Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-10T17:13:21Z No. of bitstreams: 1 2015_LeonoraMacieldeSouzaVianna.pdf: 2288433 bytes, checksum: 19801b22ec725db98f87885aae6729ce (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-25T12:56:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LeonoraMacieldeSouzaVianna.pdf: 2288433 bytes, checksum: 19801b22ec725db98f87885aae6729ce (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T12:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LeonoraMacieldeSouzaVianna.pdf: 2288433 bytes, checksum: 19801b22ec725db98f87885aae6729ce (MD5) / A Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), infecção causada pelo vírus da imunodeficiência humana, tem comportamento pandêmico, sendo um problema de saúde pública. Considerando que pacientes com SIDA têm maior chance de desenvolver neoplasias e que a imunodeficiência poderia facilitar a permanência do Papiloma vírus (HPV) em orofaringe destes pacientes, o objetivo deste trabalho foi pesquisar a infecção pelo HPV e lesões a ele relacionadas em orofaringe de paciente HIV positivos. Foram avaliados 100 pacientes atendidos no ambulatório de DIP/SIDA do HUB. Os dados demográficos, clínicos, hábitos e perfil sócio comportamental foram avaliados por meio de um questionário estruturado. A coleta para a análise citológica (citologia convencional, em meio líquido e imunocitoquímica) e molecular (captura híbrida e PCR) foi feita em orofaringe com escovas. Para as análises citológicas utilizou-se os critérios de Bethesda. A imunocitoquímica avaliou a expressão da proteína p16INK4. A captura híbrida pesquisou o DNA-HPV de alto e baixo risco. A verificação do DNA do HPV pelo PCR utilizou o primer GP5+/6+. Os HPVs de alto e baixo risco foram detectados em 8,2% e 16,7% das amostras respectivamente. A média±dp (máximo-mínimo) da relação RLU/CO (estimativa da carga viral) para os HPVs de alto risco e baixo risco foi, respectivamente, 2,9±2,58 (1,09 - 7,87) e 1,61±0,65 (1,07 - 2,68). Houve positividade para HPV de alto e baixo risco na mesma amostra em dois casos. Não houve diferença significativa quanto a frequência de HPV em relação ao gênero e aos grupos etários. A incidência de HPV foi maior em pacientes heterossexuais (7%) porém ela só foi significativa em mulheres heterossexuais. Nenhuma mulher homossexual foi HPV-positiva e não houve mulheres bissexuais na presente amostra. Não fumantes tiveram 10,6 vezes mais chances de ter HPV. Quanto maior foi a contagem de CD4+ maior a chance dos pacientes apresentarem HPV de baixo risco. Pacientes que não consumiam álcool tiveram quase 15 vezes maior risco de apresentar HPV de baixo risco. Pacientes com menos de um parceiro por ano apresentaram associação (p≤0,003) com o HPV. Não houve associação entre a infecção oral pelo HPV e a presença de lesão oral, uso de terapia antirretroviral, maconha, outras drogas, coitos oral e anal, uso de preservativo e doenças sexualmente transmissíveis (DST). A citologia convencional não mostrou lesões displásicas, observando-se a presença de atipias de significado indeterminado (ASC-US) em 2 amostras. A presença de atipias citolólgicas na citologia convencional mostra que o exame citológico pode ser um método eficiente para detectar lesões iniciais em orofaringe, podendo a captura híbrida ser utilizada para detectar a presença do HPV, da mesma forma como é utilizada no colo uterino. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The AIDS infection caused by the human immunodeficiency virus have a pandemic behavior and has become a public health problem. Considering that AIDS patients are more likely to develop cancer and that immune deficiency could facilitate HPV permanence in the oropharyngeal of these patients, the objective of this study was to investigate HPV infection and related injuries with in HIV-positive in oropharynx. We evaluated 100 patients treated at outpatient DIP/AIDS HUB. The demographic, clinical and behavioral partners habits profile were assessed using a structured questionnaire. The collect for cytological (conventional cytology, immunocytochemistry and base liquid) and molecular (PCR and hybrid capture) analysis were performed in oropharynx with brushes. For cytological analysis the Bethesda’s criteria had been used. Immunocytochemistry assessed the expression of the p16INK4 protein. The hybrid capture researched the high HPV DNA and low risk. Verification of DNA in 100 samples was performed using the primer GP5+/6+. HPV high and low risk were detected in 8.2% and 16.7% of the samples respectively. Those with high-risk and low-risk HPV, the mean ± SD (high-low) of the relationship RLU / CO (estimate viral load) was respectively 2.9 ± 2.58 (1.09 to 7.87) and 1.61 ± 0.65 (1.07 to 2.68). There were positive for HPV high and low risk in the same sample in two cases. There was no significant difference in the frequency of HPV in relation to gender and age group. The incidence of HPV was larger in heterosexual patients (7%) but there were significant only in heterosexual women. No homosexual women was HPV-positive and there was no bisexual women in this sample. No smokers had 10.6 times more chance to have HPV. The higher the CD4+ count greater the chance of patients have low-risk HPV. Patients who did not consume alcohol were almost 15 times higher risk of having low-risk HPV. Patients with less than one partner per year were associated (p≤0.003) with HPV. There was no association between oral HPV infection and the presence of oral lesion, use of antiretroviral therapy, marijuana, other drugs, oral and anal intercourse, condom use and STDs. The conventional cytology showed no dysplastic lesions but observed the presence of atypical cells of undetermined significance (ASC-US) in 2 samples. Cytologic atypias features in conventional cytology reveals that cytological examination can be an efficient method to detect early lesions in the oropharynx and hybrid capture can be used to detect the presence of HPV in the same manner as used in the cervix.

