Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_priscila_marques_moura_de_leon.pdf: 3035474 bytes, checksum: 1dfa2e910533e830f4c6c01d06ca37e6 (MD5) Previous issue date: 2011-11-07 / In equine, the intersections between reproduction and genomics are numerous, however, little known about the genetic factors that acting on fertility. The conclusion of equine genome sequencing project, brings the oportunity to evaluate candidate genes and molecular biomarkers for specific reproductive characteristics. Based on this information, this PhD thesis aimed to develop genomic studies applied to equine reproduction. The first paper analyzed the expression of apoptotic-related genes (Bax, Bcl-2, survivin and p53) in equine cumulus-oocyte complex by qRT-PCR, comparing gene expression between morphologically distinct oocytes and cumulus cells during in vitro maturation. Results showed that survivin mRNA levels were higher (P<0.05) and p53 mRNA levels was lower (P<0.01) in oocytes compared to cumulus cells in morphologically healthy. On the other hand, expression of the Bax was significantly higher in morphologically healthy cumulus cells (P<0.02). The second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The third article has determined the presence of circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) in pregnant mare s plasma, looking to develop a molecular test for the prenatal diagnosis of fetal sex determination using SRY gene amplification by PCR, reamplification by PCR (2nd-PCR) and real-time quantitative PCR (qPCR). This is the first report of ccffDNA in equine species. The molecular sexing test resulted in sensitivity of 72% and accuracy of 85% on the PCR. Using the 2nd-PCR and qPCR we obtained an increasing in the sexing sensitivity results (90.9%) and an accuracy of 95%. This study demonstrates for the first time the fetal sex determination in mares using ccffDNA. This PhD thesis resulted in the publication of three papers in international journals of reproduction and a patent application request. The results presented here collaborate to understand the equine reproductive biology, and indicate potential genetic markers to fertility parameters. / Em equinos, as intersecções entre a reprodução e a genômica são numerosas, no entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que atuam na fertilidade. Com o genoma equino completo, existe a possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a biomarcadores para características reprodutivas específicas. Com base nestas informações, a presente tese teve como objetivo desenvolver estudos de genômica aplicada à reprodução equina. O primeiro artigo analisou a expressão de genes relacionados a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) no complexo cumulus oócito equino através de qRT-PCR, comparando a expressão gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características morfológicas durante a maturação in vitro. Como resultados, foi observada maior expressão do survivin (P<0.05) e menor expressão de p53 (P<0.01) em oócitos comparado a células do cumulus do grupo considerado morfologicamente saudável. Enquanto que a expressão de Bax foi maior (P<0.02) em células do cumulus do grupo saudável comparado ao grupo com características morfológicas não desejáveis. O segundo artigo analisou um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene p53, relacionando-o a parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue Inglês. Foi relatado pela primeira vez um SNP Arginina/Prolina na região do exon 4 do gene p53 equino. A prevalência foi de 73,3% para o genótipo heterozigoto, 17,1% do genótipo Arginina/Arginina e 9,6% do Prolina/Prolina. O genótipo Arginina/Prolina foi associado (P=0.02) a ocorrência de aborto, enquanto que o genótipo Prolina/Prolina foi associado (P<0.05) a menor probabilidade de aborto, indicando um papel da p53 na reprodução equina. O terceiro artigo determinou a presença de DNA fetal livre e circulante (ccffDNA) no plasma de éguas prenhas, desenvolvendo um teste molecular de diagnóstico pré-natal na determinação do sexo fetal através da amplificação do gene SRY pelas técnicas de PCR, de re-amplificação por PCR (2º-PCR) e de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Este é o primeiro relato do DNA fetal livre e circulante em equinos. O teste de sexagem molecular resultou em 72% de sensibilidade e 85% de acurácia na técnica de PCR. Com o 2º-PCR e qPCR a sensibilidade foi de 90,9% e 95% de acurácia. Este estudo demonstra pela primeira vez a determinação do sexo fetal em éguas utilizando o ccffDNA. Os resultados apresentados colaboram para o entendimento da biologia reprodutiva da espécie equina, e indicam marcadores genéticos em potencial para parâmetros de fertilidade. Esta tese resultou na publicação de três artigos em periódicos internacionais da área de Reprodução e um pedido de Patente de Invenção.

