Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yvanna Carla Salgado.pdf: 1951579 bytes, checksum: e426d3a8c9453f597957b8a5550337a0 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The medicinal plants study has led to the discovery of pharmacologically active substances. The species Psychotria nuda (Cham. and Schltdl.) Wawra is a shrubby plant distributed in the Atlantic Forest at the east coast of Brazil and haven’t phytochemical studies and no description of their biological activities until the present moment. This study evaluated the antimicrobial, antioxidant and cytotoxic activity. The hydroalcoholic extract showed no antimicrobial activity against strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. However, in antioxidants tests, the extract showed antioxidant action scavenger of cationic radical ABTS+ (IC50: 33,48 ± 1,99 g/mL), and was able to reduce lipid peroxidation induced by AAPH radical on erythrocytes (IC50: 31,59 ± 4,14 g/mL for 3 hours incubation) without cytotoxic effect in these cells. It showed a moderate antioxidant activity of hypochlorous acid (IC50: 359,24 ± 4,57 g/mL) and reduced activity to scavenger DDPH radical (IC10: 118,76 ± 28,83 g/mL), superoxide anion (IC15: 196,92 ± 0,270 g/mL), and the enzymatic oxidation induced by HRP (IC20: 104,15 ± 18,15 g/mL). We observed high cytotoxicity assessment models of cell viability by MTT in epithelial HaCaT cells (CL50: 7,72 ± 1,22 g/mL) and a moderate citotoxicity for the strain of mouse embryonic fibroblast NIH3T3 (CL50: 61,65 ± 5,12 g/mL). In assay of neutral red dye incorporation in both lineage cells, we observed a high cytotoxicity in HaCaT cells (CL50: 6,07 ± 0,79 g/mL), but no effect of the extract over NIH3T3 cells at the used concentrations. The extract showed potential antioxidant and cytotoxic activity, and evaluation of crude extract allow us to conducting further research to identify the biologically active molecules / O estudo de plantas medicinais tem levado a descoberta de substâncias farmacologicamente ativas. A espécie Psychotria nuda (Cham. e Schltdl.) Wawra é uma planta arbustiva que se encontra distribuída na Floresta Atlântica na costa leste do Brasil e não possui estudos fitoquímicos aprofundados e nem descrição completa de suas atividades biológicas até o momento. O presente trabalho buscou avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante e citotóxica da espécie. O extrato hidroalcoólico não demonstrou atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Entretanto, nos ensaios antioxidantes, o extrato apresentou ação sequestradora do radical catiônico ABTS+ (IC50: 33,48 ± 1,99 g/mL), e foi capaz de reduzir a peroxidação lipídica induzida pelo radical AAPH em eritrócitos (IC50: 31,59 ± 4,14 g/mL para 3 horas de incubação) sem exercer atividade citotóxica nestas células. Demonstrou uma atividade moderada sobre o ácido hipocloroso (IC50: 359,24 ± 4,57 g/mL) e reduzida para os modelos de captação do radical DDPH (IC10: 118,76 ± 28,83 g/mL), ânion superóxido (IC15: 196,92 ± 0,270 μg/mL), e no modelo enzimático de oxidação induzida pelo HRP (IC20: 104,15 ± 18,15 μg/mL). Observamos uma elevada citotoxicidade no modelo de viabilidade celular pelo MTT frente à linhagem epitelial HaCaT (CL50: 7,72 ± 1,22 g/mL) e moderada citotoxicidade para a linhagem de fibroblastos embrionários de camundongo NIH3T3 (CL50: 61,65 ± 5,12g/mL). No ensaio de citotoxicidade de incorporação do corante vermelho neutro para ambas linhagens, observamos uma elevada citotoxicidade (CL50: 6,07 ± 0,79 /mL) frente à linhagem HaCaT; porém nenhum efeito do extrato sobre a linhagem NIH3T3 nas concentrações testadas. O extrato demonstrou uma potencial atividade antioxidante e citotóxica, e a avaliação do extrato bruto permite a condução de pesquisas para identificação de moléculas biologicamente ativas.

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais. / The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests.

Visando o tratamento tópico de tumores cutâneos, desenvolvemos micro e nanoemulsões para a co-localização cutânea de paclitaxel e ceramida C6. A nanoemulsão mostrou-se mais eficaz em promover penetração de ambos os compostos nas camadas viáveis da pele, com aumentos de 11,5 (paclitaxel) e 3,5 (ceramida) vezes comparado a uma solução controle, e não reduziu significativamente a viabilidade de equivalentes epidérmicos, sugerindo sua segurança para aplicação tópica. A incorporação na nanoemulsão diminuiu as concentrações de paclitaxel e ceramida necessárias para reduzir a viabilidade de células de melanoma a 50% em 6 a 15 vezes, respectivamente, sendo que a co-encapsulação desses compostos promoveu uma nova redução (4 vezes) nessas concentrações, demonstrando aumento da eficácia decorrente da associação dos compostos. A administração tópica do nanocarreador contendo paclitaxel e ceramida co-encapsulados promoveu desorganização e morte celular em equivalentes cutâneos com melanoma, demonstrando o potencial desta formulação para o tratamento tópico de tumores cutâneos. / Nano and microemulsions were developed in this study for cutaneous co-localization of the active agents paclitaxel and C6 ceramide for topical treatment of skin cancer. The nanoemulsion was more effective in promoting the penetration of the compounds into viable skin layers, with increases of 11.5- (paclitaxel) and 3.5- fold (ceramide) being observed. The nanoemulsion did not reduce the viability of human epidermis equivalents, suggesting its safety for topical application. Incorporation in the nanoemulsion reduced the concentration of paclitaxel and ceramide required to decrease viability of human melanoma cells to 50% by 6 to 15-fold compared with their solutions; co-encapsulation of the compounds promoted a further reduction of 4-fold. Topical administration of the nanocarrier with co-encapsulated paclitaxel and ceramide to skin equivalents with melanoma promoted disorganization and intense cytotoxicity. These results demonstrate the potential of nanoemulsions for association of paclitaxel and ceramide C6 to improve their cytotoxic effect and skin localization.

Compostos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados, foram preparados, caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR) e tiveram sua reatividade frente a células melanomas (B16F10 e TM1) verificada. Estes compostos são miméticos da tirosinase, enzima contendo em seu sítio ativo dois íons de cobre, presente em bactérias, plantas, animais e humanos, sendo responsável pela oxidação de fenóis a catecóis e destes às correspondentes quinonas. São enzimas relacionadas também à melanogênese, isto é, síntese de melanina, com formação de polímeros eumelanina e feomelanina, responsáveis pela pigmentação de nossa pele, olhos e cabelos. Os compostos mononucleares correspondentes foram também preparados e estudados, para efeito de comparação. Os resultados indicaram que os complexos dinucleares são mais ativos, tanto como miméticos da tirosinase, quanto em relação à citotoxicidade frente a melanomas, que os análogos mononucleares, mostrando que a estrutura é um fator determinante de ambas as atividades biológicas aqui estudadas. Ensaios de interação com as biomoléculas DNA e albumina humana (HSA) através de espectroscopia de UV/Vis e dicroísmo circular (CD) respectivamente, também foram realizados e complementaram os estudos. Atividade nuclease significativa foi observada para os complexos dinucleares, em presença de peróxido de hidrogênio, através de ensaios de clivagem em gel de agarose, buscando uma possível elucidação dos mecanismos de ação dos complexos em estudo. / Dinuclear copper(II) complexes with nitrogenated ligands were prepared, characterized by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR and EPR) and had their reactivity verified towards melanoma cells (B16F10 and TM1). These compounds are tyrosinase mimics, an enzyme present in bacteria, fungi, animals and humans, capable of catalyzing the oxidation of phenols to catechols, and catechols to the corresponding quinines, and containing two copper ions in its active site. Tyrosinases are also enzymes related to melanogenesis, assisting the formation of eumelanin and pheomelanin polymers, responsible for the colour of our eyes, skin and hair. The corresponding mononuclear copper(II) complexes were also prepared and comparative studies were performed. The results indicated that the dinuclear species are more reactive than the mononuclear ones, both as tyrosinase mimics as in cytotoxicity damage to melanoma cells, showing that the structure of such species is a determining factor of both biological activities. Experiments at the interactions of these complexes with the biomolecule DNA and human serum albumim, were also conducted by UV/Vis and circular dichroism spectroscopies, respectively, and complemented the previous studies. Nuclease activity was also assessed, in the presence of hydrogen peroxide, monitored by cleavage assays in agarose gel, in order to contribute to the elucidation of the mechanisms of action of these complexes

A irradiação de alimentos já foi aprovada e vem sendo utilizada em diversos países para aplicações e finalidades de uma ampla variedade de alimentos. Seus benefícios abrangem o aumento do prazo de validade, melhoria de higiene dos alimentos e consequentemente menor deterioração e perdas se comparado com alimentos que não sofrem radiação. Além disto, os alimentos após irradiados apresentam-se seguros em termos nutritivos e de redução de patógenos. Porém, alimentos que contem de médio a alto teor de gordura induzem a formação de um subproduto denominado 2-Alcilciclobutanonas, a qual sabemos que parte destes compostos ingeridos são normalmente excretados através das fezes, porém parte permanece depositada nos tecidos adiposos. Trabalhos realizados com estes compostos anteriormente apresentaram efeitos citotóxicos e genotóxicos em células de cólon. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos citotóxicos realizados em testes de viabilidade celular, testes genotóxicos em micronúcleo e testes mutagênicos com a técnica de Ames em condições experimentais in vitro dos compostos 2-dDCB e 2-tDCB. Para isso, o fígado foi o órgão de escolha para avaliar os possíveis efeitos destes compostos, uma vez que este órgão é geralmente acometido pelo acumulo de gordura. Foram utilizadas três linhagens hepáticas: HepG2, BRL3A e HTC. A análise dos resultados da viabilidade celular, revelou que as 2-dDCBs apresentaram discreto efeito citotóxico na concentração de 500 μM e as 2-tDCBs apresentaram danos baixos a partir de 100 μM e maiores em 500 μM, mostrando ser dose dependentes. Nos resultados de mutagenicidade, os compostos não apresentaram quaisquer efeitos mutagênicos nas concentrações e doses utilizadas, detectados pelo teste de Ames. Por fim, o ensaio de micronúcleo correspondeu às expectativas não demonstrando efeitos genotóxicos na linhagem, doses e tempos testados. Com base nos resultados atingidos, as 2 ACBs podem ser consumidas com relativa segurança, sob a ótica de possíveis efeitos mutagênicos e genotóxicos nas concentrações avaliadas. / Food irradiation has already been approved and has been used in several countries for applications and purposes of a wide variety of foods. Its benefits include increased shelf life, improved food hygiene and consequently less deterioration and losses compared to foods that do not undergo into radiation. In addition, food after irradiation is safe in terms of nutrients and pathogen reduction. However, foods that contain medium to high fat levels, induce the formation of a by-product called 2-Alkylcyclobutanones, which we know that part of these ingested compounds are normally excreted through the feces, but part remains deposited in the adipose tissues. Work performed with these compounds previously showed cytotoxic and genotoxic effects on colon cells. Thus, the objective of the present work was to investigate the cytotoxic effects performed in cell viability tests, genotoxic tests in micronucleus and mutagenic tests with Ames technique under in vitro experimental conditions of 2-dDCB and 2-tDCB compounds. Hence, the liver was the chosen organ to evaluate the possible effects of these compounds, since this organ is usually affected by accumulation of fat. Three hepatic cell lines were used: HepG2, BRL3A and HTC. Analysis of the cell viability results revealed that the 2-dDCBs presented a discrete cytotoxic effect at the concentration of 500 μM and the 2-tDCBs presented low damages from 100 μM and larger at 500 μM, showing to be dose dependent. In the mutagenicity results, the compounds did not show any mutagenic effects at the concentrations and doses used, detected by the Ames test. Finally, the micronucleus test corresponded to expectations demonstrating no genotoxic effects in the cell line, doses and times tested. Based on the results achieved, the 2 ACBs can be consumed with relative safety, from the perspective of possible mutagenic and genotoxic effects in the evaluated concentrations.

Nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) são sistemas coloidais nanoparticulados muito utilizados para encapsulação de substâncias hidrofóbicas, com o intuito de proteger e aumentar a sua biodisponibilidade. Tais sistemas podem ser produzidos por métodos de baixa energia, como a temperatura de inversão de fase (PIT), a qual é baseada na mudança de solubilidade do tensoativo não iônico polietoxilados com a temperatura. O estudo do comportamento de tais sistemas durante a passagem pelo trato gastrointestinal torna-se interessante, caso deseje-se incorpora-los em matrizes alimentícias. Os modelos in vitro dinâmicos têm sido desenvolvidos para simular mais efetivamente os atributos que ocorrem in vivo, e dentre eles o mais conhecido é o sistema TIM (TNO intestinal model), que simula os principais eventos que ocorrem no lúmen do intestino delgado. Outro parâmetro importante a ser analisado, em nanopartículas passíveis de serem ingeridas, é a citotoxicidade, que pode ser avaliado através do emprego de culturas celulares intestinais e epiteliais. O presente trabalho de doutorado teve como objetivo a utilização de manteiga de cupuaçu e manteiga de murumuru para encapsulação do beta-caroteno em nanopartículas lipídicas sólidas produzidas pelo método PIT, e o estudo de sua citotoxicidade e digestibilidade in vitro dinâmica. Os tensoativos utilizados foram o Cremophor RH 40 e o Span 80, e os sistemas foram produzidos na presença e na ausência de alfa-tocoferol. De maneira geral pode-se dizer que as nanopartículas apresentaram diâmetro médio ao redor de 35 nm com polidispersidade 0,2 e permaneceram estáveis por um período de 4 meses. Os sistemas produzidos com manteiga de murumuru preservaram melhor o beta-caroteno encapsulado e o alfa-tocoferol agiu como um antioxidante na preservação do bioativo. As nanopartículas apresentaram estabilidade física frente às diferentes condições de stress, exceto quando foram expostas em concentrações salinas muito altas e pH básico. No que diz respeito à digestibilidade, as nanopartículas permaneceram estáveis no estômago e começaram a desestabilizar no duodeno; a biodisponibilidade total do beta-caroteno foi de 50 e 49% para respectivamente as partículas de manteiga de murumuru e manteiga de cupuaçu; a lipólise foi de 51% para as nanopartículas de manteiga de cupuaçu e de 49,8% para as nanopartícula de murumuru. Em relação aos estudos em linhagem de células in vitro e a avaliação da toxicidade, pode-se dizer que as linhagens de HEPG-2 apresentaram maior viabilidade celular do que as linhagens de CaCo-2 e a morte celular começou a ser mais pronunciada na diluição de 11,38µg/ml para as células de HEPG-2 e na diluição de 5,69 µg/ml para as células de CaCo-2, portanto, caso se deseje aplicá-las em matrizes alimentícias, é aconselhável respeitar essas concentrações. Além do mais, os resultados mostram que as nanopartículas avaliadas tem um potencial muito bom para encapsular compostos bioativos lipossolúveis e se mostraram um bom veiculo para serem empregadas em alimentos. / Solid lipid nanoparticles are colloidal delivery systems used for encapsulation of hydrophobic substances, with the aim to protect and increase bioavailability. Such systems could be produced by low energy methods, like phase inversion temperature (PIT) which is based in the change of solubility nonionic polyethoxylated surfactants with temperature. In order to incorporate these systems in foods, it is important studying their behavior under gastrointestinal tract conditions. The in vitro dynamic models had been developed to simulate more effectively the properties that occur in vivo, between them the TIM system (TNO intestinal model) is one of the most known, which simulates the most important events that occur in the lumen of the small intestine. Other important parameter in nanoparticles that can be ingested is the cytotoxicity that can be evaluated using intestinal and epithelial cell cultures. This doctoral work aimed to use cupuaçu butter and murumuru butter to encapsulate beta-carotene in solid lipid nanoparticles produced by the PIT method, moreover the study of these particles cytotoxicity and digestibility in dynamic in vitro systems. The surfactants used were Chemophor RH 40 and Span 80, and the systems were produced in the presence and absence of alpha-tocopherol. Generally one can say that these nanoparticles present average diameter around 35 nm with polydispersity 0.2 and remain stable during 4 months. The systems based with murumuru butter showed better preservation of the beta-carotene encapsulated and alpha-tocopherol acted like an antioxidant in the bioactive preservation. The nanoparticles presented physical stability faced various stress conditions, with the exception of very high saline concentrations and basic pH. Regarding the digestibility, the nanoparticles remain stable in the stomach and start to destabilize in the duodenum; the total bioavailability of beta-carotene were 50 and 49% to the murumuru butter and cupuaçu butter, respectively; the lipolysis were 51% to the nanoparticles based in cupuaçu butter and 49.8% to the murumuru based nanoparticles. Regarding the studies of in vitro cellular uptake and toxicity one can say that the HEPG-2 present bigger cellular viability than the Caco-2 and the cellular death begin with dilution of 11,38µg/ml for cells of HEPG-2 and with dilution of 5,69 µg/ml for cells of CaCo-2, so if one desire to apply in food matrices it is advisable to respect these concentrations. Furthermore, the results showed that the tested nanoparticles had a very good potential to encapsulate bioactive liposoluble components and are a good way to be applied in food matrices.

As neoplasias malignas, doenças mundialmente conhecidas como câncer, possuem um dos tratamentos mais onerosos, tóxicos e de baixa seletividade na terapêutica atual. Adicionalmente, o contínuo crescimento da incidência da doença também representa em uma grande problemática. Os produtos de origem natural se apresentam como alternativas para o tratamento de diversas doenças, incluindo o câncer. A capsaicina, produto natural proveniente das pimentas do gênero Capsicum, apresenta propriedades antineoplásicas, portanto, pode ser utilizada como protótipo para obtenção de análogos. Quatro séries foram planejadas e sintetizadas, obtendo-se compostos ureídicos e tioureídicos. A estratégia sintética se baseou na reação da piperonilamina ou vanililamina com isocianatos ou isotiocianatos, ligados a substituintes aromáticos ou alquílicos. Vinte e sete análogos foram sintetizados com rendimentos variando entre 22 a 90 %. Todos os compostos apresentaram aspecto sólido variando a cor de branco a levemente amarelados. Para a caracterização das substâncias obtidas foram utilizados dados de RMN 1H e 13C, ponto de fusão e a determinação de pureza foi realizada mediante HPLC. Todos os compostos foram submetidos a ensaios de avaliação da atividade citotóxica por redução do MTT contra linhagens de células cancerígenas e células sadias. Os compostos RPF652, RPF 512 - 514) apresentaram atividade comparável ou superior ao protótipo com valores de IC50 na faixa de micromolar. Os resultados apontados pela modelagem molecular indicam que descritores eletrônicos como Ehomo e Elumo podem estar associados à atividade do composto, ClogP (3,92) pode favorecer melhor permeabilidade na membrana celular, e o maior número de sítios de acepção de ligação de hidrogênio podem corroborar com a citotoxidade em linhagem A2058. Particularmente, o análogo RPF652 apresentou atividade pronunciada com valores de IC50 de 55, 67, e 87 µM contra as células A2058, SK-MEL 25, e U87, respectivamente, o que representa atividade de superior à capsaicina. Como uma tendência o composto RPF652 causou parada no ciclo de linhagem B-RAF B16F10 não levando a célula à morte. Porém esta linhagem não apresenta mutação no códon V600E. Em contraponto, o análogo RPF652 apresentou maior potência contra linhagem V600EB-RAF A2058 mutada, indicando possível seletividade em linhagens que apresentam a mutação no códon V600E da proteína B-RAF. Ademais, novos esforços devem ser concentrados no análogo RPF652 para melhor elucidação mecanística de sua atividade. / Malignant neoplasms have one of the most expensive, non-selective and toxic treatment of present times. This situation, combined with the rising incidence rate, represents a major problem for humanity. The use of natural products can be an alternative for treatment of several diseases, including cancer. Capsaicin is a natural product derived from Capsicum peppers, with reported anticancer activity and can be used as prototype for the design of new molecules with remarkable activity. Capsaicin analogues were designed and synthesized in four series of derivatives, replacing the prototype amide bond with urea and thiourea functions. The synthetic approach builds the urea/ thiourea scaffold using the reaction of piperonyl/ vanilyl amine with alkyl and aryl isocyanides/ isothiocyanides. Twenty-seven new compounds were obtained with yields from 22 to 90 %, and were fully characterized using 1H and 13C NMR, the purity was determined by melting point and HPLC. All of the obtained compounds were evaluated in MTT cytotoxic assays against different cancer cell-lines (B16F10, A2058, SK-MEL 25 and U-87), and compared with healthy human cells (T75). Additionally, the most active compound was submitted to a cell cycle arrest assay. The thiourea derivative RPF652 was the most active compound, and the urea derivatives RPF512, RPF513 and RPF514 showed good micromolar IC50 values. This results, when correlated with several in silico-calculated properties for the obtained molecules, suggests that ClogP, Ehomo, Elumo and the number of hydrogen-bond acception sites may be correlated to the anticancer activity reported. RPF652 especially, showed IC50 values with superior activity and better selectivity index when compared with capsaicin. The cell-cycle assay of RPF652 showed significant arrest in V600E-codon B-RAF non-mutated cell lines (B16F10) without killing it. V600E-codon B-RAF mutated cells A2058, were significantly more sensitive to the compound. These findings may suggest some insights about the mechanism of action and targets of this compounds.

Toxinas animais podem ser moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. Recentemente, tem sido provado que medicamentos tradicionais chineses (TCM) compostos por substâncias extraídas de venenos de sapos são efetivos no tratamento de hepatocarcinoma e outros tipos de câncer. Desta forma, os objetivos deste estudo foram isolar toxinas do veneno do sapo Rhinella schneideri e avaliar suas ações antineoplásicas em diferentes linhagens celulares tumorais, além de avaliar a capacidade das toxinas em induzir instabilidade genômica (genotoxicidade e mutagenicidade). O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise resultando na fração de baixa massa molecular (VRs), a qual foi submetida a uma cromatografia de fase reversa em coluna C18 em um sistema FPLC. Avaliou-se a citotoxicidade do VRs em linhagens celulares HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBr-3, L292 e em hepatócitos primários isolados de ratos Wistar, através do ensaio do MTT. Analisou-se também a influência do VRs em diversos parâmetros mitocondriais, através de experimentos realizados com mitocôndrias isoladas de fígados de rato. Adicionalmente, foram isoladas três toxinas do VRs, denominadas Rs1, Rs2 e Rs3, com as quais foram realizados ensaios de citotoxicidade com células tumorais HepG2 e hepatócitos primários, análise da dissipação do potencial de membrana mitocondrial, avaliação de indução de fragmentação nuclear, análise da distribuição do ciclo celular, ensaios de avaliação de apoptose/necrose utilizando anexina V (AV) e iodeto de propídeo (PI) e ativação das caspases 3, 8 e 9 por western blot. O VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) foi citotóxico para quatro das seis linhagens tumorais estudas (B16F10, HepG2, HL-60 e Skbr-3), demonstrou interferir pouco na viabilidade de células não tumorais L929, e citotóxico para hepatócitos. O VRs não induz efeitos significativos nos parâmetros bioenergéticos e oxidativos das mitocôndrias isoladas de fígado de ratos sadios, o que é um indicativo que o VRs não induz efeito citotóxico a estas células através da via mitocondrial. Além disto, o VRs diminuiu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Através da cromatografia de fase reversa foram isoladas três toxinas do VRs, dentre as quais duas (Rs1 e Rs3 [1-1000 nM]) demonstraram ser mais citotóxicas às células tumorais HepG2. Estas toxinas pouco ou nada interferiram na viabilidade celular de hepatócitos primários, característica extremamente importante para uma possível aplicação como agente antitumoral. Nos experimentos de dissipação do potencial de membrana mitocondrial vi e de fragmentação nuclear (características de células em apoptose) em células HepG2 ambas as toxinas se mostraram capazes de induzir a dissipação do potencial de membrana (de maneira concentração-dependente) e também causaram a condensação da cromatina e fragmentação nuclear. A análise da distribuição do ciclo celular em células HepG2 após o tratamento com Rs1 e Rs3 demonstrou que as toxinas induziram aumento da fase G2/M em menores concentrações (10- 50 nM), seguido de uma diminuição de células nesta fase e aumento em fase G0/G1 em maiores concentrações (100 - 1000 nM). A quantidade de células apoptóticas foi maior em concentrações maiores, porém não estabeleceu relação concentração-resposta. Os ensaios realizados com anexina V e PI, demonstram que ambas as toxinas são capazes de induzir as células HepG2 à morte, principalmente pelo processo de apoptose. Os ensaios de caspases 3, 8 e 9 confirmaram a ativação da apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca. Os ensaios de mutagenicidade e genotoxicidade revelaram que ambas as toxinas não causaram danos ao DNA das células HepG2. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo indicam a seletividade dos efeitos citotóxicos das toxinas Rs1 e Rs3 pelas células tumorais HepG2, induzindo estas células à morte principalmente por apoptose, justificando o potencial uso destas duas toxinas em terapias antitumorais. / Animal toxins can be applicable in generating therapeutic agents and/or tools for basic and applied research. Recently, it has been proved that traditional Chinese medicines (TCM) consisting of substances extracted from toad poisons have marked effect in the treatment of hepatocellular carcinoma and other cancers. Thus, the objectives of this study were to isolate toxins from Rhinella schneideri toad poison and evaluate their antineoplastic effects in different tumor cell lines, and to evaluate the ability of toxins to induce genomic instability (genotoxicity and mutagenicity). The poison from Rhinella schneideri was initially submitted to dialysis resulting in the fraction of low molecular weight (VRs), which was subjected to reverse phase chromatography on C18 column in a FPLC system. The cytotoxicity of VRs was assessed in cell lines HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBR-3, L292 and primary hepatocytes isolated from Wistar rats through MTT assay. The influence of VRs in various mitochondrial