Hepatitis C is a public health crisis in both developing and developed countries. Direct acting antiviral therapies have revolutionized the fight against Hepatitis C, making the worldwide eradication of the disease feasible. However, screening and access to care for vulnerable patients – especially for patients experiencing homelessness – are lacking. Homelessness exacerbates the effects of Hepatitis C, leading to poor health outcomes for individual patients and high costs for health providers and taxpayers. One potential solution is investing in affordable housing and the housing first model that provide the stability needed to address both acute and chronic health conditions, including Hepatitis C. Partnerships between patients and providers facilitated by supportive housing can benefit individual outcomes and decrease the financial and social costs to communities.

The human immunodeficiency virus (HIV)-hepatitis C virus (HCV) coinfection is one of the most common coinfections across the globe. There are over 2 million people living with both HIV and HCV worldwide. In the United States, HIV-HCV coinfections present a huge public health issue. There are several risk factors associated with developing this coinfection. One of the greatest risk factors is injection drug use and the practice of sharing needles. With the advent of the opioid epidemic, the number of people contracting both infections have skyrocketed. Despite the large prevalence rate, people with HIV-HCV coinfections can be treated for both infections. Medical professionals have begun successfully controlling HIV infections through antiretroviral therapies and treatments. These HIV regimens have worked well to increase the cluster of differentiation 4 (CD4) cell counts to manageable levels in many patients. Clinicians have used several different HIV medications that are easily categorized into five separate categories: nucleoside reverse transcriptase inhibitors, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, integrase strand transfer inhibitors, protease inhibitors, and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) antagonists. Of these medications, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors have been commonly used with direct-acting antivirals. Like antiretroviral treatments, these direct-acting antivirals (or HCV regimens) have been largely successful in reducing HCV ribonucleic acid (RNA) levels and effectively “curing” the HCV infection. However, some serious complications occurred in several cases because of drug-drug interactions between antiretroviral and direct-acting antiviral medications. This study was dedicated (1) to exploring the many benefits that these medications have for coinfected patients and (2) to analyzing the significant consequences of these drug-drug interactions. To achieve both goals, a review of various research studies, websites, and textbooks was instigated through PubMed, Google Scholar, and the Boston University library system. The resulting research studies spanned a period from the 1980s to the 2010s. The implications from these sources suggest that more extensive testing of medications, regimens, and drug combinations is needed to allow for a more individualized and simplified HIV-HCV treatment plan for each patient. Additional testing may also lead to more generalizable findings that could be applied to a large swath of the population in the United States.

Background: Decentralization and task-shifting of hepatitis C virus (HCV) infection testing and management from specialty services to primary care is vital to achieve global and Canadian HCV elimination targets since direct-acting antiviral therapy revolutionized HCV management. Primary care providers are instrumental in enabling more accessible and sustainable community-based HCV management. Understanding primary care providers' experiences and beliefs on provision of HCV treatment in primary care is vital to optimize primary care-directed HCV treatment. Purpose: We aimed to use best practices from implementation science to determine the key factors influencing primary care physicians' provision of HCV treatment and to synthesize the published evidence on the barriers and enablers to optimizing primary care-directed HCV treatment to inform future implementation interventions. Method: In Study 1, we conducted theory-informed interviews with family physicians practicing in Ontario, Canada to identify perceived barriers of and enablers to their provision of HCV treatment. The interviews and data analysis were guided by the Theoretical Domains Framework (TDF), which incorporates 33 theories of behaviour change into 14 domains to systematically identify cognitive, affective, social, and environmental influences on health behaviours. In Study 2, we conducted a systematic review of the barriers and facilitators to optimizing primary care-directed HCV treatment using the TDF as the organising framework. We characterized key determinants of primary care-directed HCV treatment by using the theoretical constructs, generating themes, and mapping themes to relevant TDF domains to identify potential targets for future implementation interventions. Results: We conducted semi-structured TDF-based interviews with 20 family physicians and found 'knowledge gap of HCV treatment guidelines', 'time and resource constraint and competing priorities in primary care', and 'clarity of primary care physicians' professional role in HCV treatment cascade' were the key barriers and enablers to provision of HCV treatment in primary care. The systematic review included 20 studies which suggested 'enabling environment', 'primary care capacity', and 'knowledge deficit in HCV treatment guidelines' were the key factors coded to 'Environmental context and resources', 'Social influences', 'Identity and social professional role', and 'Knowledge' as the most relevant TDF domains to influencing the optimization of primary care-directed HCV treatment. Conclusion: Our results provided practical insights into the barriers and enablers to better primary care-based HCV management. Future research will focus on developing implementation strategies to tackle the barriers and fortify the enablers to optimal HCV treatment in primary care.