O genoma humano é composto por diversos tipos de variações estruturais, como por exemplo, as variações no número de cópias (CNVs), que, mesmo sendo muito pequenas, podem gerar diversas alterações clínicas específicas, como as malformações congênitas e o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (MC/ADNPM). Para a detecção destas alterações existem diferentes técnicas citogenômicas dentre elas a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) e a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), que investigam um número limitado de regiões do genoma, como as regiões envolvidas nas síndromes de microdeleções/microduplicações mais comuns e as regiões subteloméricas. Outros métodos como a cariotipagem clássica e o array genômico possibilitam uma análise completa do DNA em uma única reação, aumentando a taxa de detecção de desequilíbrios complexos. Alcançar um diagnóstico inequívoco é fundamental para entender a natureza da doença, fornecendo respostas sobre o prognóstico, sobre os riscos de recorrência e direcionando o paciente à terapia específica, o que pode minimizar o custo financeiro dessas doenças e até mesmo possibilitar a inclusão desses indivíduos na sociedade. O projeto teve como objetivo comparar a capacidade diagnóstica destas tecnologias (FISH, MLPA e array) para a elucidação etiológica de pacientes sindrômicos encaminhados para a unidade de genética. A casuística deste trabalho foi composta pela análise dos resultados das técnicas de FISH e/ou MLPA e array, utilizadas no diagnóstico de 78 pacientes com MC/ADNPM. Na técnica de FISH, empregada na análise genômica de 22 pacientes, foram utilizadas sondas locus específicas para as regiões das principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas de cromossomos específicos. Por meio desta metodologia, foram identificados ~18,2% dos pacientes com diferentes alterações. Já a técnica de MLPA, utilizada no diagnóstico dos 78 pacientes, por meio dos kits para as principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas, detectou ~34,6% de pacientes com diversas alterações. A técnica de array, realizada em todos os pacientes utilizando diferentes plataformas (Agilent, Affymetrix ou Illumina) apresentou uma taxa de ~42,3% de detecção de pacientes com pelo menos uma alteração patogênica e ~38,5% de pacientes com alterações benignas ou de significado clínico incerto. Ao avaliar as três técnicas concomitantemente foi verificada uma taxa de ~93,6% de concordância, apesar dos resultados não serem iguais em todos os casos e da técnica de MLPA não detectar ~66,2% das alterações em relação ao array. Os resultados obtidos corroboraram com dados da literatura, mas no geral a taxa de detecção foi superior às taxas descritas, o em que em parte pode ser devido ao critério de seleção dos pacientes, sugerindo fortemente que a hipótese clínica adequada é crucial para o sucesso da detecção de alteração. Embora o array seja a ferramenta mais eficiente para o diagnóstico de pacientes com malformações, seu uso como primeiro teste diagnóstico nem sempre é o mais apropriado devido ao seu custo elevado ou sua limitação em detectar inversões e translocações balanceadas. Portanto todas as técnicas estudadas têm suas vantagens e desvantagens, e poderão ser aplicadas em conjunto para que o diagnóstico molecular seja concluído. Dessa forma, são necessárias uma interação clínico-laboratorial e uma equipe técnica multiprofissional especializada para o direcionamento do diagnóstico molecular mais eficaz em relação ao custo-benefício / The human genome is composed of several types of structural variations, such as copy number variation (CNVs) which, although very small, can generate several specific clinical abnormalities, such as congenital malformations and developmental delay (CM/DD). To detect these changes there are different cytogenomics techniques, among them, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) that can investigate a limited number of genomic regions for example the most common microdeletion/microduplications syndromes and subtelomeric regions. Other methods such as classical karyotyping and array provide a complete DNA analysis in a single reaction, increasing the detection rate of complex imbalances. Acquire an unequivocal diagnosis is critical to understand the nature of the disease, providing answers about the prognosis, risks of recurrence and directing the