Orientador : Valéria Valente / Banca: Enilza Maria Espreafico / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Resumo: O glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e letal, e na maioria dos casos leva o paciente à morte em aproximadamente 14 meses após o diagnóstico. O tratamento é realizado com remoção cirúrgica da massa tumoral, seguida de radioterapia e quimioterapia. Entretanto, devido à alta resistência das células tumorais, frequentemente o tumor cresce novamente poucas semanas após a cirurgia. Recentemente demonstramos que HJURP (Holliday Junction-Recognizing Protein), uma nova proteína envolvida em reparo de DNA, está altamente superexpressa em células de glioblastoma. Esta proteína está também superexpressa em outros tipos tumorais, como câncer de pulmão e mama, sendo que maiores níveis de expressão de HJURP correlacionam-se com piores prognósticos de sobrevida em ambos os casos, assim como observamos para os pacientes com GBM. Neste trabalho vimos que os níveis de mRNA de HJURP estão aumentados nas linhagens celulares de GBM T98G, U138MG, U251MG e U343MG, porém não na linhagem U87MG que expressa níveis similares ao de fibroblastos não tumorais. Por análises de western blot, observamos uma redução nos níveis de HJURP após tratamento das células com radiação ionizante, sendo a redução mais proeminente na linhagem U251MG. Vimos ainda que o reparo de quebras na dupla-fita de DNA, induzidas pela radiação ionizante, ocorre de modo similar nas células de GBM U138MG, U251MG e U343MG silenciadas ou não para HJURP. Vimos também que células com silenciamento de HJURP foram mais sensíveis à radiação, apresentando maiores taxas de apoptose e morte celular em relação às células não silenciadas. Além disso, observamos que o silenciamento de HJURP promove senescência precoce na linhagem de GBM U87MG, enquanto que este efeito não é observado na linhagem T98G e em células RO, que são fibroblastos não tumorais. Conjuntamente, estes dados... / Abstract:Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and lethal type of primary brain tumor, and usually leads the patient to death in approximately 14 months after diagnosis. The treatment consists of surgical removal of the tumor, followed by radiotherapy and chemotherapy. However, due to the high resistance of tumor cells, frequently the tumor grows again a few weeks after surgery. We recently demonstrated that HJURP (Holliday Junction Recognizing Protein), a novel protein involved in DNA repair, is highly overexpressed in glioblastoma cells. This protein is also overexpressed in other tumor types, such as lung and breast cancer, in which higher expression levels are correlated with a poorer survival prognosis, as we also observed for GBM patients. In this study we found that HJURP mRNA levels are increased in the GBM cell lines T98G, U138MG, U251MG e U343MG, while in U87MG cells HJURP levels are similar to that of non-tumoral fibrobalsts. We have also observed that the repair of DNA double-stranded breaks, induced by ionizing radiation, occurs similarly in GBM cells U138MG, U251MG and U343MG when HJURP is silenced or not. We also saw that U87MG and T98G cells were more sensitive to radiation when HJURP is knocked down, presenting higher rates of apoptosis and cell death. Moreover, we observed that HJURP silencing promotes premature senescence in the U87MG cell line, whereas T98G cells and non-tumoral fibroblasts are not significantly affected. Altogether, these data suggests that HJURP is related with the control of DNA repair activity and is required for the maintenance of GBM cells viability. / Mestre

Orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Coorientador : Prof. Dr. Anderson Joel Martino de Andrade / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 05/07/2017 / Inclui referências : f. 98-107 / Resumo: O uso de antimônio (Sb) pelas diversas sociedades vem de tempos remotos. Seu mais antigo e mais comum uso é no tratamento da leishmaniose, no entanto seu uso como sinergista em retardantes de chamas e na catálise de polímeros plásticos vem crescendo enormemente nas últimas décadas. O potencial tóxico das formas pentavalentes, utilizadas no tratamento de doenças já foi extensivamente estudando, no entanto esta não é a forma biologicamente ativa, sendo convertida na forma trivalente pelos sistemas biológicos. Frente a isto torna-se essencial estudar os efeitos das formas trivalentes, considerando doses relevantes para a exposição humana. Desta forma, diversas doses de antimônio no seu estado de oxidação +3 (trióxido de antimônio - Sb2O3) foram testadas seguindo diversos protocolos. No capítulo 1, são relatados os efeitos do Sb2O3 sobre o sistema endócrino e reprodutivo de ratos Wistar, seguindo protocolos experimentais específicos para avaliar disfunção endócrinas propostos pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA-US). Neste caso nenhum efeito de disfunção endócrina (anti) estrogênica ou (anti) androgênica foram observados, no entanto danos histológicos em tireóide e testículos foram comuns frente a exposição ao Sb2O3. No capítulo 2 são relatados os efeitos desta substância sobre as condições oxido redutoras e danos em macromoléculas de fígado, rim, pulmão e coração. Também foram analisados danos histológicos em órgãos de biotransformação e excreção e possíveis danos neurológicos. Os resultados deste capítulo levam a conclusão de que o Sb2O3, mesmo em baixas doses pode alterar a homeostase especialmente hepática e renal, alterando enzimas e moléculas relacionadas ao balanço oxi-redutor bem como danificar macromoléculas essenciais à integridade celular. Desta forma conclui-se que, embora o Sb2O3 não tenha propriedades desreguladoras endócrinas, ele possui efeitos tóxicos sobre o organismo como um todo. Palavras chave: Desregulação endócrina, Estresse oxidativo, Antimônio, ratos Wistar. / Abstract: Antimony is a world widespread substance used a long time ago in human history. It most common use is in leishmaniosis treatment, but it use as a flame retardant and in plastic catalysis