parameters was also evaluated through experiments with mitochondrias isolated from rat liver. Additionally, three toxins were isolated from VRs, named Rs1, Rs2 and Rs3, and cytotoxicity assays with tumor cells HepG2 and primary hepatocytes were performed with them. The analysis of mitochondrial membrane potential dissipation, nuclear fragmentation-inducing, evaluation of the cell cycle distribution, analysis of apoptosis/necrosis using annexin V (AV) and propidium iodide (PI) and activation of caspase 3, 8 and 9 by western blot were also performed. The VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) showed to be cytotoxic to four of the six tumor cell lines studied (B16F10, HepG2, HL-60 and SKBR-3), showed little interference with the viability of non-tumor cells L929, and showed to be cytotoxic to primary hepatocytes. It was also observed that the VRs did not induce significant effects on bioenergetic and oxidative parameters of isolated mitochondria, which is an indication that the VRs did not induce cytotoxic effect on these cells via mitochondrial pathway. In addition, the VRs have showed to reduce the accumulation of reactive oxygen species. Three toxins were isolated from VRs by reverse phase chromatography and two of them (Rs1 and Rs3 [1-1000 nM]) have shown to be more cytotoxic to tumor cells HepG2. These toxins cause only a small decrease in cell viability of primary hepatocytes, an extremely important feature for a possible antitumor action. The experiments of mitochondrial membrane potential dissipation and nuclear fragmentation (apoptosis characteristics) in HepG2 cells showed that both toxins were able to induce dissipation of the membrane potential (dose-dependent manner) and also caused chromatin condensation and nuclear fragmentation. Cell cycle distribution analysis in HepG2 cells after treatment with Rs1 and Rs3 showed increase in G2/M phase at lower concentrations (10 - 50 nM), followed by a reduction of cells in this phase and increase in the G0/G1 phase at viii higher concentrations (100 - 1000 nM). The amount of apoptotic cells was greater at higher concentrations but did not establish dose-response relation. Assays performed with annexin V and PI showed that both toxins are able to induce HepG2 cell death mainly by apoptosis. The assays of caspases 3, 8 and 9 confirmed the activation of apoptosis by both the intrinsic an extrinsic pathways. Mutagenicity and genotoxicity tests revealed that both toxins caused no damage to the DNA of HepG2 cells. Thus, the results of this study indicate the selective cytotoxic effect of toxins Rs1 and Rs3 by tumor cells HepG2, inducing these cells to death mainly by apoptosis, justifying the potential use of these two toxins in antitumor therapies.

Uma série de três complexos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados e grupos aromáticos (compostos 2, 4 e 6), foi sintetizada e caracterizada por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR). Esses compostos tiveram sua atividade tirosinase avaliada à temperatura ambiente, através da oxidação de L-di-hidroxifenilalanina (L-dopa), e sua citotoxicidade investigada frente a células melanomas, comparada às de complexos análogos de cobre(II) mononucleares (compostos 1, 3 e 5). A influência da luz UVB, que estimula a melanogênese, também foi verificada. A exposição das células à radiação de intensidade (13 ± 2) mJ/cm2 aumentou os danos causados, principalmente em presença das espécies dinucleares. A citotoxicidade dos diferentes complexos foi determinada frente a duas linhagens de melanomas humanos (SKMEL-05 e SKMEL-147), após 24 e 48h de incubação. Células com maior teor de melanina foram mais sensíveis aos efeitos dos complexos. Verificou-se um aumento na porcentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular após tratamento por 24 ou 48h com estes complexos, ao contrário do verificado frente a queratinócitos não tumorais. Testes clonogênicos também indicaram maior atividade do composto (2) contendo dois centros de cobre em sua estrutura, com diminuição significativa no número de células sobreviventes após tratamento. Ensaios complementares mostraram a redução dos íons de cobre(II) nos compostos (1) e (2) em presença de melanina e a formação de espécies reativas de oxigênio (radicais hidroxil e ânions superóxido), através de espectroscopia EPR ou do uso de sondas fluorescentes. Adicionalmente, foi constatado um aumento no nível de vacúolos citoplasmáticos após tratamento com o complexo (2), indicando indução à autofagia, corroborada pelo monitoramento das proteínas LC3 e tubulina, implicadas neste processo de morte celular. Os resultados apontam para a ocorrência de pelo menos dois mecanismos de ação dos complexos frente aos melanomas, por processo apoptótico e autofágico. Indicam ainda que esta reatividade frente a melanomas é fortemente dependente da estrutura dos complexos de cobre, sendo mais significativa para os dinucleares / A series of dinuclear copper(II) complexes containing nitrogen ligands and aromatic groups (compounds 2, 4 and 6), were synthesized and characterized by various spectroscopic methods (UV/Vis, IR and EPR). These complexes had their tyrosinase activity evaluated at room temperature, through the oxidation of L-di-hidroxyphenylalanine (L-dopa), and its cytotoxicity toward melanoma cells investigated, in comparison with the toxicity of the corresponding mononuclear complexes (compounds 1, 3 and 5). The influence of UVB light, that stimulates melanogenesis, was also verified. The exposition of the cells to radiation of intensity (13 ± 2) mJ/cm2, increased the caused damage, especially in the presence of dinuclear species. The cytotoxicity of the different complexes was determined toward two cell lines of human melanomas (SKMEL-05 e SKMEL-147), after 24 and 48h incubation. Cells containing higher leveis of melanin were more sensitive to the effects of the complexes. An increasing in the percentage of cells in the sub-G1 phase of cellular cycle was verified after treatment for 24 or 48h with these complexes. On the contrary, this effect was not observed with non-tumor keratinocytes. Clonogenic tests also indicated higher activity of compound 2 containing two copper centers in its structure, with a significant decrease in the number of survival cells after the treatment. Complementary assays show the reduction of copper(II) ions in complexes (1) and (2), in the presence of melanin, as well as the formation of reactive oxygen species (hydroxyl radicais and superoxide anions) via EPR spectroscopy or the use of fluorescent labels. Further, an increase in the levei of cytoplasmatic vacuoles was verified after treatment with complex (2), indicating induction to autophagy, which was corroborated by monitoring the proteins LC3 and tubulin, implicated in this process of cell death. The results pointed to the occurrence of at least two mechanisms of action of these complexes toward melanomas, apoptotic and autophagic processes. Also, they indicated that the reactivity of the studied compounds is strongly dependent on its structural features, being more remarkable to the dinuclear ones.

Compostos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados, foram preparados, caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR) e tiveram sua reatividade frente a células melanomas (B16F10 e TM1) verificada. Estes compostos são miméticos da tirosinase, enzima contendo em seu sítio ativo dois íons de cobre, presente em bactérias, plantas, animais e humanos, sendo responsável pela oxidação de fenóis a catecóis e destes às correspondentes quinonas. São enzimas relacionadas também à melanogênese, isto é, síntese de melanina, com formação de polímeros eumelanina e feomelanina, responsáveis pela pigmentação de nossa pele, olhos e cabelos. Os compostos mononucleares correspondentes foram também preparados e estudados, para efeito de comparação. Os resultados indicaram que os complexos dinucleares são mais ativos, tanto como miméticos da tirosinase, quanto em relação à citotoxicidade frente a melanomas, que os análogos mononucleares, mostrando que a estrutura é um fator determinante de ambas as atividades biológicas aqui estudadas. Ensaios de interação com as biomoléculas DNA e albumina humana (HSA) através de espectroscopia de UV/Vis e dicroísmo circular (CD) respectivamente, também foram realizados e complementaram os estudos. Atividade nuclease significativa foi observada para os complexos dinucleares, em presença de peróxido de hidrogênio, através de ensaios de clivagem em gel de agarose, buscando uma possível elucidação dos mecanismos de ação dos complexos em estudo. / Dinuclear copper(II) complexes with nitrogenated ligands were prepared, characterized by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR and EPR) and had their reactivity verified towards melanoma cells (B16F10 and TM1). These compounds are tyrosinase mimics, an enzyme present in bacteria, fungi, animals and humans, capable of catalyzing the oxidation of phenols to catechols, and catechols to the corresponding quinines, and containing two copper ions in its active site. Tyrosinases are also enzymes related to melanogenesis, assisting the formation of eumelanin and pheomelanin polymers, responsible for the colour of our eyes, skin and hair. The corresponding mononuclear copper(II) complexes were also prepared and comparative studies were performed. The results indicated that the dinuclear species are more reactive than the mononuclear ones, both as tyrosinase mimics as in cytotoxicity damage to melanoma cells, showing that the structure of such species is a determining factor of both biological activities. Experiments at the interactions of these complexes with the biomolecule DNA and human serum albumim, were also conducted by UV/Vis and circular dichroism spectroscopies, respectively, and complemented the previous studies. Nuclease activity was also assessed, in the presence of hydrogen peroxide, monitored by cleavage assays in agarose gel, in order to contribute to the elucidation of the mechanisms of action of these complexes