primary tumors and are suspected to be one of the main causes behind metastatic spreading of cancer. The ability to capture and analyze circulating tumor cells in clinical samples is of great interest in prevailing patient prognosis and clinical management of cancer. Carbon nanotubes, individual rolled-up graphene sheets, have emerged as exciting materials for probing the biomolecular interactions. With diameter of about 1 nm, they can attach themselves to cell surface receptors through specific antibodies and hold a great potential for diagnostic cellular profiling. Carbon nanotubes can be either semiconducting or metallic, and the electronic properties of either type rivals the best known materials. Small size of nanotubes and the ability to functionalize their surface using 1-Pyrenebutanoic Acid, Succinimidyl Ester (PASE), enables a versatile probe for developing a platform for capture and analysis of cancer biomarkers and circulating tumor cells. Although nanotubes have previously been used to electrically detect a variety of molecules and proteins, here for the first time we demonstrate the label free capture of spiked breast cancer cells using ultra-thin carbon nanotube film micro-array devices in a drop of buffy coat and blood. A new statistical approach of using Dynamic Time Warping (DTW) was used to classify the electrical signatures with 90% sensitivity and 90% specificity in blood. These results suggest such label free devices could potentially be useful for clinical capture and further analysis of circulating tumor cells. This thesis will go in-depth the properties of carbon nanotubes, device fabrication and characterization methodologies, functionalization protocols, and experiments in buffy coats and in blood. Combination of nano and biological materials, functionalization protocols and advanced statistical classifiers can potentially enable clinical translation of such devices in the future. "

Introduction:Un des problèmes du cancer du Pancréas (CP) est le temps de latence entre la suspicion du CP et la mise en place des traitements. Les méthodes de biopsie liquide pourraient accélérer la mise en évidence d’éléments tumoraux et le diagnostic.Objectif :L’objectif principal de l’étude était de comparer la performance diagnostique de plusieurs techniques de biopsie liquide chez des patients atteint d’un CP résécable d’emblé. L’objectif secondaire était la corrélation avec le taux de récidive post-opératoire.Méthodes:Tout d'abord, nous avons testé 2 méthodes d'enrichissement CTC pour estimer la sensibilité de la détection CTC avec des expériences de cell-spiking de deux lignées de cellules tumorales pancréatiques dans des échantillons de sang de 24 volontaires sains en utilisant la méthode en gradient de densité OncoQuick® et la méthode de sélection négative RosetteSep™. De plus, les mutations KRAS ont été quantifiées dans l'ADN génomique de cellules purifiées par digital droplet PCR (dd-PCR) avec des amorces spécifiques des allèles.Nous avons conçu un essai clinique prospectif (NCT03032913) visant à détecter les cellules tumorales circulantes (CTC), l’ADN tumoral circulant (ADNct) et les onco-exosomes chez les patients atteint de CP et chez les patients d’un groupe témoin. Pour les CTCs : enrichissement et détection de CTCs par la méthode CellSearch©, méthode d’enrichissement de CTCs RosetteSep® et OncoQuick® puis quantification de l’ADN tumoral par dd-PCR. Les exosomes ont été isolés puis caractérisés avec le taux d’expression de Glypican-1. Tous les patients de l’étude ont eu un prélèvement de sang périphérique, les patients du groupe CP ont eu un prélèvement de sang portal peropératoire.Résultats:La sensibilité analytique était de 100 % pour OncoQuick®, quelle que soit la lignée cellulaire, et se situait entre 70 et 100 % pour RosetteSep™. Le taux moyen de récupération des cellules était de 56±23% pour OncoQuick® contre 39±27% pour RosetteSep™ (p<0,001). Les cellules tumorales de la population de cellules sanguines enrichies ont été détectées par dd-PCR après enrichissement par RosetteSep™ et OncoQuick® La détection des allèles K-RAS mutants par ddPCR après enrichissement de RosetteSepTM était 3 à 4 fois plus sensible qu'après OncoQuick®. Ainsi, RosetteSep™ est plus fiable en termes d'efficacité de récupération et de détection des mutants KRAS que OncoQuick®.De février à novembre 2017, 22 patients atteints de CP résécable et 28 patients témoins ont été inclus. Tous les patients ont été détectés positifs par au moins une méthode. Les CTCs ont été détectées chez 9 patients avec la méthode cellsearch (70% dans le sang portal exclusif) et 13 avec la méthode Rosettesep (60%). Les onco-exosomes ont été détecté chez 14 patients sur 22. L’ADNct n’a été détecté que chez deux patients métastatiques. La détection combinée des CTCs et des onco-exosomes était significativement corrélée à la survie sans récidive.Conclusion:Cette étude suggère que la biopsie liquide combinée peut être un outil prometteur à fois diagnostique et pronostique dans le CP à un stade précoce. / Introduction:One of the problems of pancreatic ductal adenocarcinoma (PC) is the latency time between the suspicion of PC and the initiation of treatments, especially neo-adjuvants that require histological evidence. Liquid biopsy methods could be a companion test for diagnosis.Objective :The main objective of the study was to compare the diagnostic performance of several liquid biopsy techniques in patients with resectable pancreatic without neo-adjuvant therapy cancer. The secondary objective was the correlation between the quantification of liquid biopsy parameters and clinic-pathologic features.Methods:First, we tested 2 CTC enrichment methods to estimate the sensitivity of CTC detection with cell spiking experiments of two pancreatic tumour cell lines in blood samples from 24 healthy volunteers using the onco-specific density gradient OncoQuick® and the negative selection enrichment method RosetteSep™. Additionally, KRAS mutations were quantified in genomic DNA of purified cells by digital droplet Q-PCR (dd-PCR) with allele specific primers.We designed a prospective clinical trial (PANC-CTC# NCT03032913) to detect circulating tumour cells (CTC), circulating tumour DNA (ADNct) and onco-exosomes in patients with pancreatic cancer and in patients in a control group using different methods. For CTCs, it was the enrichment and detection of CTCs by the CellSearch© method (reference method), the RosetteSep® and OncoQuick® CTC enrichment method and the quantification of tumor DNA by dd-PCR. Exosomes were isolated and characterized with the expression rate of Glypican-1. All patients in the study had a peripheral blood sample, patients in the PDAC group had a portal blood sample during surgery.Results:Analytical sensitivity was 100% for OncoQuick®, regardless of the cell line, and ranged between 70 and 100% for RosetteSep™. Mean recovery rate of cells was 56±23% for OncoQuick® versus 39±27% for RosetteSep™ (p<0.001). Molecular detection of mutant K-RAS alleles by ddPCR after RosetteSepTM enrichment was 3- to 4-fold more sensitive than after OncoQuick®. Thus, RosetteSep™ is more reliable in terms of recovery efficiency and KRAS mutant detection than OncoQuick®.From February to November 2017, 22 patients with resectable pancreatic cancer and 28 control patients were included. All patients were positive by at least one method. CTCs were detected in 9 patients with the cellsearch method (70% in the exclusive portal blood) and 13 with the Rosettesep method (59%), Onco-exosomes were detected in 14 out of 22(64%) patients in peripheral and/or portal blood. DNAct was detected in only two metastatic patients. The combined detection of CTCs with cellsearch and onco-exosomes was significantly correlated with progression free survival and overall survival when CTC cluster were found.Conclusion: This study suggests that combined liquid biopsy can be a promising tool for both diagnosis and prognosis in early pancreatic cancer.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un large champ de recherche susceptible de fournir des informations tant cliniques que fondamentales. Les CTC proviennent de tumeurs primitives ou métastatiques et représentent une population hétérogène de cellules très rares dans le flux sanguin. Leur caractérisation moléculaire est un défi technologique qui requiert des méthodes très sensibles et spécifiques. Dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC), les CTC ont un véritable intérêt car les biopsies tumorales ne permettent pas toujours de réaliser les analyses moléculaires nécessaires au choix du traitement. De plus, elles ne sont probablement pas représentatives de l’hétérogénéité tumorale.L’objectif de ma thèse a été de rechercher dans les CTC de patients atteints de CBNPC porteurs du remaniement de gène ALK, des anomalies génomiques connues pour être des biomarqueurs de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblant cet oncogéne, ainsi qu’à caractériser les CTC porteuses de ces anomalies. La première partie du projet a consisté au développement d’une méthode d’hybridation in situ de l’ADN (fluorescent in situ hybridization, FISH) adaptée à un système d’enrichissement des CTC par filtration, la FA-FISH (filter adapted FISH) (brevet PCT/FR2011/052688). Nous