are increasing in last decades. Antimony exist as pentavalent and trivalet forms. The toxicology of pentavalent Sb, commonly used in disease treatment, are well studied. However, the pentavalent form is converted in the trivalent form by biological systems, and Sb+3 is more toxic than the Sb+5 oxidation state, turning necessary study the most toxic form in a dose relevant for human exposure. In the present thesis, Sb2O3, were used as a Sb+3 contaminant, considering diverse exposure protocols. In the first chapter, the effects of Sb2O3 under endocrine and reproductive systems were evaluated following EPA protocols proposed for endocrine disrupting contaminants. No (anti) estrogenic or (anti) androgenic effects of Sb were observed in all tested doses and protocols, but damages in thyroid and testis were common after Sb2O3 exposure. In the second chapter of this thesis, the effects of Sb under oxidative stress, as well histologic alterations and neurologic effects were considered. The present results show that antimony can alter the body homeostasis, especially renal and hepatic enzymes related to oxidative balance and cause damages to macromolecules. Considering all presented results, we conclude that Sb do not exert endocrine disrupting effects, but exert toxic effects, especially for liver and kidneys. Key - words: Endocrine disfunction, oxidative stress, antimony, Wistar rats.

Orientadora : Dra. Andréa Rodrigues Ávila / Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Haruo Inoue / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2017 / Inclui referências : f. 151-158 / Resumo: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma endemia da América Latina que afeta milhões de pessoas. Este parasita tem um ciclo de vida alternado entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, e necessita se adaptar a mudanças em diferentes ambientes que encontra ao longo do ciclo de transmissão. O T. cruzi controla a expressão de genes a partir de eventos majoritariamente pós-transcricionais. Vias que controlam a estabilidade do mRNA ou a tradução de proteínas são bem conhecidas, enquanto que mecanismos moleculares de exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma ainda não são bem compreendidos nem em tripanossomatídeos, nem em outros patógenos. Sabe-se, até o momento, que a maioria das proteínas envolvidas com o transporte de mRNA em outros eucariotos não está conservada em diversas espécies de parasitas. Exceto pela proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2), homóloga das proteínas de mamífero e levedura (UAP56/Sub2) e essencial para exportação de mRNA em tripanossomatídeos. Logo, para investigar os componentes desta via, nosso grupo tem investido em identificar proteínas exclusivas e essenciais para a exportação de mRNA em T. cruzi. Abordagens de proteômica, usando como alvo TcSub2, vem permitindo a identificação de fatores com função ainda desconhecida e/ou que são conservados apenas entre espécies de tripanossomatídeos, tornando-os alvos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de proteínas alvo com TcSub2 e seu papel na exportação de mRNA em T.cruzi. Duas proteínas não caracterizadas apresentaram motivos conservados e foram denominadas como TcFOP-like e TcAPI5-like. Interessantemente, estes motivos estão presentes em proteínas de outros organismos que estão envolvidas com a via de exportação de mRNA. Aqui, nós confirmamos que TcFOP-like e TcAPI5-like são proteínas nucleares e parecem interagir com TcSub2. Além disso, silenciamento e supereexpressão de TcFOP-like afeta o crescimento do parasita, e nós confirmamos sua interação com outros componentes da via de exportação de mRNA, tais como TcMex67 e TcHel45. Estas evidências suportam presença de components diveregentes na via de exportação de mRNA em Tripanossomatídeos. Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Exportação de mRNA. TcSub2.TcHel45 / Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan causative of Chagas disease, an endemic disease in Latin America that affects millions of people. This parasite alternates between vertebrate and invertebrate hosts during his life cycle, and needs to adapt to the changes in different environments along the transmission cycle. T. cruzi controls the gene expression mostly by post-transcriptional events. Pathways that control mRNA stability or protein translation are well known, while the molecular mechanisms for mRNA export from nucleus to cytoplasm are still not well understood nether in trypanosomatids or other pathogens. So far, it's known that the most of the proteins that are involved in mRNA transport of other eukaryotes are not conserved in many species of parasites. One exception is T. cruzi Sub2 (TcSub2), a homologue of the proteins in mammalian and yeast (UAP56 / Sub2) and essential for mRNA export in tripanossomatids. Therefore, to investigate the components of this pathway, our group has invested in identifying unique and essential proteins for the export of mRNA in T. cruzi. Proteomic approaches, using TcSub2 as target, have allowed identification of factors with the unknown function and/or that are conserved only in species of trypanosomatids, turning into interesting targets. Then, the aim of this work was to evaluate the interaction of target proteins with TcSub2 and their role in the mRNA export pathway in T. cruzi. Two uncharacterized proteins presented conserved motifs and were named here as TcFOP-Like and TcAPI5-like. Interestingly, those motifs are present in proteins of other organisms which are involved in mRNA export pathway. Here, we confirmed that TcFOP-like and TcAPI5-like are nuclear proteins and seems to interact with TcSub2. Furthemore, knockdown and overexpression of TcFOP-like affect the growth of parasites and we confirmed its interaction with other components of the mRNA export pathway, such as TcMex67 and TcHel45. Those evidences supporte the presence of divergent components in the mRNA export pathway of Tripanossomatids. Keywords: Trypanosoma cruzi. Export of mRNA. TcSub2. TcHel45.