Einleitung: Laut Schätzungen der WHO sind 150.000.000 Menschen mit einer chronischen Hepatitis C infiziert und 700.000 sterben jährlich an den Folgen der Erkrankung. Die antivirale Therapie der Vergangenheit wurde mittels Interferon alpha und Ribavirin durchgeführt. Diese Therapie war für die Patienten mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen verbunden und führte in vielen Fällen nicht zu einem anhaltenden virologischen Ansprechen (SVR) nach Therapieende. Seit Einführung der Direct Acting Antivirals (DAA) können in der Therapie der chronischen Hepatitis C SVR-Raten von über 90 % erreicht werden. Therapieversagen sind auf Resistance Associated Mutations (RAM) in der NS3-, NS5A- oder NS5B-Region zurückzuführen. Fragestellung: Die Entwicklung einer Methode zur genotypspezifischen Resistenztestung, die neben Forschungsaspekten vor allem auch für den Einsatz in der virologischen Diagnostik geeignet ist, ist Gegenstand dieser Arbeit. Aufgrund der Häufigkeitsverteilung der HCV-Genotypen in Deutschland wurde die Entwicklung einer Resistenztestungsmethode auf die Genotypen 1b, 1a und 3a eingegrenzt. Im Fokus dieser Arbeit standen die NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen. An diesen Regionen greifen die DAAs in den Replikationszyklus ein. Material und Methoden: Zur Durchführung der Resistenztestung wurde sich für die nested- bzw. seminested-PCR entschieden. Nach reverser Transkription der viralen RNA und anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA wurde eine präparative Gelelektrophorese durchgeführt. Spezifische Banden wurden manuell extrahiert, aufbereitet und nach der Sanger-Methode sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Geneious dargestellt und ggf. manuell nachbearbeitet. Mittels geno2pheno-Onlinedatenbank wurden die Sequenzen auf vorhandene Resistenzmutationen gegenüber DAA untersucht. Es wurden 45 archivierte Serumproben der Genotypen 1a, 1b und 3a mit sich unterscheidender Viruslast und Vortherapie ausgewählt, um die Methode unter möglichst realistischen Untersuchungsbedingungen zu testen. Ergebnisse: Es wurden genotyp- und genlocusspezifische Primersequenzen und PCR-Protokolle für die drei viralen Genregionen NS3, NS5A und NS5B entworfen. Eine single-step-PCR war in vielen Fällen zur erfolgreichen Amplifikation nicht ausreichend, aus diesem Grund wurde die Resistenztestung mittels (semi)nested-PCR durchgeführt. Je nach Genotyp und Region konnten 86 – 100 % der Proben erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. Eine anschließend durchgeführte Resistenzanalyse erlaubte die Untersuchung von Trends bezüglich des Zusammenhangs zwischen der Art der Vortherapie und dem Auftreten von Resistenzmutationen. Eine statistische Auswertung war nicht Ziel dieser Arbeit und wurde aufgrund der geringen Probenanzahl nicht durchgeführt. Diskussion: Es gelang in dieser Arbeit ein Protokoll zu entwickeln, welches sich für HCV-Resistenzanalysen mit Einsatz in der klinisch-virologischen Diagnostik der in Deutschland häufigsten Genotypen 1a, 1b und 3a eignet. Erfreulicherweise wird dieses Protokoll zur HCV-Resistenztestung im Institut für Virologie des Universitätsklinikums Leipzig angewandt. Durch die nested-PCR können die Anteile der NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen, die Resistenz-assoziierten Mutationen enthalten, sicher amplifiziert und sequenziert werden. Fehlamplifikationen sind am ehesten aufgrund von Punktmutationen an den Primerbindungsstellen