patients to specific therapy, which can minimize the cost of these diseases and even allow the inclusion of these individuals in society. The objective of this project was to compare the diagnostic ability of these technologies (FISH, MLPA and array) for the etiologic diagnosis of syndromic patients referred to the clinical unit of genetics. The casuistry was composed by the results of analysis of 78 patients with CM/DD using FISH and/or MLPA and array. The FISH technique was utilized in genomic analysis for 22 patients and locus specific probes were used for regions of the microdeletion/microduplication syndromes and the subtelomeric regions of specific chromosomes. By this methodology ~18.2% of the patients were identified with different genomic changes. The MLPA technique was used in the diagnosis of 78 patients, with microdeletion/microduplication syndrome and subtelomeric regions, and detected ~34.6% of patients with several changes. The array technique was performed in all patients using different platforms (Agilent, Illumina or Affymetrix) and shows a rate of ~42.3% of detection at least one pathogenic change and ~38.5% of patients with benign or uncertain clinical significance changes. In assessment of the three techniques concomitantly was observed a rate of ~93.6% of concordance, although the results are not the same in all cases and the MLPA technique to detect ~ 66.2% of the changes in relation to the array. The results obtained corroborated with literature data, but the overall detection rate was higher than the rates described in the literature, due in part to the criteria selection of patients. Our results strongly suggesting that appropriate clinical hypothesis is crucial for successful change detection. Although the array is the most efficient tool for the diagnosis of patients with abnormalities, using this test as a first diagnostic approach is not always the most suitable tool because of the high cost or the limitation to detect inversions and balanced translocations. Therefore, all techniques studied have their advantages and disadvantages, and could be applied together for the completed molecular diagnosis. Thus, a clinical laboratory interaction and multidisciplinary skilled technicians is required for targeting the most effective molecular diagnosis in relation to cost-benefit

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.

O genoma humano é composto por diversos tipos de variações estruturais, como por exemplo, as variações no número de cópias (CNVs), que, mesmo sendo muito pequenas, podem gerar diversas alterações clínicas específicas, como as malformações congênitas e o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (MC/ADNPM). Para a detecção destas alterações existem diferentes técnicas citogenômicas dentre elas a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) e a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), que investigam um número limitado de regiões do genoma, como as regiões envolvidas nas síndromes de microdeleções/microduplicações mais comuns e as regiões subteloméricas. Outros métodos como a cariotipagem clássica e o array genômico possibilitam uma análise completa do DNA em uma única reação, aumentando a taxa de detecção de desequilíbrios complexos. Alcançar um diagnóstico inequívoco é fundamental para entender a natureza da doença, fornecendo respostas sobre o prognóstico, sobre os riscos de recorrência e direcionando o paciente à terapia específica, o que pode minimizar o custo financeiro dessas doenças e até mesmo possibilitar a inclusão desses indivíduos na sociedade. O projeto teve como objetivo comparar a capacidade diagnóstica destas tecnologias (FISH, MLPA e array) para a elucidação etiológica de pacientes sindrômicos encaminhados para a unidade de genética. A casuística deste trabalho foi composta pela análise dos resultados das técnicas de FISH e/ou MLPA e array, utilizadas no diagnóstico de 78 pacientes com MC/ADNPM. Na técnica de FISH, empregada na análise genômica de 22 pacientes, foram utilizadas sondas locus específicas para as regiões das principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas de cromossomos específicos. Por meio desta metodologia, foram identificados ~18,2% dos pacientes com diferentes alterações. Já a técnica de MLPA, utilizada no diagnóstico dos 78 pacientes, por meio dos kits para as principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas, detectou ~34,6% de pacientes com diversas alterações. A técnica de array, realizada em todos os pacientes utilizando diferentes plataformas (Agilent, Affymetrix ou Illumina) apresentou uma taxa de ~42,3% de detecção de pacientes com pelo menos uma alteração patogênica e ~38,5% de pacientes com alterações benignas ou de significado clínico incerto. Ao avaliar as três técnicas concomitantemente foi verificada uma taxa de ~93,6% de concordância, apesar dos resultados não serem iguais em todos os casos e da técnica de MLPA não detectar ~66,2% das alterações em relação ao array. Os resultados obtidos corroboraram com dados da literatura, mas no geral a taxa de detecção foi superior às taxas descritas, o em que em parte pode ser devido ao critério de seleção dos pacientes, sugerindo fortemente que a hipótese clínica adequada é crucial para o sucesso da detecção de alteração. Embora o array seja a ferramenta mais eficiente para o diagnóstico de pacientes com malformações, seu uso como primeiro teste diagnóstico nem sempre é o mais apropriado devido ao seu custo elevado ou sua limitação em detectar inversões e translocações balanceadas. Portanto todas as técnicas estudadas têm suas vantagens e desvantagens, e poderão ser aplicadas em conjunto para que o diagnóstico molecular seja concluído. Dessa forma, são necessárias uma interação clínico-laboratorial e uma equipe técnica multiprofissional especializada para o direcionamento do diagnóstico molecular mais eficaz em relação ao custo-benefício / The human genome is composed of several types of structural variations, such as copy number variation (CNVs) which, although very small, can generate several specific clinical abnormalities, such as congenital malformations and developmental delay (CM/DD). To detect these changes there are different cytogenomics techniques, among them, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) that can investigate a limited number of genomic regions for example the most common microdeletion/microduplications syndromes and subtelomeric regions. Other methods such as classical karyotyping and array provide a complete DNA analysis in a single reaction, increasing the detection rate of complex imbalances. Acquire an unequivocal diagnosis is critical to understand the nature of the disease, providing answers about the prognosis, risks of recurrence and directing the patients to specific therapy, which can minimize the cost of these diseases and even allow the inclusion of these individuals in society. The objective of this project was to compare the diagnostic ability of these technologies (FISH, MLPA and array) for the etiologic diagnosis of syndromic patients referred to the clinical unit of genetics. The casuistry was composed by the results of analysis of 78 patients with CM/DD using FISH and/or MLPA and array. The FISH technique was utilized in genomic analysis for 22 patients and locus specific probes were used for regions of the microdeletion/microduplication syndromes and the subtelomeric regions of specific chromosomes. By this methodology ~18.2% of the patients were identified with different genomic changes. The MLPA technique was used in the diagnosis of 78 patients, with microdeletion/microduplication syndrome and subtelomeric regions, and detected ~34.6% of patients with several changes. The array technique was performed in all patients using different platforms (Agilent, Illumina or Affymetrix) and shows a rate of ~42.3% of detection at least one pathogenic change and ~38.5% of patients with benign or uncertain clinical significance changes. In assessment of the three techniques concomitantly was observed a rate of ~93.6% of concordance, although the results are not the same in all cases and the MLPA technique to detect ~ 66.2% of the changes in relation to the array. The results obtained corroborated with literature data, but the overall detection rate was higher than the rates described in the literature, due in part to the criteria selection of patients. Our results strongly suggesting that appropriate clinical hypothesis is crucial for successful change detection. Although the array is the most efficient tool for the diagnosis of patients with abnormalities, using this test as a first diagnostic approach is not always the most suitable tool because of the high cost or the limitation to detect inversions and balanced translocations. Therefore, all techniques studied have their advantages and disadvantages, and could be applied together for the completed molecular diagnosis. Thus, a clinical laboratory interaction and multidisciplinary skilled technicians is required for targeting the most effective molecular diagnosis in relation to cost-benefit

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-16T20:02:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoSorologicaDeteccao.pdf: 2500353 bytes, checksum: fd2fb2f2fcdd6056ea361eaf6b1607a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-18T13:15:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoSorologicaDeteccao.pdf: 2500353 bytes, checksum: fd2fb2f2fcdd6056ea361eaf6b1607a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T13:15:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoSorologicaDeteccao.pdf: 2500353 bytes, checksum: fd2fb2f2fcdd6056ea361eaf6b1607a6 (MD5) Previous issue date: 2006 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human T-lymphotropic virus tipe 1 is recognized as the etiologic agent of tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy (TSP/HAM). A very similar clinical disease has been increasingly associated to HTLV-2, whose pathogenicity still requires further assessments. This transversal, retrospective epidemiological survey aimed to determine the prevalence of HTLV among individuals with neurological disturbances and further evaluate cases of inconclusive serology using molecular biology methods. The present study involved patients inhabitants of Pará State and/or admitted at health institutions of the and who were referred to the Virology Section of Instituto Evandro Chagas (IEC) by local doctors between January of 1996 and December 2005, to search for the presence of HTLV-1/2 serum antibodies. Of these patients 353 were selected, with age between 9 months and 79 years, who presented at least one signal or symptom of the Marsh’s Complex (1996), as well as had HTLV-1/2 positive serology at screening and confirmatory ELISA. The overall prevalence of HTLV antibodies by ELISA as 8,8% (31/353), with rates of 10,6% (19/179) and 6,9% (12/174) for female and male patients, respectively. Among HTLV-1/2 the 31 ELISA-positive patients it was noted that 15 (48.4%) of 31 had paresis (n = 8), parestesis (n = 5), and paraplegia (n = 3). Of these 31 HTLV ELISA positive patients, 25 could be submitted to WB for assessment of viral types, which were distributed as follow: 80% (20/25) were HTLV-1, 12% (3/25) were HTLV-2, one case was of HTLV-1+HTLV-2 infection (4%), and serum from one patient yielded an indeterminate profile (4%). Only 14 of these 25 patients could be re-localised for collection of an additional sample for molecular analysis. It was observed that 78.6% of samples typed by WB had the proviral TAX region successfully amplified by nested-PCR. In addition, types were confirmed as based on results obtained from the amplification of the POL region using real-time PCR; this denoted good specificity and sensitivity of the WB used in this study. The sample defined as HTLV-1+HTLV-2 infection by WB was amplified in its TAX region but real time PCR confirmed HTLV-1 infection only. The patient with WB indeterminate profile and one of samples typed as HTLV-2 by WB were amplified by nested-PCR but the real time PCR was negative for HTLV-1 and HTLV-2 in both samples. One patient presenting clinical manifestations of crural myalgia and parestesia with duration of about 7 years reacted HTLV-2-positive by both WB and real-time PCR, a denoting a clear HTLV-2- related chronic myelopathy. This study has identified a case of possible vertical transmission in two distinct situations: a patient whose mother presented antibodies for HTLV-1 by WB and two sisters who reacted HTLV-1-positive by WB and real-time PCR. Although of epidemiological relevance, results from this study warrant further and broader analyses concerning the molecular epidemiology of HTLV types and subtypes HTLV. In addition, a more complete clinical assessment of neurological symptoms should be further performed, in order to better characterise cases of HTLV-related chronic myelopathy in our region. / O vírus linfotrópico de células de T humanas tipo 1 (HTLV-1) é reconhecido como agente etiológico da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH). Quadro clínico muito similar a este vem sendo crescentemente associado ao HTLV-2, cuja patogenicidade ainda requer maiores esclarecimentos. Este inquérito epidemiológico transversal objetivou determinar a prevalência do HTLV entre indivíduos com distúrbios neurológicos e esclarecer, por métodos de biologia molecular, os casos de sorologia inconclusiva. O presente estudo envolveu pacientes residentes no Estado do Pará e/ou internados em instituições de saúde esse Estado, e que tenham sido encaminhados à Seção de Virologia (SEVIR) do Instituto Evandro Chagas (IEC) por médicos locais, entre janeiro de 1996 e dezembro 2005, com vistas à pesquisa de anticorpos específicos para HTLV-1/2. Dessa população foram selecionados 353 pacientes, com idades entre 9 meses e 79 anos, que apresentassem pelo menos um sinal ou sintoma do Complexo de Marsh(1996), bem como sorologia positiva para os testes de triagem e confirmatório de EIE específico para HTLV-1/2. A prevalência geral de anticorpos específicos para HTLV por EIE foi de 8,8% (31/353), com taxas de 10,6% (19/179) e 6,9% (12/174) nos sexos feminino e masculino, respectivamente. Entre os pacientes positivos para HTLV-1/2 por EIE, verificou-se que, tomadas em conjunto, as manifestações de paresia (n = 8), parestesia (n = 5) e paraplegia (n = 3) ocorreram em 48,4% (15/31) dos casos. Dos 31 pacientes positivos para HTLV por EIE, 25 puderam ser submetidos ao WB para definição do tipo viral, encontrando: 80% (20/25) de HTLV- 1, 12% (3/25), HTLV-2, uma infecção mista (4%) e um perfil indeterminado (4%). Destes 25 indivíduos, apenas 14 puderam ser re-localizados para coleta de nova amostra visando-s à análise molecular. Verificou-se que 78,6% das amostras tipadas por WB revelaram amplificação da região TAX pró-viral pela nested-PCR e foram confirmadas quanto à tipagem pela pesquisa da região POL por PCR em tempo real, denotando especificidade e sensibilidade satisfatórias do método de WB empregado no estudo. A amostra definida como infecção mista por WB foi amplificada para região TAX, porém a PCR em tempo real confirmou infecção apenas pelo HTLV-1. O paciente com perfil indeterminado e uma das amostras tipadas como HTLV-2 por WB foram amplificadas pela nested-PCR, porém a PCR em tempo real não detectou genoma pró-viral de HTLV-1, nem do -2 em quaisquer das duas amostras. Uma paciente, portadora de quadro de mialgia e parestesia crural com duração de aproximadamente 7 anos se apresentou positiva para HTLV-2 por WB e PCR em tempo real, caracterizando um quadro compatível com mielopatia associada a esse tipo. Registraram-se indícios de transmissão vertical em dois casos distintos: um paciente cuja mãe apresentou anticorpos para HTLV-1 por WB e duas irmãs com diagnóstico de HTLV-1 por WB e PCR em tempo real. Os resultados deste trabalho evidenciam a necessidade de análises mais profundas acerca da epidemiologia molecular dos tipos e subtipos do HTLV, bem como avaliações clínicas mais rigorosas do ponto de vista neurológico, visando a melhor caracterizar a associação do vírus à condição mórbida designada mielopatia crônica.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura são os helmintos intestinais de maior prevalência na população mundial e também no material arqueológico. Porém, na América do Sul pré-colombiana, o encontro de ovos de A. lumbricoides é raro. Recentemente um estudo de diagnóstico paleoparasitológico molecular apontou para um sub-diagnóstico de Ascaris sp. na América do Sul. No registro arqueológico de parasitos intestinais predominam achados de ovos de Trichuris sp. ao invés de Ascaris sp. Isto parece contraditório, em virtude do número de ovos eliminados por cada parasito. Os objetivos desta pesquisa foram: avaliar marcadores moleculares para o diagnóstico de Ascaris sp. e Trichuris sp. em material moderno pela caracterização molecular destes parasitos; caracterizar geneticamente isolados de sítios arqueológicos sul americanos para verificar a real paleodistribuição destes parasitos em uma perspectiva paleoepidemiológica e compará-la com a epidemiologia moderna destas infecções; avaliar os fatores envolvidos na paleodistribuição encontrada. As amostras foram submetidas ao diagnóstico por microscopia óptica, seguida da extração do DNA, PCR e sequenciamento nucleotídico. Na avaliação dos marcadores moleculares, a região ITS1 de Ascaris sp. apresentou variação intra-indivíduo, o que descartou seu uso com fins taxonômicos e diagnósticos. A caracterização molecular dos genes mitocondriais cox1 e nad1 de Ascaris sp. mostrou infecção cruzada de genótipos entre as espécies humana e suína, o que denota a necessidade de monitoramento das populações avaliadas assim como de outras regiões brasileiras para que a infecção não venha a se tornar uma zoonose em potencial no Brasil. Foi possível o diagnóstico molecular de Trichuris sp. pelo gene ribossomal 18S DNA. A análise paleogenética mostrou que há subdiagnóstico para ambas as infecções na América do Sul pré-colombiana. Este é o primeiro diagnóstico paleoparasitológico molecular de T. trichiura em material sul americano. Estes são também os primeiros registros de recuperação de DNA de parasitos intestinais em material de sítio arqueológico do tipo “sambaqui” e também do período colonial brasileiro. Comparando-se a paleoepidemiologia molecular de Ascaris sp. com a epidemiologia molecular moderna foi possível notar que há haplótipos antigos que ainda estão presentes hoje, no entanto a maioria dos haplótipos é característica ao material arqueológico. Observou-se que há haplótipos comuns ao Velho e Novo Mundo, contudo, há também especificidades regionais. Os resultados da análise genética claramente apontam para uma pobre preservação dos ovos no material arqueológico, principalmente de Ascaris sp. Os fatores principais envolvidos nessa paleodistribuição, seriam fatores tafonômicos que proporcionaram a quebra maior de ovos de Ascaris sp. do que de Trichuris sp., e evidências de consumo de plantas vermífugas pelos povos pré-históricos, as quais teriam maior ação sobre Ascaris sp. do que Trichuris sp. / Ascaris lumbricoides and Trichuris trichiura are the intestinal helminths with higher prevalence in the world today as it was in the past. However, in pre-Columbian South America the findings of A. lumbricoides eggs are rare. Recently a study of paleoparasitological molecular diagnosis showed a sub-diagnosis of Ascaris sp. in South America. In the archeological material, eggs of Trichuris sp. are more common compared with Ascaris sp. eggs. This is contradictory taking into account the number of eggs eliminated by each parasite. The aims of this research was: to evaluate molecular markers for Ascaris sp. and Trichuris sp. diagnosis in modern material; genetic characterization of the samples South American archeological sites aiming the paleodistribution of these parasites in a paleoepidemiological perspective; compare results with the modern epidemiology of these infections; evaluate the factors involved in paleodistribution. Extraction of DNA, PCR and nucleotide sequencing were performed after microscopy. In the evaluation of the molecular markers Ascaris sp. ITS1 region showed intra-individual variation. Therefore, this region to taxonomical and diagnoses studies was discarded. With the molecular characterization of Ascaris sp. cox1 and nad1 mitochondrial genes it was possible to identify cross infection of genotypes between human and pig hosts. Results showed that surveillance field works in modern populations are necessary to verify the zoonotic potential of this infection in Brazil. The molecular diagnosis of Trichuris sp. by ribossomal 18S DNA gene was possible. The paleogenetic analysis showed that there is subdiagnosis for both infections in pre-Columbian South America. This is the first paleoparasitological molecular record of T. trichiura in South American samples. These are also the first recovery of DNA of intestinal parasites in "sambaqui" archeological site, and also of the Brazilian colonial period. Molecular paleoepidemiology of Ascaris sp. infection compared with modern molecular epidemiology showed that there are ancient haplotypes still present today. However, most of the haplotypes are characteristic of the archaeological material. It was observed that there are common haplotypes both to the Old World and to the New World, but showing regional specificities. The results of the genetic analysis clearly pointed to a poor preservation of eggs in archeological material, mainly of Ascaris sp. Taphonomy may be the main factor involved in paleodistribution, breaking more eggs of Ascaris sp. than Trichuris sp. Evidences of consumption of vermifuge plants by prehistoric groups should also have influence, as some plants should have more efficacy eliminating Ascaris sp. than Trichuris sp.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.