Orientadora : Profª. Drª. Lia Sumie Nakao / Orientadora : Profª. Drª. Marcia Helena Appel / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2013 / Inclui referências / Área de concentração :Biologia / Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase isoforma 1b (QSOX1b) é uma enzima secretada, e catalisadora da oxidação de proteínas nascentes e mal dobradas. Esta oxidação induz a formação de pontes dissulfeto, que são cruciais para a conformação e estabilidade de diversas proteínas. A literatura propõe que a oxidação de proteínas intra e extracelular, ou aquelas de superfície celular, acarreta em mudanças no estado redox destes microambientes, e também em alterações conformacionais das micro e macroestruturas proteicas. Baseado nisso, tivemos como objetivo analisar o papel de QSOX1b recombinante de camundongo (mQSOX1b) como possível oxidase da fibronectina (FN), uma glicoproteína dimérica de matriz extracelular (MEC). Através das determinações de peróxido de hidrogênio e de tióis em ensaios cinéticos com mQSOX1b e FN reduzida (redFN), in vitro, constatamos que redFN é oxidada pela enzima. A constante de Michaelis menten medida foi de aproximadamente 456 nM (com uréia) e 290 nM (sem uréia). redFN, per se, auto fibrila, produzindo multímeros solubilizados por deoxicolato (DOC), contudo, verificamos que mQSOX1b acelera a formação destes multímeros. Estas estruturas fibrilares possuem massa molecular maior que 800 kDa, e são desfeitas por agentes redutores, mas não são desfeitas por DOC (2%), indicando que são mantidas por pontes dissulfeto. Os multímeros não afetam a interação de redFN com gelatina, como indicado por imunoensaio. Coatings com multímeros de FN (nativa e reduzida) não alteraram a capacidade adesiva de Rasm (células musculares lisas de aorta de rato), HeLa (células de câncer cervical, Henrietta Lacks) ou 3t3 (Fibroblasto de camundongo), contudo, a proliferação foi aumentada quando Rasm e HeLa foram incubados sobre natFN junto a mQSOX1b. Ao analisar a superexpressão da mQSOX1b sobre o estado redox da MEC e superfície celular nas linhagens Hek293t (células de rim de embrião humano para transfecção) e HeLa, pudemos constatar a promoção do estado mais oxidado para estes ambientes. Sendo assim, propomos para QSOX1b funções biológicas sobre a formação e remodelamento de componentes da MEC, aqui demonstrado especificamente sobre FN. Sendo assim, a presença de QSOX1 pode estar associada com o controle do crescimento e sobrevivência celular, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Palavras chaves: Quiescina/Sulfidril Oxidase 1b (QSOX1b); Matriz extracelular (MEC); Fibronectina (FN); oxidação; estado redox. / Abstract: Quiescin/Sulfhydryl Oxidase isoform 1b (QSOX1b) is a secreted enzyme, and catalyzes the oxidation of nascent and misfolded proteins. This oxidation leads to the formation of disulfide bonds which are critical to the conformation and stability of various proteins. The literature suggests that oxidation of intra-and extracellular proteins or those at cell surface leads to changes in the redox state of these microenvironments, as well as conformational changes in the protein micro and macrostructure. Based on that, we aimed to analyze the role of mouse recombinant QSOX1b (mQSOX1b) as a possible oxidase for fibronectin (FN), a dimeric glycoprotein of the extracellular matrix (ECM). In vitro, through enzyme kinetics assays and measurement of thiols in the presence of mQSOX1b and reduced FN (redFN), we found that redFN is oxidized by the enzyme. The KM values found were approximately 456 nM (urea) and 290 nM (without urea). FN multimers are also generated by auto fibrillation and can be solubilized by deoxycholate (DOC), however, we found that the QSOX1b accelerates the formation of these multimers. These fibrillar structures have molecular mass greater than 800 kDa, and are lost in the presence of reducing agents but not DOC (2%), indicating that multimers are maintained by disulfide bonds. The multimers forms no affect the gelatin-redFN interaction, indicated by ELISA. Coatings with multimers of FN (native and reduced FN) did not alter the adhesive capacity of Rasm, HeLa or 3T3, however, the proliferation was increased when Rasm and HeLa were incubated on natFN along mQSOX1b. Analyzing mQSOX1b overexpression influence on the ECM redox state and cell surface protein thiols at HEK293T and HeLa cells, we found more oxidized state for these environments. Therefore, we propose as biological functions to QSOX1b the formation and remodeling ECM components, here specifically FN. Thus, the presence of QSOX1 may be associated with cellular growth and survival control, probably in physiological and pathological conditions. Keywords: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1b (QSOX1b), extracellular matrix (ECM), fibronectin (FN); oxidation; redox state.