zu erklären. Durch Selektionsdruck, fehlende proof-reading-Mechanismen und die Ungenauigkeit der Replikation durch die RNA-abhängige-RNA-Polymerase ist die Rate an Neumutationen bei HCV hoch. Eine wesentliche Option zur Verbesserung der HCV-Resistenztestung wäre die Entwicklung eines Protokolls, welches universell für alle Genotypen anwendbar ist.:1 Abkürzungsverzeichnis 4 2 Einleitung 5 2.1 Epidemiologie des Hepatitis C Virus (HCV) 5 2.2 Taxonomie und HCV-Genotypen 6 2.3 Genom, Replikation, Eintritt und Freisetzung 7 2.4 Klinische Symptomatik 10 2.5 Diagnostik 11 2.6 Therapie 12 2.6.1 Virologisches Ansprechen während und nach Therapie 12 2.6.2 Interferon: Therapie der Vergangenheit 13 2.6.3 Direct Acting Antiviral Agents 14 2.6.4 Unerwünschte Arzneimittelreaktionen, Arzneimittelinteraktionen und HCC-Risiko 16 2.6.5 DAA Resistenzmutationen 17 2.6.6 Indikationen zur Resistenzanalyse 18 3 Fragestellung 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Geräte und Verbrauchsmittel 20 4.2 Reaktionskits 21 4.3 Reagenzien 21 4.4 Primer 22 4.5 Patienten 22 4.5.1 Proben 22 4.5.2 Ethikvotum 24 4.6 RNA Extraktion aus Serum oder Plasma 25 4.7 RT Reaktion 26 4.8 PCR 27 4.9 Agarosegelelektrophorese 29 4.10 Gelextraktion 31 4.11 Sequenzierung 31 5 Ergebnisse 33 5.1 Primerdesign 33 5.2 Optimierung des PCR Protokolls 36 5.2.1 Optimierung der RT-Reaktion 36 5.2.2 Optimierung der PCR: nested und seminested PCR 37 5.3 Amplifikation der Proben 39 5.4 Sequenzauswertung und Resistenzanalyse 42 5.5 Vorhandene Resistenzmutationen 46 5.5.1 Mutationen sortiert nach Region 46 5.5.2 Mutationen sortiert nach Gruppen 48 6 Diskussion 50 6.1 Einsatz der Methode in der klinischen Diagnostik 50 6.1.1 Erfolgreiche Amplifikation von Therapieresistenzen 50 6.1.2 Auswahl der Nachweismethode 50 6.1.3 Kriterien einer guten diagnostischen Nachweismethode 51 6.1.4 Verbesserungsmöglichkeiten 52 6.1.5 Zeitpunkt des Einsatzes der Hepatitis C Resistenztestung 53 6.2 Probleme und Fehleranalyse 54 6.2.1 Probleme bei der Recherche 54 6.2.2 Gründe für eine erfolglose Amplifikation 54 6.2.3 Primerannealing 55 6.2.4 Genotypen 56 6.3 Prävalenzen von Therapieresistenzen 57 6.4 Ethische Problematik: Hohe Therapiekosten nach Zulassung verhinderten den Zugang zu adäquater DAA-Therapie 59 7 Zusammenfassung 62 8 Literaturverzeichnis 65 9 Tabellenverzeichnis 69 10 Abbildungsverzeichnis 69 11 Anlagen 70 11.1 Resistenzmutationen 70 12 Selbstständigkeitserklärung 73 13 Danksagung 74

Unmanned Aircraft Systems (UAS) face one common challenge when integrating with the existing manned aircraft population in the National Airspace System (NAS). To unlock the full efficiency of UAS, the UAS integrator must comply with an onboard pilot’s requirement to see-and-avoid other aircraft while operating. Commercially available Detect-and-Avoid (DAA) sensor technologies have been developed to attempt to comply with this requirement. UAS integrators must use these sensors to meet or exceed the performance of a human pilot. This thesis covers research done to integrate an array of commercially made DAA sensors with a large Group 3 UAS both in hardware and software that was later flight tested and evaluated for usability. A fast-time simulation is presented using the principles of the National Aeronautics and Space Administration's (NASA) Detect-and-AvoID Alerting Logic for Unmanned Systems (DAIDALUS). Last, open-source tools are presented to assist future integrators in validating their DAA solutions.