avons ensuite développé une approche de microscopie semi-automatisée permettant la digitalisation et l’analyse de ces CTC enrichies par filtration (Pailler, BMC Cancer, 2016). Dans la seconde partie du projet, nous avons mis en œuvre cette méthode et montré pour la première fois qu’il est possible d’identifier le remaniement de gène ALK dans les CTC de patients porteurs de ce réarrangement dans la tumeur (Pailler, J Clin Oncol, 2013). Les CTC remaniées présentent un unique réarrangement de type break-apart, y compris chez des patients présentant exclusivement une autre forme de réarrangement dans la tumeur, et un phénotype mésenchymateux. Cette observation nous a amené à émettre l’hypothèse que ces CTC ont acquis des propriétés migratoires et d’invasivité, et pourraient résulter d’une forte sélection clonale. Nous avons ensuite étendu cette observation aux patients porteurs du remaniement ROS1 et rapporté pour la première fois la détection de ce remaniement dans des CTC (Pailler, Ann Oncol, 2015). Dans la troisième partie du projet, nous avons émis l’hypothèse que certaines sous-populations de CTC anormales pour le gène ALK, mesurées avant et à deux mois de traitement par le crizotinib, pourraient prédire l’évolution clinique des patients traités. Dans une cohorte élargie de patients, nous avons montré que l’évolution sous crizotinib du nombre de CTC présentant exclusivement des gains de copies natives du gène ALK est un biomarqueur « surrogate » d’efficacité du traitement pouvant permettre d’identifier les patients qui ont un risque élevé de progresser rapidement (Pailler, soumis). Finalement, dans la quatrième partie du projet, nous avons recherché dans des CTC des mutations de résistance aux inhibiteurs de ALK. Nous avons mis au point des technologies permettant de caractériser phénotypiquement, isoler et analyser moléculairement (séquençages ciblés et d’exomes) des CTC à l’échelle de cellule unique. Les expériences sur lignées cellulaires ont permis de valider les approches et les analyses d’échantillons de patients sont en cours.Dans ce travail, nous montrons qu’il est possible de caractériser des anomalies génomiques dans les CTC de patients porteurs du remaniement ALK à différentes étapes de leur maladie, et ainsi d’identifier des biomarqueurs de sensibilité et d’efficacité à une thérapie ciblée. Ce travail ouvre des perspectives sur la personnalisation des traitements qui pourraient reposer sur l’analyse génomique non invasive des CTC. Il apporte en outre des éléments nouveaux sur les caractéristiques biologiques des CTC chez ces patients, certaines étapes du processus métastatique et la diversité génomique de ces cancers. / Circulating tumor cells (CTCs) are a broad field of research which may provide both clinical and basic information. CTCs migrate from primitive or metastatic tumors and represent a heterogeneous population of very rare cells in the blood stream. The molecular characterization of CTCs is a technical challenge requiring highly sensitive and specific methods. Because tumor biopsies are invasive and in some cases associated with risk in non-small-cell lung cancer (NSCLC), CTCs may offer an attractive option to analyze tumor genomic alterations and detect molecular biomarkers. CTCs could provide a more comprehensive picture of the tumor content than single tumor biopsies.The aim of my thesis was to characterize genomic abnormalities in CTCs from ALK-rearranged NSCLC patients and identified biomarkers of sensitivity and resistance to targeted therapies. The first part of the project consisted in the development of a fluorescent in situ hybridization (FISH) method adapted to CTCs enriched by filtration, the FA-FISH (filter-adapted-FISH) (patent PCT/FR2011/052688). Then, we developed a method for the semi-automated microscopy of filtration enriched CTCs (Pailler, BMC Cancer, 2016). In the second part of my project, using this method, we provided the first proof-of-concept that ALK-rearrangement can be detected in CTCs of patients with ALK-rearranged NSCLC (Pailler, J Clin Oncol, 2013). We showed that CTCs from these patients harbor a unique ALK break-apart rearrangement, including patients presenting another form of rearrangement in the biopsy, and a mesenchymal phenotype. This suggests that these CTCs may arise from a clonal selection of tumor cells that have acquired invasive and migratory properties and possibly the potential to drive metastatic progression. Then, we characterized CTCs from patients with ROS1-rearranged NSCLC and reported for the first time the detection of ROS1-rearrangement in CTCs (Pailler, Ann Oncol, 2015). In the third part of the project, we evaluated whether CTCs with abnormal ALK-FISH patterns monitored under crizotinib (baseline and early sampling at 2 months) may inform on treatment benefit in a cohort of ALK-rearranged patients treated by crizotinib. In an extended cohort of patients, the dynamic change in the numbers of CTCs with a gain of ALK-native copies was associated with the progression-free survival and thus may be a surrogate biomarker for crizotinib efficacy (Pailler, submitted). These results show that the molecular analysis of CTCs performed under treatment could help to stratify patients at risk of early resistance to crizotinib. Finally, in the last part of my project, we sought to evaluate whether CTCs could be used for identifying resistance mutations to ALK inhibitors. We developed technologies to characterize, isolate and molecularly (targeted sequencing and exome sequencing) analyze CTCs at the single cell level. Experiments on cell lines allowed to validate these technical processes; Experiments on patient samples are ongoing.In this work, we characterize genomic abnormalities present in CTCs from ALK-rearranged patients at different stages of the disease and identify biomarkers of sensitivity and efficacy to targeted therapies. Our results provide new perspectives on the potential of CTCs for personalizing treatments in NSCLC patients. Furthermore, our findings may offer new insights on the biological characteristics of CTCs in ALK-rearranged patients, their overall role in the metastatic progression and the genomic diversity of these cancers.

1 ABSTRACT Introduction and aim of the study Circulating tumor cells (CTCs) are a promising tool of identifying patients with castration- resistant prostate cancer (CRPC) who will benefit from often demanding cytotoxic therapy. The aim of this work was to evaluate the prognostic significance of CTC in docetaxel-treated CRPC patients. During the project, we also tested the various methods of CTC cultivation and studied their genetic profile as well as the genetic profile of histological specimen at the time of diagnosis. Patients and methods A total of 39 patients who met the CRPC criteria and were indicated for docetaxel chemotherapy were included in the prospective study. Blood collection for CTC analysis was done in all patients before chemotherapy and on the first day of the fourth or fifth cycle of docetaxel. In parallel, CTCs were cultivated. Isolation and detection of CTC was done using the AdnaTest system, which consists of immunomagnetic separation and subsequent detection of mRNA from the CTC lysate. The primary objective of the study was to evaluate the overall survival (OS) of patients. Survival analysis was performed using the Kaplan-Meier method of estimating the survival distribution function. The impact of individual factors was tested using the Log-rank test, the Wilcoxon test and the Cox...

Circulating tumor cells (CTCs) are a potential predictive surrogate marker for disease monitoring. Due to the sparse knowledge about their phenotype and its changes during cancer progression and treatment response, CTC isolation remains challenging. Here we focused on the mechanical characterization of circulating non-hematopoietic cells from breast cancer patients to evaluate its utility for CTC detection. For proof of premise, we used healthy peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), human MDA-MB 231 breast cancer cells and human HL-60 leukemia cells to create a CTC model system. For translational experiments CD45 negative cells—possible CTCs—were isolated from blood samples of patients with mamma carcinoma. Cells were mechanically characterized in the optical stretcher (OS). Active and passive cell mechanical data were related with physiological descriptors by a random forest (RF) classifier to identify cell type specific properties. Cancer cells were well distinguishable from PBMC in cell line tests. Analysis of clinical samples revealed that in PBMC the elliptic deformation was significantly increased compared to non-hematopoietic cells. Interestingly, non-hematopoietic cells showed significantly higher shape restoration. Based on Kelvin–Voigt modeling, the RF algorithm revealed that elliptic deformation and shape restoration were crucial parameters and that the OS discriminated non-hematopoietic cells from PBMC with an accuracy of 0.69, a sensitivity of 0.74, and specificity of 0.63. The CD45 negative cell population in the blood of breast cancer patients is mechanically distinguishable from healthy PBMC. Together with cell morphology, the mechanical fingerprint might be an appropriate tool for marker-free CTC detection.