Orientador : Dr. Samuel Goldenberg / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, que continua sendo um importante problema de saúde pública na América Latina. Os estudos sobre o T. cruzi têm sido facilitados pela possibilidade de cultivo e diferenciação in vitro dos principais estágios evolutivos do parasita. Este trabalho aborda o estudo de aspectos morfológicos e moleculares da diferenciação in vitro de tripomastigotas metacíclicos para amastigotas (amastigogênese extracelular). Extensas mudanças morfológicas foram caracterizadas por microscopia óptica e eletrônica durante a diferenciação, como brotamento, crescimento e liberação de uma estrutura muito semelhante à forma amastigota, com capacidade replicativa e positiva para a marcação com o anticorpo alfa-Ssp-4 específico para amastigotas. Análises por espectrometria de massas mostraram que o perfil lipídico total é alterado, com aumento na proporção de liso-lipídios durante a diferenciação, podendo estar correlacionado às alterações morfológicas observadas no processo de amastigogênese. Com o intuito de obter amostras enriquecidas de membrana plasmática, foi elaborada uma nova estratégia, baseada na interação biotina/avidina. Tal estratégia visou o estudo mais detalhado dos constituintes da membrana, visto que foi observada alteração em sua forma, sugerindo sua relevância para o processo de diferenciação. Foram também feitas análises do transcritoma de amastigotas extracelulares utilizando microarranjos de DNA, comparando-os com os demais estágios, principalmente tripomastigotas metacíclicos e amastigotas obtidos de cultura de células. Estas análises proporcionaram uma visão geral dos grupos de genes diferencialmente expressos entre tripomastigotas metacíclicos e amastigotas extracelulares, no qual se pode destacar como aumentados em amastigotas genes envolvidos na replicação, reparo e transcrição do DNA, e no processamento de RNA. Também foram detectados genes com o mesmo padrão de expressão em amastigotas extracelulares e amastigotas de cultura de célula, sugerindo a proximidade entre os dois tipos de formas replicativas intracelulares. Tais grupos gênicos podem ser agora melhor investigados, corroborando para a elucidação dos mecanismos de regulação de sua expressão, suas funções em cada estágio e sua importância durante a diferenciação. Os dados aqui apresentados abrem muitas perspectivas para a investigação da amastigogênese, um fenômeno ainda pouco conhecido, de vital importância para o T. cruzi e que pode conter novas informações para o desenvolvimento de terapias para doença de Chagas. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas’ disease, which still represents an important public health problem in Latin America. Studies on T. cruzi have been rendered feasible by the possibility to reproduce under in vitro culture conditions the life-cycle of the parasite. This work is focused on the description of the morphological and molecular changes occurring in the course of the in vitro differentiation of metacyclic trypomastigotes to amastigotes (extracellular amastigogenesis). The morphological changes have been characterized by optical and electron microscopy investigation during differentiation, including budding, development and release of a structure resembling to amastigote forms. These extracellular amastigotes are able to replicate and react with an antibody against the Ssp-4 antigen, which is specific for amastigotes. Mass-spectrometry analyses have shown total lipid profile changes during amastigogenesis, with an increase in lyso-lipids ratios during differentiation; this could be related to morphological alterations observed in the course of the amastigogenesis process. In order to obtain plasma membrane enriched samples, a new strategy was elaborated based on biotin/avidin affinity purification. The strategy aims to identify plasma membrane and its components, since important morphological changes occur during amastigogenesis which are very likely relevant to differentiation process. Furthermore, the transcriptome analysis of extracellular amastigotes is described using DNA microarrays to compare metacyclic trypomastigotes and cell culture derived amastigotes. These analyses allowed a broad comparison between metacyclic trypomastigotes and extracellular amastigotes differentially expressed group of genes, such as those involved in replication, repairing and transcription of DNA, and processing of RNA, almost all of them more expressed in extracellular amastigotes. Genes presenting similar expression patterns have been also observed in extracellular and intracellular amastigotes, suggesting the similarity between these developmental forms. These genes are being investigated in order to get further insight into the mechanisms involved in their expression regulation and their relevance to the differentiation process. The data presented herewith pave the way to investigate the amastigogenesis process, an important step of T. cruzi life-cycle.