Hepatitis C virus (HCV) infection globally affects 130-150 million people. It causes both acute and chronic infections. Due to the severe side effects and low success rates of interferon based treatments, which formed the standard treatment for HCV, the treatment paradigm shifted to direct acting antivirals (DAAs). DAAs have revolutionized the treatment of hepatitis C virus infection. Clinical trials with combinations of DAAs have recorded >90% response with shorter treatment durations and fewer side effects than earlier treatments involving IFN. Outside the controlled setting of a clinical trial, however, response rates with DAA combinations are much lower (<70%). DAAs can fail if HCV accumulates mutations that confer drug resistance. Interestingly, the pre-existence of mutant frequency in the virus appears not to influence treatment outcome. A better predictor for DAA treatment outcome is yet to be unravelled. Surprisingly, individuals who respond poorly to IFN appear to be more likely to fail DAA treatment. IFN is a generic antiviral that improves immune responses and is expected not to have any bearing on DAA treatment outcomes. Why individuals with poor IFN sensitivity fail DAA treatment remains a mystery. In a recent study of the IFN signalling network, HCV has been shown to compromise IFN activity. It induces bistability in the network leading to distinct phenotypic responses of cells to IFN exposure. In particular, individuals who respond poorly to IFN tend to have a higher percentage of cells that are refractory to IFN; these cells allow viral persistence despite IFN exposure. We hypothesized here that in such individuals, greater ongoing replication would allow increased development of resistance and thus lead to the failure of DAAs. We constructed a model of viral dynamics that accounts for the distinct phenotypic responses of cells to IFN, viral replication and mutation, and the development of resistance to DAAs. Our model predicted that although the relative prevalence of pre- existing mutants is unaffected by IFN sensitivity, in agreement with observations, the growth of drug resistant mutants is accelerated in individuals with poor IFN sensitivity. Based on a distribution of IFN sensitivity across individuals, our model accurately described clinical observations of the response rates to different current treatment protocols. With this model, we predict that the common strategy of increasing the genetic barrier by adding more drugs to the combination was not necessary to avert the development of drug resistance. Instead, an optimised increase in DAA dosage alone or DAA+PR or PR dosage depending on the patient’s IFN sensitivity could help achieve success.

Bakgrund: Demenssjukdomar är en av världens största folksjukdomar. Sjukdomen karakteriseras av nedsatt kognition, perceptionssvårigheter och personlighetsförändringar. Samtidigt kan demenssjukdomen medföra sekundära symtom såsom depression och aggression. Dessa symtom kan uppkomma till följd av att individen upplever hot för sin identitet som därmed påverkar individens hälsa negativt. Sedan många hundra år tillbaka i tiden har hundar ansetts ha en positiv effekt på människors hälsa. I samband med att den medicinska vetenskapen fokuserade mer på läkemedlens botande möjlighet hamnade djurens effekt i skuggan. Idag kan hundar användas som behandlingstillägg inom många olika områden och som olika behandlingsformer.  Syfte: Syftet med studien är att belysa hundens betydelse som resurs för att främja god hälsa hos personer med demenssjukdom. Metod: En litteraturöversikt har genomförts i detta examensarbete, där det analyserades 10 vårdvetenskapliga artiklar av kvantitativ forskningsdesign.  Resultat: Resultatet består av fyra kategorier: hundens påverkan på psykisk hälsa, hundens påverkan på beteende, hundens påverkan på kognition och hundens påverkan på fysisk funktion. Minskad depression, aggression, förbättrad social kompetens och kognition kunde påvisas av interventioner med hund. Det har dock inte framkommit att antidepressiva läkemedel reducerades i samband med interventionen. En studie har kunnat påvisa effekten av hundar på fysisk funktion hos personer med demenssjukdom.  Diskussion:Hundar har genom sin närvaro en positiv inverkan på hälsan hos personer med demenssjukdom genom att dämpa symtom som sjukdomen medför. Lite underlag kunde även hittas för att hundar kan positivt påverka den fysiska funktionen genom att uppmuntra personen med demenssjukdom till ökad aktivitet. Dessa djur kan vara den enkla och eleganta resursen som Barker förespråkar för att främja hälsa hos personer med demenssjukdom.

