O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e de animais foi: 34,48% pela PCR and 54,83% pela nested-PCR para Cryptosporidium spp e 16,00% pela PCR e 50,00% pela nested-PCR para C. parvum. O emprego do corante Vistra Green melhorou significativamente a visualização do gel. Os resultados mostram que este método simples e de baixo custo pode ser melhorado para aplicação na rotina do laboratório. / The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.83% by nested-PCR for Cryptosporidium spp and 16.00% by single PCR and 50.00% by nested-PCR for C. parvum. Using Vistra Green for staining agarose gel, yielded the visualisation of the amplicons. These results show that this simple and cheap method could be improved to be used on the routine laboratory work.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Raquel Saucier Gomes.pdf: 2225218 bytes, checksum: 68d6b849a23bb4479d6785b36389a032 (MD5) Previous issue date: 2006-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The aim of the present work was to identify the occurrence of natural Cryptosporidium infection in domestic birds, commercialized in two public markets, in the city of Rio de Janeiro. 180 birds were acquired, being 60 ducks (Anas platyrhynchos), 60 chicks (Gallus gallus) and 60 quails (Coturnix japonica). The birds were housed in individual cages at the Protozoology laboratory of the Federal Rural University of Rio de Janeiro. As diagnostic method for the occurrence and infection dynamics was used de centrifuge - fluctuation technique. Measurements of the major and minor oocyst diameters were realized and compared between the origins of the birds. From the market of Madureira, a total of 29 (96,7%) ducks, 20 (66,66%) quails and 30 (100%) chicks were infected with Cryptosporidum sp. At the market of Campo Grande 17 (56, 7%) ducks, 13 (43, 33%) quails and 22 (73, 33%) chicks were infected. Statistically significant differences between the origin of the birds and infection rate were encountered for the ducks and the chicks, but not for the quails. The pre-patent period of the infection varied between 2 and 8 days, and the patent period varied between 3-46 days. Ducks present major resistance to the infection, but once established they present a longer patent period, with higher oocyst shedding than do quails and chicks. Observing the presented results can be concluded that the natural infection with Cryptosporidium is frequent in the studied domestic birds commercialized in public markets. Ducks, chicks and quails may play an important part in the dissemination of cryptosporidiosis in public markets, possibly representing a risk for human infection in persons that work or does frequent the markets. More studies should be undertaken to clarify about the risk factors associated with cryptosporidiosis and molecular studies for the characterization of the Cryptosporidium species involved. / O presente trabalho teve como objetivo identificar a ocorr?ncia da infec??o pelo protozo?rio do g?nero Cryptosporidium em aves dom?sticas comercializadas em dois mercados municipais situados no munic?pio do Rio de Janeiro - RJ, e associar poss?veis fatores de risco relacionados ? infec??o. No total foram adquiridas 180 aves, sendo 60 patos (Anas platyrhynchos), 60 pintos (Gallus gallus) e 60 codornas (Coturnix japonica). As aves foram encaminhadas ao laborat?rio de Protozoologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e acondicionadas em gaiolas individuais. A ocorr?ncia e din?mica de Cryptosporidium sp. nessas aves foram estudadas atrav?s da t?cnica de centr?fugo-flutua??o. Mensura??es do maior di?metro e menor di?metro dos oocistos foram realizadas e comparadas entre as aves dos mercados. No mercado de Madureira um total de 29 (96,7%) patos, 20 codornas (66,66%) e 30 pintos (100%) apresentaram infec??o por Cryptosporidum sp. e no mercado de Campo Grande 17 (56,7%) patos, 13 codornas (43,33%) e 22 (73,33%) pintos estavam infectados. Diferen?as estatisticamente significativas foram encontradas para a ocorr?ncia da infec??o entre os pintos e de patos dos dois mercados, por?m n?o para codornas. O per?odo pr?-patente da infec??o variou entre 2 e 8 dias e per?odo patente entre 3 a 46 dias. Patos possuem uma maior resist?ncia ? aquisi??o da infec??o por Cryptosporidium sp. que pintos e codornas, por?m uma vez estabelecida a infec??o, esta possui maior per?odo patente, com altas concentra??es de oocistos nas fezes, se comparado a pintos e codornas. Pode-se concluir que a infec??o natural por Cryptoporidium ? frequente nas aves estudadas. Patos, pintos e codornas podem ser disseminadores de criptosporidiose em mercados municipais, cria??es dom?sticas e/ ou de subsist?ncia dentro do munic?pio do Rio de janeiro, assim como podem constituir risco para infec??o em humanos, como crian?as, tratadores, comerciantes e frequentadores do local. Mais estudos ser?o feitos para a elucida??o dos fatores de risco associados ? infec??o por Cryptosporidium sp., assim como estudos de caracteriza??o molecular de isolados provenientes dos mercado municipias no Rio de Janeiro.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-07-29T01:17:18Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final_Sofia Aline Santos.pdf: 1372683 bytes, checksum: 1913347c4bf754b4de49bf2916dbb519 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-29T01:17:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final_Sofia Aline Santos.pdf: 1372683 bytes, checksum: 1913347c4bf754b4de49bf2916dbb519 (MD5) Previous issue date: 2014-03-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The presence of oocysts of pathogenic protozoa in coastal waters resulting from the introduction of humans and animals contaminated feces has been recorded in different regions of the world. Bivalve molluscs such oysters can filter and retain in their tissues encysted protozoa and so act as potential transmitter of parasitic forms capable of causing diseases like toxoplasmosis and cryptosporidiosis. The aim of this study was to detect natural contamination in oysters of the species Crassostrea rhizophorae, grown in areas at the influence of de Todos os Santos Bay, Apicomplexa protozoan (Cryptosporidium and Toxoplasma gondii). A total of 615 oysters were collected from five points in two municipalities in the period from January to April 2013. Gills and digestive glands were dissected and grouped in pools of 3 animals, then resulted in 205 samples of gills and 205 samples of glands. For the molecular detection in tissue samples, DNA was extracted, then a nested-PCR was performed for the detection of genetic material of Cryptosporidium and another for detection of Sarcocystidae in order to amplify fragments of 600 and 290 base pairs, respectively. There was no DNA detection of Cryptosporidium in samples analysed. Genetic material compatible to T. gondii was amplified in 32 (7,8%) oyster tissue samples, and there are significant differences in the presence of positivity at two points of collecting. One of the factors that may be related with this finding is the proximity of these points to a location of soils washing containing feces of animals from farms. With these results we can infer that there is contamination of the aquatic environment and a risk of transmission of oocysts through consumption of oysters produced in these regions, which is an alert to the public health system. / A presen?a de oocistos de protozo?rios patog?nicos nas ?guas costeiras, resultantes da introdu??o de fezes contaminadas de humanos e de animais, tem sido registrada em diferentes regi?es do mundo. Moluscos bivalves como ostras podem filtrar e reter em seus tecidos protozo?rios encistados e assim atuar como potenciais transmissores de formas parasit?rias capazes de provocar doen?as como a criptosporidiose e a toxoplasmose. O objetivo deste trabalho foi detectar contamina??o natural de ostras da esp?cie Crassostrea rhizophorae cultivadas em ?reas de influ?ncia da baia de Todos os Santos por protozo?rios Apicomplexa (Cryptosporidium e Toxoplasma gondii). Um total de 615 ostras foi coletado em cinco pontos de dois munic?pios no per?odo de janeiro a abril de 2013. Br?nquias e gl?ndulas digestivas foram dissecadas e agrupadas em pools de 3 animais, resultando em 205 amostras de br?nquias e 205 amostras de gl?ndulas. Para a detec??o molecular, o DNA das amostras teciduais foi extra?do, em seguida foi realizada uma nested-PCR para a detec??o do material gen?tico do Cryptosporidium e uma outra para detec??o do DNA do Sarcocystidae, afim de amplificar fragmentos de 600 e 290 pares de base, respectivamente. N?o houve detec??o de DNA de Cryptosporidium nas amostras analisadas. Material gen?tico de T. gondii, determinado pela PCR-RFLP, foi amplificado em 32 (7,8%) amostras teciduais de ostras, havendo diferen?a significativa de positividade em dois pontos de coleta. Um dos fatores que pode estar relacionado com esse achado ? a proximidade destes pontos a locais de lichiviamento de solos contendo fezes de animais provenientes de fazendas. Com esses resultados podemos inferir que h? contamina??o do ambiente aqu?tico e um risco de transmiss?o de oocistos atrav?s do consumo das ostras produzidas nestas regi?es, o que ? uma alerta para o sistema de sa?de p?blica.

A crescente urbanização associada à multiplicação do número de cidades e o aumento populacional, especialmente nos países em desenvolvimento, têm favorecido o surgimento e o crescimento desordenado das comunidades com consequente dificuldade de acesso aos serviços básicos, inadequadas condições de moradia e exposição a diversos contaminantes ambientais que contribuem para a baixa qualidade de vida e saúde. As parasitoses intestinais apresentam íntima relação com as condições sanitárias, constituindo um relevante problema de saúde pública com maior prevalência entre indivíduos de baixo nível socioeconômico. A ocorrência e manifestação da sintomatologia decorrente de uma infecção parasitária também se associa, principalmente, com a imaturidade do sistema imunológico em crianças com idade ntre 0 e 6 anos, que têm no ambiente de creches e pré-escolas outro importante fator que pode contribuir para a contaminação. Embora sejam crescentes os relatos de parasitismo intestinal em crianças que frequentam creches, ainda são escassas as pesquisas direcionadas aos pré- escolares da região Sul da Bahia, Brasil. Por essa razão, o objetivo deste estudo foi identificar a prevalência de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia em crianças de 0 a 6 anos que frequentam creches municipais de Itabuna, cidade localizada na região Sul do estado da Bahia. Para atender aos objetivos propostos foram aplicados dois questionários, um as diretoras das creches/pré-escolas, visando realizar o levantamento das condições de saneamento e práticas de higiene alimentar no ambiente escolar e outro aos responsáveis legais das crianças, com o intuito de conhecer as condições individuais e familiares dos participantes. Para pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia foram coletadas três amostras fecais por sujeito da pesquisa, processadas e analisadas pelos métodos de Ziehl- Neelsen adaptado e Mariano & Carvalho, respectivamente. A prevalência de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia foi de 39,10% e 29,49%, respectivamente. A grande maioria das crianças é de famílias de baixa condição social e baixo nível de escolaridade, possuem alta quantidade de moradores por residência (transmissão interpessoal). Estes aspectos constituem fatores facilitadores para a disseminação desses parasitas na população estudada. O hábito de não lavar as mãos com água e sabão também se mostrou um fator facilitador a infecção por Giardia lamblia e Cryptosporidium spp., manter as unhas cortadas e limpas diminui a exposição dos indivíduos a infecção por Giardia lamblia. Diante dos resultados, a investigação das enteroparasitoses, em especial da criptosporidíase e giardíase em pré- escolares de Itabuna, Bahia, Brasil é fundamental, devido o alto índice de positividade dos exames coproparasitológicos. Tal aspecto, aliado à escassez de estudos sobre o tema nessa região, mostra claramente que se trata de um problema de saúde pública e que se tornam necessárias melhorias no planejamento estratégico da aplicação dos recursos financeiros em prol do controle das parasitoses no município / Increasing urbanization linked to the multiplication of the number of cities and population growth, especially in developing countries, have favored the emergence and the uncontrolled growth of communities resulting in poor access to basic services, inadequate housing conditions and exposure to several environmental contaminants that contribute to poor quality of life and health. The Intestinal parasitosis shows a close relationship with sanitary conditions representing an important public health problem with higher prevalence among individuals of low socioeconomic status. The occurrence and presenting of symptoms resulting from a parasitic infection are also mainly associated with the immune system immaturity in children aged between 0 and 6 years, who have in their daycare and kindergarten environment another important determinant that could contribute to contamination. Although the reports about intestinal parasitism in children attending day care centers are increasing, there is still scarse research addressing kindergarten children in Southern Bahia, Brazil. Therefore, the aim of this study was to identify the prevalence of Cryptosporidium spp. and Giardia lamblia in children aged fron 0 to 6 years old who are attended in some of Itabuna\'s daycare centers. Itabuna city is located in the southern area of Bahia state. To meet the objectives proposed two questionnaires were applied , one to the daycare / kindergarten directors, in order to survey the conditions of sanitation and food hygiene practices in the school environment and other to the legal guardians, in order to find out the individual and family conditions of the participants. For the detection of Cryptosporidium spp. and Giardia lamblia three fecal samples were collected for each research subject, processed and analyzed by the Ziehl-Neelsen adapted, and Mariano & Carvalho methods, respectively. The prevalence of Cryptosporidium spp. Giardia lamblia were 39,10% and 29,49%, respectively. The large majority of children come from families of low social status, and educational level, live in enviroment with a high number of residents per household (person transmission). These aspects are factors that facilitate the spreading of these parasites in the studied group. The habit of not washing hands with soap and water was also a facilitating factor to infection by Giardia lamblia and Cryptosporidium spp., keep nails clean and cut decreases the exposure of individuals to infection by Giardia lamblia. Given the results, the investigation of intestinal parasites, especially giardiasis and cryptosporidiosis in the kindergarten schools Itabuna, Bahia, Brazil is critical, because of the high rate of positive results of fecal examinations. This aspect, together with the scarcity of studies on the subject in this region, clearly shows that it is a public health problem and that improvements are required in the strategic planning of the financial resources uses to the control of parasitic diseases in the city

Estudos de revisão sobre surtos associados à transmissão hídrica revelaram que os protozoários parasitas Cryptosporidium parvum e Giardia duodenalis (sinonímia: G. lamblia e G. intestinalis) são os principais responsáveis pelo maior número de casos registrados em todo o mundo. A contaminação das águas superficiais que servem ao abastecimento público por estes protozoários representa risco à saúde humana e animal, pois ambos parasitas apresentam resistência à cloração, processo convencional utilizado para desinfecção em Estações de Tratamento de Água (ETAs).Em vista desta lacuna, o presente estudo propõe identificar espécies e genótipos de Cryptosporidium e Giardia a partir de 128 amostras de águas superficiais de 11 mananciais do estado de São Paulo, de acordo com o Método 1623.1 (USEPA, 2012). Para identificar estes parasitas, foi realizada a recuperação dos (oo) cistos a partir de lâminas raspadas, seguindo o protocolo adaptado da USEPA, em seguida, utilizou-se o PCR em tempo real para identificar os genes 18S rRNA para Cryptosporidium e SSU para Giardia. Os resultados mostraram que a frequência de ocorrência desses protozoários nos pontos de captação foi de 29,7% para Giardia e 30,4% para Cryptosporidium. Os cistos estavam presentes em 10 dos 11 pontos de captação com frequências que variaram de 17 a 100%, e concentrações que variaram de <0,1 (Limite de Detecção=0,1) a 17,7 cistos /L, o que evidenciou a baixa qualidade dessas águas. Os oocistos ocorreram em uma frequência de 17 a 50% nas amostras positivas com concentrações que variaram de <0,1 a 11,5 oocistos/L. O ensaio de PCR em tempo real detectou um total de 81,4% (57/70) de amostras positivas para Cryptosporidium hominis-parvum-meleagridis e 21,4% (15/70) amostras positivas para Giardia duodenalis. A frequência de ocorrência desses agentes patogênicos e as altas concentrações de espécies antrópicas encontradas constituem um cenário de grande preocupação do ponto de vista da saúde pública, considerando-se que amostras foram coletadas dos locais de captação para o abastecimento público de água. / Review studies on waterborne outbreaks have been showing that Cryptosporidium parvum and Giardia duodenalis (synonym: G. lamblia and G. intestinalis) are the primarily responsible for the highest number of the cases recorded worldwide. Contamination of surface waters catchments by these protozoa is a risk factor to human health because both parasites are resistant to chlorination, which is a conventional process used for disinfection in water treatment plants (WTP). The present study aimed to identify species of Cryptosporidium and Giardia recovered from surface water catchment samples from 11 municipalities from the State of São Paulo, totalizing 128 samples. Quantification of both parasites was carried out according to method 1623.1 (USEPA, 2012). In order to identify parasites, the recovering of (oo)cysts from slides followed USEPA´s protocol by scraping slides, then Real Time PCR using the 18S rRNA genes for Cryptosporidium and SSU for Giardia were carried out. Results showed that the frequency of occurrence of these protozoa at the catchment points was 29,7% for Giardia and 30,4% for Cryptosporidium. Cysts were present in 10 of 11 catchments points with frequencies varying from 17 to 100% with concentrations ranging from <0.1 (Limit of Detection=0.1) to 17.7 cysts/L, which put in evidence the low quality of water. Oocysts occurred in a frequency from 17 to 50% in positive samples with concentrations ranging from <0.1 (LD) to 11.5 oocysts/L. The real-time PCR assay detected a total of 81.4% (57/70) of positive samples for Cryptosporidium hominisparvum- meleagridis and 21.4% (15/70) samples positive for Giardia duodenalis. The frequency of occurrence of these pathogens and the high concentrations of anthropic species found is a concerning scenario for human health, considering samples have been collected from catchment sites for public water supply.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-27Bitstream added on 2014-08-13T18:01:34Z : No. of bitstreams: 1 000744257.pdf: 1345587 bytes, checksum: 884d34a74775bc0bdd270eedb4458762 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cryptosporidium serpentis infection is common in reptiles, especially snakes, and is characterized by chronic infection with severe hypertrophic gastritis, which can be lethal. This research aimed to use the real- time polymerase chain reaction (PCR) targeting the heat shock protein gene (Hsp70) for detection of C. serpentis in fecal samples of 503 snakes, and to determine its analytical and epidemiological specificity and sensitivity using, as a gold standard, the nested PCR targeting the 18S rRNA (18S rRNA) gene followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). The real-time PCR was positive for C. serpentis in 17 samples (3.37%), and nPCR/S resulted in positive results for C. serpentis in 15 samples (2.98%). It was also observed that the nPCR/S was positive for Cryptosporidium spp. in 60 samples (11.98%). Sequencing of the fragments amplified by nPCR was possible in 38 samples, and resulted in the identification of Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii and C. serpentis in several species of snakes. The sensitivity and specificity of real-time PCR were, respectively, 93.8% and 99.5%. Although three samples were positive for C. serpentis only by real-time PCR, and were considered as false positive results in the estimation of the epidemiological specificity and sensitivity, the melting curve analysis indicated that these samples had the same melting temperature of the C. serpentis samples. Thus, we conclude that real-time PCR targeting the gene Hsp70 is a sensitive and specific method for the detection of C. serpentis in fecal samples from snakes / FAPESP: 07/54312-2

Resumo:A infecção por Cryptosporidium serpentis é comum em répteis, em particular em serpentes, e é caracterizada por infecção crônica com presença de gastrite hipertrófica grave, que pode ser letal. Esta pesquisa teve como objetivo utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, tendo como alvo o gene da proteína do choque térmico (Hsp70), para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes, e determinar a sua especificidade e sensibilidade analíticas e epidemiológicas utilizando, como padrão ouro, a nested PCR para amplificação de fragmento parcial do gene da subunidade 18S do rRNA (18S rRNA) seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados (nPCR/S). A PCR em tempo real foi positiva para C. serpentis em 17 amostras (3,37%), enquanto a nPCR/S resultou em positividade para C. serpentis em 15 amostras (2,98%). A nPCR/S resultou em positividade para Cryptosporidium spp. em 60 amostras (11,98%). O seqüenciamento dos fragmentos amplificados pela nPCR foi possível em 38 amostras e resultou na identificação de Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii e C. serpentis, em diversas espécies de serpentes. Os valores de sensibilidade e especificidade epidemiológicas da PCR em tempo real foram, respectivamente, 93,8% e 99,5%. Embora três amostras tenham apresentado positividade para C. serpentis apenas pela PCR em tempo real, e foram consideradas como resultado falso positivo na estimativa da especificidade e sensibilidade epidemiológicas, a análise da curva de dissociação indicou que essas amostras apresentaram a mesma temperatura de dissociação que as amostras de C. serpentis. Assim, concluiu-se que a PCR em tempo real, visando ao gene Hsp70 é um método sensível e específico para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes / Abstract:Cryptosporidium serpentis infection is common in reptiles, especially snakes, and is characterized by chronic infection with severe hypertrophic gastritis, which can be lethal. This research aimed to use the real- time polymerase chain reaction (PCR) targeting the heat shock protein gene (Hsp70) for detection of C. serpentis in fecal samples of 503 snakes, and to determine its analytical and epidemiological specificity and sensitivity using, as a gold standard, the nested PCR targeting the 18S rRNA (18S rRNA) gene followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). The real-time PCR was positive for C. serpentis in 17 samples (3.37%), and nPCR/S resulted in positive results for C. serpentis in 15 samples (2.98%). It was also observed that the nPCR/S was positive for Cryptosporidium spp. in 60 samples (11.98%). Sequencing of the fragments amplified by nPCR was possible in 38 samples, and resulted in the identification of Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii and C. serpentis in several species of snakes. The sensitivity and specificity of real-time PCR were, respectively, 93.8% and 99.5%. Although three samples were positive for C. serpentis only by real-time PCR, and were considered as false positive results in the estimation of the epidemiological specificity and sensitivity, the melting curve analysis indicated that these samples had the same melting temperature of the C. serpentis samples. Thus, we conclude that real-time PCR targeting the gene Hsp70 is a sensitive and specific method for the detection of C. serpentis in fecal samples from snakes / Orientador:Marcelo Vanconcelos Meireles / Banca:Alex Akira Nakamura / Banca:Valéria de Sá Jayme / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca:Roberta Lemos Freire / Doutor

Cryptosporidium are protozoan parasites that infect the gastrointestinal epithelium of various vertebrate hosts. The genus has two major phylogenetic groups: a gastric group that infect the epithelium of the stomach and an intestinal group that infect the epithelium of the small and large intestine. Cryptosporidium are transmitted by the faecal-oral route and infect epithelial cells following excystation of the environmental oocyst stage. It has been proposed that excystation of intestinal species is triggered by exposure to the acidic stomach contents, although this has not been verified experimentally. This study aimed to determine whether exposure to stomach contents is necessary for in vivo infection by the intestinal species C. parvum and whether passage through the intestine is necessary for the gastric species C. proliferans to cause infection. It was shown that purified and non-purified oocysts of C. parvum were infectious for SCID mice following surgical inoculation directly into different parts of the small intestine, demonstrating that passage through the stomach is not necessary for infection by this intestinal species. Inoculation of the jejunum resulted in a course of infection similar to oral inoculation. Cryptosporidium proliferans was infectious for na?ve SCID mice following surgical extraction from the stomach of infected SCID mice, demonstrating that passage through the small intestine is not necessary for infection by this gastric species. However, surgical inoculation of C. proliferans oocysts directly into the intestinum tenue did not cause infection.

We investigated the species and genotypes of Cryptosporidium infecting wild rodents from the genus Apodemus in ten areas in the year 2012 in the Czech Republic. A total of 207 faecal samples, 182 samples of Apodemus flavicollis and 25 of Apodemus sylvaticus, were screened for presence of Cryptosporidium spp. using both the aniline-carbol-methyl violet staining method and molecular tools. Microscopy examination revealed the presence of Cryptosporidium spp. oocyst in 24 samples of Apodemus flavicollis and 1 sample of Apodemus sylvaticus. Genomic DNA was isolated from both microscopy positive and negative samples. Using the nested PCR amplifying gene encoding the small ribosomal subunit (SSU rRNA) 25 samples were detected positive for the presence of Cryptosporidium-specific DNA. The same results were obtained also in the nested PCR amplifying gene encoding actin. All microscopy positive samples were also PCR positive. Only 19 samples were successfully sequenced, following phylogeny analyses showed presence of two new genotypes. First genotype is phylogenetically related to Cryptosporidium ubiquitum (1 sample) and the second genotype (consisting of several subgroups) related to C. canis (18 samples). The new genotypes seem to be host specific, however this hypothesis needs to be verified using experimental infection in the future. This is the first report of these Cryptosporidium genotypes in Apodemus spp. and for the first time ever.

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Juliana Peloi Vides / Banca:Heito Flávio Ferrari / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Cáris Maroni Nunes / Resumo: O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. "Nested" PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolate s in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., f ollowed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in d og samples was 10.4% (38/367). The real - time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis . The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis . A higher positivity was observed in pup pie s and kittens when compared to adult animals . The analytical sensitivity of real - time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium . We c oncluded that dogs and cats n of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real - time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs / Doutor