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T19:50:42Z : No. of bitstreams: 1 poggiani_fm_me_jabo.pdf: 1405025 bytes, checksum: 22fc79f12e28b4a908cf9bba6c30d8e2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A utilização de novas técnicas complementares de imagem no auxílio diagnóstico das afecções respiratórias é fundamental à rotina clínica. As técnicas de endoscopia e vídeocirurgia são comuns em medicina humana, mas pouco empregadas na medicina veterinária. Esta pesquisa teve como objetivo principal correlacionar os padrões pulmonares ilustrados em projeções radiográficas com as observações obtidas por meio da broncoscopia, toracoscopia, citologia e histologia de estruturas respiratórias de suínos. Secundariamente, relacionar os valores do peso, temperatura e do hemograma observados antes e após os procedimentos cirúrgicos. Foram utilizados 40 suínos da raça Landrace, machos ou fêmeas, com idade entre quatro a seis semanas. Os animais foram alocados em dois grupos denominados de grupo controle (Gc) e grupo doente (Gd). As mensurações do peso e temperatura e as colheitas de sangue foram realizadas em momentos pré-determinados. As imagens radiográficas, broncoscópicas e toracoscópicas foram categorizadas em escores de acordo com a severidade das lesões pulmonares. A análise estatística dos resultados permitiu estabelecer diversas correlações positivas e negativas entre as imagens radiográficas, broncoscópicas e toracoscópicas. A histologia e citologia possibilitaram caracterizar as alterações pulmonares. Logo, a radiografia deve ser utilizada na triagem de lesões pulmonares a serem investigadas por meio da broncoscopia e toracoscopia, visto que estes procedimentos permitiram a aquisição de imagens e fragmentos pulmonares para o exame histológico e não interferiram nos parâmetros fisiológicos dos suínos / Using of new complementary image techniques is important in diagnostic approach of respiratory diseases during clinical routine. Endoscopic and videosurgery techniques are commonly used in human medicine, however, they are poorly used in veterinary medicine. The main purpose of this research was to correlate pulmonary radiographic patterns with findings obtained by bronchoscopy, thoracoscopy, cytology and histology of the respiratory structures of swine. Moreover, correlate values of body weight, body temperature and blood count cells before and after surgery and anesthesia procedures. A total of 40 Landrace pigs, males or females, from 4 to 6 weeks were used. Animals were divided into two groups: control group (Gc) and sick group (Gd). Body weight, body temperature and blood samples were taken before and after surgery procedure. The radiographic, bronchoscopic and thoracoscopic images were categorized in scores, according to the severity of the observed lung lesions. Bronchoscopy and thoracoscopy provide better details of pulmonary lesions, mainly in the group of sick animals (Gd). Based on statistical analysis, it was possible to stablish positive and negative correlations among radiographic, bronchoscopic and thoracoscopic findings. Histological and cytological alterations were useful to evaluate pulmonary changes related. Therefore, radiography should be used as a screening method to identify pulmonary lesions to be investigated by bronchoscopy and thoracoscopy, since they add useful images images and lung samples for histopathological analysis and did not affect physiological parameters of pigs

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T18:19:54Z : No. of bitstreams: 1 duarte_rr_me_botfmvz.pdf: 286081 bytes, checksum: 00995aa2bb12a9683f3f00b26387417f (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / The differences in stabling conditions may influence the microbiota in airway of healthy horses, and consequently result changes in airway infections. Diagnosis of airway affections may be reach by using tracheobronchial (TB) wash and pulmonary biopsy as well. The aim of this study was to evaluate the pulmonary and TB microbiota in healthy horses submitted to different stabling. Eighteen healthy adult male quarterhorses were distributed in two groups: Group 1 (nine animals maintained in extensive regimen); and Group 2 (nine animals kept in stall conditions). The washes were carried out using physiologic solution in TB lumen through the intravenous catheter (14G x 30 cm). Pulmonary biopsies were collected using semiautomatic Tru-cut needles (16G x 20 cm). The material collected was submitted to microbiological culture. No trickiness was observed in the animals. At least one species of bacteria grown in wash tracheobronchial culture in the horses studied. In TB washes was observed predominance both of Gram negative and facultative aerobic microorganisms. In 38.5% out of the washes were isolated Gram-positive coccus, predominantly Staphylococcus. Escherichia coli and Enterobacter were isolated in 3% and 11%, respectively. The culture of airway in stabling animals showed a higher number of isolates in both wash and biopsy techniques comparing to the horses kept in extensive regimen.

Orientador : Profª. Drª. Andrea Senff-Ribeiro / Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 17/02/2017 / Inclui referências : f. 102-115 / Área de concentração / Resumo: As aranhas do gênero Loxosceles (aranhas-marrons) são responsáveis pela maioria dos acidentes envolvendo animais peçonhentos em Curitiba e região metropolitana, sendo consideradas um problema de saúde pública. O veneno dessas aranhas tem sido amplamente estudado e diversos grupos de pesquisa têm investido na caracterização de suas toxinas. Entretanto, a literatura referente à hemolinfa dessas aranhas é bastante restrita: o único artigo existente foi publicado pelo nosso grupo em 2015. Baseado na premissa de que o conhecimento dos conteúdos celular, lipídico e protéico podem fornecer informações importantes sobre a toxinologia e sobre moléculas bioativas, o objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e celular da hemolinfa de L. intermedia, bem como analisar potenciais atividades biológicas da hemolinfa e suas moléculas. O perfil proteico da hemolinfa de L. intermedia em eletroforese (SDS-PAGE) uni e bidimensional revelou a presença de proteínas e peptídeos com massas variando de 20 a 200 kDa. As proteínas da hemolinfa apresentaram os resíduos de glicosilação: galactose ? (1,4) N-acetilglucosamina e alta manose. Por meio de espectrometria de massas foi verificado que os lipídios predominantes na hemolinfa são a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina. Quanto à fração celular da hemolinfa, quatro tipos de hemócitos foram identificados: os pró-hemócitos, os plasmatócitos, os adipohemócitos e os granulócitos. A atividade esfingomielinásica da toxina recombinante fosfolipase-D de L. intermedia (LiRecDT1) foi reduzida em 70% na presença da hemolinfa, contudo não foi encontrado um inibidor específico para essa enzima, sugerindo que essa redução tenha sido decorrente da dificuldade da toxina em encontrar seu substrato preferencial. O ensaio de imunodetecção indicou na hemolinfa a presença de uma proteína de aproximadamente 36 kDA com epítopo similar ao da toxina LiRecDT1, mas a hemolinfa não apresentou toxicidade para camundongos nas concentrações testadas. O cultivo primário dos hemócitos foi realizado em meio Sf-900-III SFM contendo 250 ?g/ml de gentamicina e 10% de soro (SFB). Verificou-se que a incubação dos hemócitos com veneno de L. intermedia e com a toxina loxoscélica recombinante LiRecDT1 não alterou as características morfológicas das células em microscopia optica, sugerindo ausência de processos de apoptose ou necrose. Dificuldades metodológicas não permitiram a caraterização dos hemócitos por microscopia eletrônica de transmissão. O estudo de proteômica (shotgun) não identificou inibidores de proteases ou de outras enzimas presentes no veneno; e grande parte das identificações foram relacionadas a proteínas estruturais e à hemocianina. Os experimentos de citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente Mitotracker permitiram a separação eficiente das populações de pró-hemócitos e plasmatócitos, contudo havia granulócitos nas duas amostras isoladas. Os ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos presentes na hemolinfa isolados por HPLC não evidenciou a inibição do crescimento dos microrganismos Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A hemolinfa é uma amostra biológica muito rica que deve continuar a ser investigada, contudo as dificuldades de estudá-la estão relacionadas com o baixo rendimento da coleta da amostra e a grande complexidade bioquímica do seu conteúdo (celular e proteica). Palavras-chaves: hemolinfa, L. intermedia, hemócitos, antimicrobiano, cultivo primário, inibidores, citometria. / Abstract: Loxosceles genus spiders (Brown spiders) are responsible for most of the accidents involving venomous animals in Curitiba and metropolitan region and for this reason they are considered a public health problem. The venom from these spiders has been widely studied and several research groups have been focused in the characterization of the toxins. However, the literature on the hemolymph from these spiders is rather restricted: the only article was published by our group in 2015. Based on the premise that knowledge of the cellular, lipidic and proteic contents can provide important information about toxinology and bioactive molecules, the aim of this work was biochemical and cellular characterization from L. intermedia hemolymph as well as to analyze potential biological activities present in this hemolymphand yours molecules. The protein from hemolpymph of L. intermedia hemolymph in one and two-dimensional SDS-PAGE revealed the presence of proteins and peptides with molecular mass varying from 20 to 200 kDa. The protein from hemolymph presented glycosylation: galactose ? (1,4) N-acetylglucosamine and high mannose. By means of mass spectrometry analysis was verified the lipidic predominance in the hemolymph are phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. In relation to the hemolymph cellular fraction four types of hemocytes were identified: pro-hemocytes, plasmatocytes, adipohemocytes and granulocytes. The sphingomyelinase activity of L. intermedia recombinase phospholipase-D (LiRecDT1) was decreased 70% In the presence of hemolymph, however, no specific inhibitor to this enzyme was found, suggesting that this reduction was related to difficulty of the toxin to find your preferential substrate. The immunodetection assay indicated there are in the hemolymph a protein with nearly 36 kDa with epitope resembling LiRecDT1, but this protein showed no toxicity to mice at the concentrations tested. The primary culture of hemocytes was done in Sf-900-III SFM medium plus 250 ?g /ml gentamycin and 10% FBS. It was found that the incubation venom from L. intermedia and toxin LiRecDT1with hemocytes did not present morphological alterations in these cells analyzed by optical microscopy, indicated no apoptosis or necrosis. Methodological difficulties did not allow the hemocytes to be characterization by transmission electron microscopy. In proteomic (shotgun) analysis no protease inhibitors or other enzymes present in the venom; and the most of identification were related to structural proteins and hemocyanin. The experiments of flow citometry with MitoTracker probe labeling resulted in the efficient isolation of prohemocytes and plasmatocytes, however there was granulocytes in both of samples isolated. The antimicrobial activity assays of peptides present in hemolymph isolated by HPLC did no show isolated activity against Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Hemolymph is a very rich biological sample that needs to be investigated more thoroughly, but the difficulties of studying it are related to the low amount of sample (cellular and protein). Key-words: Hemolymph, L. intermedia, hemocytes, antimicrobial, primary culture, inhibitors, cytometry.

Orientadora : Profª Drª Maria Cristina L. G. Santos / Co-orientador : Prof. Dr. Ricardo Lehtonen de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/09/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O tendão tibial posterior (TTP) é particularmente vulnerável e sua insuficiência é reconhecida como a principal causa do pé plano adquirido do adulto. Alguns pacientes têm uma predisposição sem causa clinicamente reconhecida, sugerindo que as características individuais, incluindo fatores genéticos, desempenham um papel importante na tendinopatia. As metaloproteinases da matriz (MMP) são enzimas responsáveis por degradar e remodelar o colágeno, principal componente dos tendões. O objetivo do presente estudo foi investigar a associação do polimorfismo -77 (rs2252070) da MMP-13 isoladamente e em haplótipo com os polimorfismos -519 (rs1144393) e -1607 (rs1799750) da MMP-1 e -799 (rs11225395) da MMP-8 e a predisposição a disfunção do TTP. A amostra de 200 pacientes selecionados foi dividida em: grupo teste com 100 pacientes submetidos à procedimentos cirúrgicos e de diagnóstico histopatológico de lesão degenerativa do tendão tibial posterior e grupo controle com 100 pacientes com tendão do tibial posterior intacto e sem sinais de degeneração. O DNA dos voluntários foi obtido a partir de células epiteliais da mucosa bucal, por extração com acetato de amônio. A identificação dos genótipos foi realizada por PCR e RFLP. A análise estatística dos resultados foi realizada pelos testes de Mann-Whitney U (idade), Exato de Fisher (IMC), Regressão logística múltipla, Análise por combinação, Chi-quadrado (frequências alélicas e genotípicas) e SNPstats (haplótipos), todos com nível de significância de 5%. Houve uma diferença significativa nas frequências alélicas e genotípicas entre os grupos teste e controle para os polimorfismos -77 da MMP-13, -519 e -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8. Análise de haplótipo indicou diferença significativa entre os dois grupos estudados. De acordo com nossos resultados o polimorfismo -77 da MMP-13 isoladamente e em haplótipo com polimorfismos -519 e -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8 está associado à tendinopatia no tendão do tibial posterior. Palavras-chave: MMPs, MMP-1, MMP-8, MMP-13, Metaloproteinases, Polimorfismos em MMPs, Tendinopatia do Tibial Posterior. / Abstract: Posterior tibial tendon (PTT) is particularly vulnerable and its insufficiency is recognized as the main cause of adult acquired flatfoot. Some patients have a predisposition without clinically recognized cause, suggesting that individual characteristics, including genetic factors, play an important role in tendinopathy. The matrix metalloproteinases (MMP) are enzymes responsible for degrading and remodeling the collagen, the main compomente tendons The objective of the present study is to investigate the association of -77 (rs2252070) matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) polymorphism and its haplotypes with -1607 (rs1799750), -519 (rs1144393) MMP-1 and -799 (rs11225395) MMP-8 and risk of PTT dysfunction. The sample of 200 selected patients was divided into test group: 100 patients undergoing surgical procedures and pathological diagnosis of degenerative lesions of the posterior tibial tendon, and control group: 100 patients with posterior tibial tendon intact and no signs of degeneration. The DNA of the volunteers was obtained from oral mucosa epithelial cells, by extraction with ammonium acetate. PCR and RFLP were used for analysis of genotypes. Statistical analysis of results was performed by Man Whitney U test (age), Fisher's Exact (IMC), multiple logistic regression, analysis by combining and Chi-squared (allelic and genotype frequency) and SNPstats (haplotype), test with significance level of 5%. There was a significant difference in the presence of the different alleles and genotypes between the control group and test group for the -77 MMP-13,-519 and -1607 MMP-1, -799 MMP-8, polymorphism. Global haplotype analysis indicated a significant difference between both groups. According to our results, -77 MMP-13polymorphism isolated and its haplotypes with -519, -1607 MMP-1 and -799 MMP-8 are associated to tendinopathy in posterior tibial tendon. Keywords: MMPs, MMP-1, MMP-8, MMP-13, metalloproteinases, Polymorphisms in MMPs, Posterior Tibial Tendinopathy.