Introduction : L’exposition au virus de l’hépatite C entraîne une infection virale du foie. La plupart des patients infectés sont asymptomatiques (85%). La phase aigüe de l’infection peut passer inaperçue mais le fardeau à long terme de l’infection est lourd, conduisant annuellement dans 1%-4% des cas à un cancer du foie ou nécessitante une greffe hépatique. Au Canada, on diagnostique 11600 cas d’infections par le VHC par année. Avant l'ère des antiviraux à action directe (AAD) et avec les traitements d’interféron, le taux de guérison était à 50%. En outre, il y a eu beaucoup d’effets sur la santé mentale. C’est pour cela que s’ils n’avaient pas de support à la maison on leur refusait le traitement. Les médicaments AAD ont révolutionné le traitement de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Leur taux de guérison de l’ordre de 95%, et moins d’effets secondaires en a fait le traitement de choix dans l’infection par le VHC. Afin de mieux gérer les patients infectés et d’identifier les obstacles à l’élimination de l’infection, nous avons créé et analysé la cascade de soins de l’hépatite C dans un centre extrahospitalier. Méthodes: Nous avons analysé la cascade de soins en hépatite C pour une cohorte de patients suivis dans une clinique spécialisée en VIH/VHC avec au besoin suivi en toxicomanie et traitement à bas seuil (pas de refus de traitement a patients toxicomane). Tous les patients avec test d’anticorps anti-VHC positif de la clinique ont été inclus. Les patients coinfectés avec VIH ont été inclus. Les données démographiques, de laboratoire, de suivi médical et thérapeutiques ont été collectées à l’aide du dossier médical électronique. Les patients avec >=2 visites ont été considérés « pris en charge », la guérison a été mesurée par la réponse virologique soutenue (RVS) trois mois post-traitement. Nous avons calculé l’incidence cumulative de chaque étape de la cascade. Résultats: Entre 2010 et 2018, 1135 patients avec test anti-VHC+ ont consulté à la clinique médicale urbaine du Quartier Latin (cmuQL). 75% étaient des hommes, leur âge médian était de 54 ans, 39% étaient des personnes qui utilisent des drogues par injection, 76% ont été traités pour l’hépatite C. 1100 patients (97%) ont été pris en charge, 966 (85%) ont eu un test d’ARN, 825 (73%) ont reçu un traitement, 772 (68%) ont atteint la fin du traitement, et 703 (62%) ont eu une RVS. Au total, 46 patients (4%) sont décédés dont 21 sont décédés avant d’être traités. 69 patients (6%) ont eu une guérison spontanée et 90 patients ont été réinfectés au moins une fois. Conclusions: Le traitement des patients infectés par le VHC dans une clinique multidisciplinaire avec prise en charge concomitante de la toxicomanie était un succès. Les défis majeurs de la cascade de soins en hépatite C étaient l’initiation du traitement et l’adhérence au suivi après la fin du traitement. / Exposure to the hepatitis C virus leads to viral infection of the liver. Most infected patients are asymptomatic (85%). The acute phase of infection may go unnoticed, but the long-term burden of infection is heavy, leading to 1%-4% per year to liver cancer or requiring liver transplantation. In Canada, 11,600 cases of HCV infection are diagnosed each year. Before the DAA era and at the time of treatment with interferon, the cure rate was around 50%. Also, there were a lot of effects on mental health. Therefore, if the patient didn’t have sufficient family support, they were being refused for treatment. DAAs have revolutionized the treatment of hepatitis C (HCV) infection. Their 95% cure rate and fewer side effects have made them the treatment of choice in HCV infection. To better manage infected patients and identify barriers to infection clearance, we designed and analyzed the hepatitis C care cascade in an out-of-hospital setting. Methods: We analyzed the cascade of hepatitis C care for a cohort of patients followed in a clinic specializing in HIV/HCV with follow-up in substance abuse and low-threshold treatment (treatment offered even if the patient had drug dependence). All patients with positive anti-HCV antibody tests from the clinic were included. HIV positive patients were also entered in the research. Demographic, laboratory, medical follow-up, and therapeutic data were collected using the electronic medical record. Patients with >=2 visits were considered “in care”, and cure was measured by sustained virologic response (SVR) three months post-treatment. We calculated the cumulative impact of each step of the cascade. Results: Between 2010 and 2018, 1135 patients with an anti-HCV+ test consulted at the urban medical clinic in the Latin Quarter. 75% were men, their median age was 54 years, 39% were in the category of people who inject drugs (PWID), and 76% had already been treated. 1100 patients (97%) were taken care of, 966 (85%) had an RNA test, 825 (73%) received treatment and 772 (68%) reached the end of treatment and 703 (62 %) had an SVR. A total of 46 patients (4%) died, of which 21 died before being treated. 69 patients (6%) recovered spontaneously, and 90 patients (8%) were reinfected at least once. Conclusions: Treatment of HCV-infected patients in a multidisciplinary clinic with concurrent addiction management was successful. The major challenges of the hepatitis C cascade of care were treatment initiation and adherence to follow-up after the end of treatment.

Introduction : Le virus de l’hépatite C (VHC), est l’une des premières causes de pathologie hépatique dans le monde. Ce virus à ARN est responsable de l’hépatite C qui aboutit au développement de la cirrhose et du cancer du foie. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, le VHC infecte actuellement plus de 170 millions de personnes dans le monde, soit 3% de la population. L’hépatite C chronique connait toujours en Tunisie un taux de guérison faible pour le génotype 1 car le traitement standard actuellement disponible est la bithérapie interféron pégylé associé à la ribavirine. A l’heure actuelle, le développement de différentes molécules ciblant spécifiquement le VHC, appelées les antiviraux à action directe (AAD), apparait comme une potentielle révolution dans le traitement de l’infection par le VHC.Ces AAD comprennent les inhibiteurs de protéase (IP), les inhibiteurs nucléos(t)idiques (IN) et les inhibiteurs non-nucléosidiques (INN) de la polymérase NS5B ainsi que les inhibiteurs de la protéine NS5A. La quasi-espèce virale est formée d’un mélange complexe de variants viraux parmi lesquels se trouvent des variants associés à des degrés variables à la résistance aux AAD. Ces variants peuvent donc exister naturellement en absence de toute pression médicamenteuse et sont susceptibles d’avoir un impact sur la réponse aux différents traitements par AAD. Notre objectif était de déterminer la prévalence des variants associés à la résistance dans les souches tunisiennes circulantes en préambule à l’introduction deces molécules en Tunisie. Méthodes : L’amplification et le séquençage direct de la protéase NS3, de la polymérase NS5B ainsi que la région NS5A ont été effectuées chez 149 patients tunisiens naïfs de traitement et infectés par le VHC de génotype 1 (génotype 1b = 142 ; génotype 1a = 7). Résultats : Douze séquences NS3 (12/131 ; 9,2%) ont montré des mutations connes pour conférer une résistance aux IP. Une seule séquence (1/95 ; 1,1%) a montré la mutation V321I connue pour conférer une résistance aux IN-NS5B. Trente quatre séquences (34/95 ; 35,8%) ont montré des mutations connues pour diminuer la sensibilité des INN-NS5B. Une seule séquence de génotype 1a (1/7 ; 14,3%) et 17 séquences de génotype 1b (17/112 ; 16,2%) ont montré des mutations connues pour conférer une résistance au inhibiteurs de la protéine NS5A. Conclusions : Notre étude a permis de mettre en évidence la présence de substitutions conférant une diminution de la sensibilité aux AAD chez des patients tunisiens naïfs de tout traitement anti-VHC. Des études in situ seront nécessaires pour évaluer l’impact de ces mutations sur la réponse au traitement. / Introduction: Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver disease worldwide. This RNA virus is responsible for hepatitis C, which leads to the development of cirrhosis and liver cancer. According to the World Health Organization, HCV infects more than 170 million people worldwide, about 3% of the population. Chronic hepatitis C still know in Tunisia low cure rates for genotype 1, because the currently standard treatment available is combination therapy of pegylated interferon plus ribavirin. At present, the development of different molecules that specifically target HCV, called direct-acting antivirals (DAA) appears as a potential revolution in the treatment of HCV infection. These DAA include protease inhibitors (PI), nucleos(t)ide (NI) and non-nucleoside inhibitors (NNI) for NS5B polymerase and NS5A inhibitors. The viral quasispecies is formed by a complex mixture of viral variants including variants associated with variable degrees of resistance to DAA. These variants may therefore exist naturally in absence of drug pressure and may affect response to different treatments by DAA. Our objective was to determine the prevalence of variants associated with resistance in circulating Tunisian strains preamble to the introduction of these molecules in Tunisia. Methods: Amplification and direct sequencing of NS3 protease, NS5B polymerase and NS5A region were performed in 149 Tunisian naïve patients infected with HCV genotype 1 (genotype 1b = 142; genotype 1a = 7) . Results: Twelve sequences NS3 (12/131; 9.2%) showed mutations known to confer resistance to PI. One sequence (1/95; 1.1%) showed the V321I mutation known to confer resistance to NS5B-IN. Thirty four sequences (34/95; 35.8%) showed mutations known to reduce the sensitivity of NS5B-INN. One genotype 1a sequence (1/7; 14.3%) and 17 genotype 1b sequences (17/112; 16.2%) showed mutations known to confer resistance to NS5A inhibitors.Conclusions: Our study highlighted the presence of substitutions conferring decreased susceptibility to DAA in naïve patients infected with HCV genotype 1. Field studies will be needed to evaluate the impact of these mutations on the treatment response.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism.