Introdução: A AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) é caracterizada por uma disfunção grave no sistema imunológico causada por uma infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus). A quantificação da viremia (carga viral) é uma ferramenta muito útil no monitoramento dos pacientes infectados pelo HIV, sendo um marcador de progressão da doença e eficácia do tratamento. A estimativa incorreta da carga viral pode levar à decisão terapêutica equivocada, portanto métodos acurados de quantificação se fazem necessários. Diversas técnicas comerciais estão disponíveis para a quantificação da carga viral do HIV-1: a maioria destas se baseiam na detecção de ácidos nucléicos e outras na detecção de enzimas e antígenos. O grau de automação varia nas diferentes técnicas assim como os procedimentos de isolamento, amplificação e detecção. A correlação e a concordância entre estas técnicas têm sido estudadas e há relatos de discordância entre os valores de carga viral produzidos por diferentes métodos. O conhecimento sobre o efeito das variações entre as técnicas se faz necessário para assegurar a interpretação adequada dos resultados. A interpretação dos resultados correta é particularmente importante quando estes estão próximos a pontos de corte utilizados para definições de rebote viral e falha virológica. Objetivos: O objetivo deste estudo é comparar as técnicas de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0) para quantificação do HIV-1. Métodos: 1000 amostras recebidas no HIV/GUM Research Laboratory do Chelsea and Westminster Hospital para quantificação da carga viral do HIV-1 durante os meses de Dezembro de 2009 e Janeiro de 2010 foram testadas pelos métodos de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Resultados: Uma superquantificação sistemática foi observada nos resultados testados por PCR. Esta superquantificação ficou evidente nos resultados entre 50 e 250 cópias. Uma concordância elevada foi observada na análise dos pontos de corte de 500 e 1000 copias/mL. Uma correlação linear forte foi observada entre estas técnicas na análise das amostras que obtiveram resultados dentro do limite comum de detecção de ambas as técnicas, porém o nível de concordância foi insatisfatório. Conclusão: A superquantificação observada nos resultados obtidos pelo Cobas AmpliPrep TaqMan HIV- 1 v2.0 em relação ao bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 é provavelmente o resultado de uma sensibilidade aumentada desta técnica. Nós recomendamos cautela quando resultados de duas metodologias diferentes são comparados, especialmente quando se comparam metodologias convencionais com aquelas baseadas em PCR em tempo real. / Introduction: AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is characterised by a severe immune dysfunction caused by the HIV (Human Immunodeficiency Virus). The HIV viral load quantification is an essential tool to monitor HIV-infected patients. The HIV quantification is a disease progression marker and it is a key indicator in treatment efficacy. Inaccurate viral RNA values may subsequently lead to inappropriate treatment decisions hence accurate quantification methods are necessary. Several different methodologies are available to quantify the HIV viral load: a number of them are based on nucleic acid detection and others in detection of enzymes and antigens. Automation is also variable among these methods in addition to differences in isolation, amplification and detection. Several studies have been carried out to evaluate their correlation and agreement and some have evidenced discordant viral load values assessed by different assays. The knowledge about these differences should be taken in to account when analysing viral load results, particularly when low-level viraemia is concerned or those close to endpoints employed for definition of virological failure. Objectives: In this study, two methods to quantify viral load are evaluated: one is based on real-time PCR (AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) and the other is based on branched-DNA technology (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Methods: 1000 plasma samples received at the HIV/GUM Research Laboratory within Chelsea and Westminster Hospital for HIV-1 viral load quantification between December 2009 and January 2010 were tested by both Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 and Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 methods. Results: Results obtained show that Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 PCR systematically overquantifies the viral loads results when compared to bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0. Conclusion: The overquantification by Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 over bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 is likely to be a result of its increased sensitivity. We recommend caution when comparing results from different methodologies, especially when a conventional assay and a real-time PCR assay are concerned.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pacientes transplantados de órgãos sólidos apresentam alto risco para infecção da corrente sanguínea. A instituição da terapia antimicrobiana apropriada guiada por um diagnóstico rápido e preciso das infecções da corrente sangüínea está relacionada a um resultado satisfatório. O objetivo deste estudo foi a detecção de bactérias Grampositivas e Gram-negativas em hemocultura automatizada (Bactec®, Becton Dickinson), com a utilização do multiplex para reação da polimerase em cadeia (PCR) em Tempo Real e detecção de genes de resistência. Métodos: Um total de 185 hemoculturas, 126 positivas e 59 negativas, foram obtidos de 117 pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos, dois centros de transplante na cidade de São Paulo, Brasil, Hospital São Paulo e Hospital do Rim e Hipertensão. DNA das culturas de sangue foi extraído pelo método fenol clorofórmio (Brazol®, LGC, Brasil). A detecção do DNA bacteriano foi realizada utilizando iniciadores universais do gene 16S rRNA. A diferenciação entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi feito por hibridização com sondas específicas por multiplex TaqMan em Tempo Real. Os genes de resistência: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB e mecA foram detectadas utilizando iniciadores específicos, em Tempo Real sitema SYBR Green. A adequação do tratamento antimicrobiano foi avaliada pela revisão do prontuário dos pacientes. Resultados: Cinqüenta e nove amostras foram positivas para bactérias Gram-positivas e sessenta e sete amostras foram positivas para bactérias Gram-negativas. Todas as amostras (100%) foram concordantes entre hemocultura e PCR. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene mecA, cinco para o gene blaCTX-M, uma para o gene blaKPC, uma para o gene blaSHV e uma para blaTEM. Oitenta e oito foram negativas para todos os genes. A detecção de genes de resistência a antimicrobianos favoreceria a adequação da antibioticoterapia, particularmente no descalonamento no tratamento de bacteremias causadas por bactérias Gram positivas e na adequação precoce no tratamento de bacteremias por bacilos Gram negativas multiresistentes em pacienetes tranplantados de órgãos sólidos. Conclusão: A PCR multiplex “in house” para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos por PCR em Tempo Real poderia ser útil para o diagnóstico rápido da infecção da corrente sangüínea em pacientes submetidos a transplante de órgão sólidos. / Solid organ transplanted patients are at high risk for blood stream infection. The institution of appropriate antimicrobial therapy guided by a rapid and accurate microbiological diagnosis of blood stream infections is related to a successful outcome. The aim of this study was the detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria from automated blood cultures (Bactec®, Becton Dickinson) with the use of the multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) and detection of antimicrobial resistance genes. Methods: A total of 185 blood cultures, 126 positive and 59 negative, were obtained of 117 patients submitted to solid organ transplant at two transplant centers in the city of São Paulo, Brazil, Hospital São Paulo and Hospital do Rim e Hipertensão. DNA from the blood cultures was extracted by phenol chloroform method (Brazol®, LGC, Brazil). The detection of bacterial DNA was performed using universal primers of 16S rRNA gene. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative bacteria was done by hybridization with Gram-specific probes by multiplex real-time TaqMan. The resistance genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB and mecA were detected using specific primers by real-time SYBR Green. The adequacy of antimicrobial treatment was evaluated by reviewing the records of patients. Results: Fifty nine samples were positive for Grampositive and sixty seven samples were positive for Gram-negative. All samples (100%) were concordant between blood culture and PCR. Thirty two samples were positive for mecA gene, five for blaCTX-M gene, one for blaKPC gene, one for blaSHV gene and one for blaTEM. Eighty eight were negative for all genes. The detection of antimicrobial resistance genes could enhance the appropriateness of antibiotic therapy, particularly in descalation the treatment of bacteremia caused by Gram positive and early adequacy in the treatment of Gram negative bacteremia of solid organ transplanted patients. Conclusion: The in house multiplex PCR for Grampositive/ Gram-negative bacteria and detection of antimicrobial resistance genes by Real Time PCR could be useful for rapid diagnosis of bloodstream infection in patients undergoing solid organ transplant. / FAPESP: 2008/04761-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:04:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 23.pdf: 6208595 bytes, checksum: 560226dd418c8b7cdf79aa7955f3ab5c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / A detecção precoce das leishmanioses e a rápida instituição do tratamento são de suma importância para os indivíduos e comunidades afetadas, visto que pacientes contribuem para a manutenção do ciclo da doença. Diante das limitações apresentadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico, a PCR tem se apresentado como ferramenta promissora para a detecção dos casos. No entanto, perdas de DNA durante o processo de purificação podem afetar mais significativamente o material genético dos parasitos, gerando resultados falso-negativos. Este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar dois protocolos de triplex PCR para investigar possíveis causas de negatividade no diagnóstico molecular das formas visceral (LV) e tegumentar (LT) das leishmanioses. Pares de primers para detecção de um controle interno (gene G3PD) e dois controles externos (DNA genômico de M. pachydermatis e plasmídeo comercial pUC18 foram adaptados a protocolos de PCR convencionais validados para a detecção de L. infantum e L.(V.) braziliensis e duas reações triplex foram otimizadas. Dados de sensibilidade (S), especificidade (E) e eficiência (e) dos novos sistemas foram calculados em 186 amostras de sangue coletadas de cães em áreas endêmicas, utilizando como referência protocolos de PCR e PCR em tempo real (qPCR) consagrados na literatura / A concordância entre os novos testes e os testes de referência foi determinada pelo cálculo do índice de Kappa. A tríplex PCR para o diagnóstico da LV mostrou S = 78.68 por cento, E= 85.29 por cento e e= 81.05 por cento com boa concordância (K = 0.60, p < 0.0001) com o conjunto de resultados PCR/qPCR. Para o diagnóstico da LT observou-se S = 97.29 por cento, E = 79.16 por cento, e = 90.16 por cento, com K = 0.78, (p < 0.0001) indicando excelente nível de concordância entre os testes. As novas ferramentas apresentadas podem ser aplicadas para aumentar a acurácia no diagnóstico das leishmanioses, contribuindo para a rápida implementação do tratamento e, reduzindo a longo prazo os índices de mortalidade e morbidade das leishmanioses

Made available in DSpace on 2016-03-08T14:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 daniela_pereira_ioc_dout_2010.pdf: 4935523 bytes, checksum: a1a6007d45d89b72eecfd82e24256149 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente estudo, a metodologia de PCR multiplex seguida de hibridização não radioativa direcionada para a região conservada dos minicículos do kDNA (gênero Leishmania) e para o gene constitutivo cacophony de flebotomíneo (gênero Lutzomyia) foi inicialmente empregada para a avaliação da taxa de infecção natural em flebotomíneos provenientes de diferentes áreas endêmicas de LT e LV do Brasil, as quais apresentam diferentes graus de endemicidade e transmissão para uma ou outra forma da doença. Para a determinação do índice de infecção natural, considerou-se o mínimo de 1 (um) inseto infectado em cada pool positivo. Em Saquarema, foram constituídos polls de Lu. Intermédia (13\2642 / 30\2640) e Lu. Migonei (0\2642 / 3\2640), sendo que nehum grupo de fêmea foi positivo para infecção por Leishmania spp. O mesmo ocorreu em Além Paraíba e Rio Bonito, onde foram coletados exemplares apenas de Lu. Intermédia, totalizando a formação de pools consistindo de 11\2642 / 30\2640 e 8\2642 / 27\2640, respectivamente. No município do Rio de Janeiro foram constituídos polls de Lu. intermedia (27\2642 / 32\2640 ), onde 5/32 (15,6%) grupos de fêmeas forampositivos (dois da localidade Pau da Fome e três de Colônia Juliano Moreira), e Lu. Migonei (8\2642 / 5\2640) com 3/5 (60%) polls de fêmeas positivos (um de Colônia Jmoreira e 2 de Pau da Fome). Os ensaios de hibridização confirmaminfecção por L. (V.) braziliensis nos 8/37 pools positivos, indicando un índice mínimo de infecção natural de cerca de 2% nos flebótomos avaliados. Em Porto Alegre também foram obtidos resultados positivos para infecção por L. (V.) braziliensis em 3/98 (3,1%) grupos de fêmeas de Lu. Neivai e 2/52 correspondentes à Lu. Fischerii (3,8%), representando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 0,3% para as duas espécies de flebótomos. Não foram obtidos resultados positivos para os pools de fêmeas de Lu. Migonei (n=28) e Lu. Lanei (n=2) coletados na região. Os resultados de Porto Alegre permitiram confirmar estudos prévios que sugeriram Lu. Neivai como principal vetor de LTA no municipio. Em Corumbá foram formados polls para as espécies Lu. Cruzi (12\2642 / 13\2640) e Lu. Foratinii (6\2642 / 14\2640). Nesse município identificamos infecção por L. Infantum chagasi em 2/13 (15,4%) amostras de fêmeas de Lu. Cruzi e em 1/14 (7,1%) de Lu. Forattinii, representando um índice total de infecção natural de 1,1% (3/27). Os dados obtidos em Corumbá reafirmaram a importância de Lu. Cruzi como principal espécie vetora de LV no município, além de sugerir o papel de Lu. Forattinii como segunda espécie transmissora da doença nesta região. Visando o estudo da estimativa da carga parasitária nos pools de fêmeas que foram positivos pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização, padronizamos a metodologia de PRC em tempo real, utilizando o sistema de detecção SYBR Green (para os dois alvos separadamente \2013 cacophony e kDNA), o qual nos permitiu detectar, quantificar e também diferenciar os parasitos no nível de subgênero, através da curva de dissociação dos produtos amplificados dos kDNA. Em relação às amostras provenientes de Corumbá, os polls positivosapresentaram uma quantificação de cerca de 100 parasitos/pool (2 de Lu. Cruzi e 1 de Lu. Foratinii). Além desses, dois novos polls de Lu. Foratinii foram positivos, com cerca de 10 e 1 parasitos cada. Em Porto Alegra, dos 5 pools positivos pela PCR multiplex, 3 foram quantificados com cerca de 100 parasitos (2 Lu. Neivai e 1 Lu fischerii), os outros 2 apresentaram uma média de 10 parasitos (1 lu. Neivai e 1 Lu. Fischeri). As amostras coletadas no Rio de Janeiro apresentaram uma quantidade média de 10 parasitos cada (4 de Lu. Intermedia e 3 de Lu. Migonei), sendo que um polls de Lu. Intermedia positivo pelo diagnóstico qualitativo não pôde ser avaliado quantitativamente. A análise das curvas de dissociação para a determinação dos valores de Tm dos produtos amplificados do kDNA de promastigotas de L. (V.) braziliensis e L. (L.)chagasi, corroboraram os resultados prévios de diagnóstico pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização. Investigações diagnósticasque possibilitem a detecção, correta identificação e quantificação de carga parasitária por Leishmania spp na fauna flebotomínea em áreas com notificações de LTA e/ou LVA em humanos ou reservatórios animais, certamente contribuem para uma maior visão do quadro de veiculação das espécies de parasitos nas distintas áreas, fornecendo dados importantes para a compreensão da eco-epidemiologia dessas doenças nas respectivas áreas / In this study, t he multiplex PCR methodology was initially established with the purpose of assessing the natural infection rate in sand flies from different endemic areas of CL and VL in Brazil, which consist of various degrees of endemicity and transmission to all the fo rms of the disease. It is followed by non - radioactive hybridization, focused on the conserved area of kDNA minicircle ( Leishmania ) and the constitutive gene cacophony of sand fly ( Lutzomyia genus ). To determine the rate of natural infection, it was conside red a minimum of one (1) infected insect to each positive pool. In Saquarema, pools of Lu. intermedia (13 ♂ / 30 ♀) and Lu. migonei (0 ♂ / ♀ 3) were identified and no female groups were positive for infection with Leishmania spp. It also occurred in Além Paraíba and Rio Bonito, where there were only collected specimens of Lu. intermedia , leading to the es tablishment of pools, comprising of 11 ♂ / 30 ♀ and 8 ♂ / 27 ♀, respectively. In the district of Rio de Janeiro there were pools of Lu. intermedia (27 ♂ / 32 ♀), in which 5 / 32 (15.6%) females groups were positive (two from Pau da Fome and three from Colo nia Juliano Moreira), as well as 3 / 5 (60%) positive females pools of Lu. migonei (8 ♂ / ♀ 5) (one of them from Colonia Juliano Moreira and the other two from Pau da Fome). Hybridization tests have confirmed the infection by L. (V.) braziliensis in 8 / 37 of the positive pools, indicating a minimum rate of natural infection of approximately 2% of the evaluated sand flies. In Porto Alegre, positive results were also obtained for infection by L. (V.) braziliensis in 3 / 98 (3.1%) females groups of Lu. neivai and 2 / 52 corresponding to Lu. fischerii (3.8%), representing a minimum rate of natural infection of approximately 0.3% for the two species of sand flies. No positive results were obtained for females pools of Lu. migonei (n = 28) and Lu. lanei (n = 2) w hich were collected in the area. The results from Porto Alegre helped to confirm previous studies suggesting Lu.neivai as the district’s main vector of leishmaniasis. In Corumbá, there were obtained pools for the species Lu. cruzi (12 ♂ / 13 ♀) and Lu. for atinii (6 ♂ / 14 ♀). We identified an infection by L. infantum chagasi in 2 / 13 (15.4%) samples from females of Lu. cruzi and 1 / 14 (7.1%) females of Lu. foratinii , representing a total rate of natural infection of 1.1% (3 / 27). The obtained data in Cor umbá reassured the importance of Lu. cruzi as the district’s VL main vector species and also suggested the role of Lu. forattinii as the second disease transmitter species in this area. Aiming at the estimate study of parasite load in positive females poo ls, according to multiplex PCR - hybridization, we standardized the real - time PCR methodology, using SYBR Green detection system (for both targets individually - cacophony and kDNA), which allowed us to detect, quantify and differentiate the level of parasit es in the subgenus by means of kDNA amplified products dissociation curve. Regarding Corumbá’s samples, the positive pools showed an amount of approximately 100 worms / pool (2 Lu. cruzi and 1 Lu. foratinii ). Furthermore, two new Lu. foratinii pools were positive approximately with 10 and 1 parasite respectively. In Porto Alegre, from a total of 5 positive pools, 3 of them were identified according to multiplex PCR in approximately 100 parasites (2 Lu. neivai and 1 Lu.fischerii ) and the other 2 had an av erage of 10 parasites (1 Lu. neivai 1 and Lu. fischerii ). The samples collected in Rio de Janeiro had an average amount of 10 parasites each (4 Lu. Intermedia and 3 Lu migonei ). One of them, which was positive according to qualitative diagnosis, could not be quantitatively evaluated. The analysis of dissociation curves for determining the Tm values of kDNA amplified products of promastigotes of L. (V.) braziliensis and L. (L.) chagasi corroborated the previous results of diagnostic testing by means of PCR multiplex hybridization. Thus, it is important to highlight that diagnostic investigations will certainly contribute to a greater view of the scope of the establishment of parasite species in different areas, providing important data for the understanding of the eco - epidemiology of these diseases. This process allows the detection, proper identification and quantification of parasite burden in Leishmania spp sand fly fauna in areas reporting ACT and / or AVL in humans or animal reservoirs

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T20:16:37Z : No. of bitstreams: 1 piza_vmt_me_jabo.pdf: 496784 bytes, checksum: 8e82f3b02d746dfe3daa52fd23b8be9e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nesse estudo foi desenvolvido e aplicado o procedimento de imunocaptura para realizar a reação de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) a fim de ser amplificada uma região 5'_ proximal do gene 81 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) com 228 pb e de forma a fazer a detecção e a diferenciação desse vírus, comparando-se os resultados dessa metodologia com os obtidos na técnica convencional de RT-PCR. Todas as 11 estirpes do VBI testadas foram amplificadas pelas duas técnicas moleculares, enquanto que nenhum dos vírus heterólogos (Pneumovírus Aviário do grupo A e B, Vírus da Doença de Gumboro e o Vírus da Doença de Newcastle) ensaiados levaram a amplificação específica do gene 81. O limiar de detecção para a técnica de IC-RT-PCR foi idêntico ao do método de RT-PCR e correspondeu a 102.8 Doses Infectantes Embrionárias 50%. Para um total de 35 amostras de tecidos do trato respiratório testadas e provenientes de aves infectadas experimentalmente, 32 foram positivas pela técnica de IC-RT-PCR e também pela RT-PCR convencional, enquanto que o isolamento viral foi obtido para 22 dessas amostras. A análise do produto amplificado do gene 81 na IC-RT-PCR através da técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism), com as enzimas Alul e Mboll, permitiu a diferenciação das 5 estirpes de referências e dos 6 isolados de campo analisados em 4 diferentes genótipos, correspondentes às estirpes de referência M41, Connecticut, ou 8E-17, ou a um isolado de campo. Portanto, a técnica de IC¬RT -PCR demonstrou um grande potencial para ser aplicada no diagnóstico direto do VBI, apresentando vantagens sobre a técnica convencional de RT-PCR, as quais foram derivadas da combinação da especificidade da imunocaptura em fase sólida com a sensibilidade da reação de PCR, o que pode proporcionar ganho de tempo e menor custo para a manipulação de um maior número de amostras. / In this study, the immunocapture procedure followed by reverse transcription and polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) technique was standardized and applied for the amplification of 5'- proximal pari of 81 gene of infectious bronchitis virus (IBV) in infected f1uid or tissue samples, which were collected from embryonating chicken eggs or experimentally infected birds. The results of this technique were compared with those obtained in conventional RT-PCR. Ali eleven IBV strains tested were amplified, while none of the heterologous avian viral pathogens (Groups A and B Avian Pneumovirus, Newcastle Disease Virus and Gumboro Disease Vírus) gave positive results. The limit of detection for IC-RT¬PCR was identical to the common RT-PCR and corresponded to 102.8 50% embryonic infectious doses. Thirty two out of thirty five respiratory tissue samples collected from experimentally infected chickens were positive by both molecular techniques (IC-RT-PCR I common RT-PCR), whereas the vírus isolation test detected IBV in twenty two of these samples. The AluL and Mobll RFLP analysis of the 228 bp amplicon generated from IC-RT-PCR led to the discrimination of the 5 reference strains and 6 field IBV isolates in four genotypes; which were associated to the M41, to Connecticut, ar to 8E-17 strain, or to a field isolate. Therefore, the IC-RT-PCR demonstrated in this study a high potential for the application in the direct diagnosis of IBV and has relevant advantages over the conventional RT¬PCR, because it combines the specificity of the immunocapture in a solid phase with the sensitivity of the PCR, providing simplicity, rapidity and low cost for the manipulation of a high number of samples.

Orientador: Cáris Maroni Nunes / Banca: Elisa San Martin Mouriz Savani / Banca: Valéria Marçal Félix de Lima / Resumo: A leishmaniose visceral é uma doença em franca expansão no Brasil e que tem a participação de algumas espécies animais na manutenção de seu ciclo. Este trabalho objetivou investigar a presença de Leishmania spp. em morcegos de área endêmica para leishmaniose visceral e investigar a participação destes animais como possíveis reservatórios desta zoonose. Avaliou-se a presença de DNA dos parasitas, por meio da PCR, em amostras de baço e pele de 375 quirópteros originários de 19 cidades do Estado de São Paulo, Brasil, áreas endêmicas e com transmissão intensa para leishmaniose visceral. A amplificação de kDNA de Leishmania spp. por PCR foi positiva em 4,53% dos quirópteros, sendo que a maior positividade foi observada em amostras de baço (94,1%) e dois animais foram positivos tanto para amostras de pele como de baço; a presença de DNA do gene SSU 18S rRNA de Trypanosoma spp., também investigada, foi positiva em 4,53% das amostras sendo 23,5% positivas somente na amostra de baço, 76,5% somente na amostra de pele. Um animal apresentou positividade tanto para Leishmania spp. como para Trypanosoma spp. Os resultados indicam a ocorrência de Leishmania spp. em quirópteros da área endêmica para leishmaniose visceral, indicando a possibilidade de serem reservatórios desta zoonose / Abstract: Visceral leishmaniasis is a disease with increasing incidence in Brazil and that has some animal species contributing to its maintenance. This study aimed at investigating the presence of Leishmania spp. in bats from an endemic area for visceral leishmaniasis, in order to assess its participation as possible potential reservoirs for this zoonosis. We collected spleen and skin samples of 375 bats from 19 cities in the State São Paulo, Brazil, areas of intense visceral leishmaniasis transmission. kDNA Leishmania ssp. amplification by PCR was positive in 4.53% bats and a higher positivity was seen in spleen samples (94.1%); two bats were positive for both skin and spleen samples. Trypanosoma spp. genomic DNA amplification was also investigated and 4.53% of the samples were positive, 23.5% of these were positive only for spleen, 76.5% for skin. One bat was positive for both Leishmania spp. and Trypanosoma spp. DNA amplification. These results demonstrate the occurrence of Leishmania spp. in bats from endemic area for visceral leishmaniasis, indicating the possibility of these being reservoirs of this zoonosis / Mestre

Introdução: A AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) é caracterizada por uma disfunção grave no sistema imunológico causada por uma infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus). A quantificação da viremia (carga viral) é uma ferramenta muito útil no monitoramento dos pacientes infectados pelo HIV, sendo um marcador de progressão da doença e eficácia do tratamento. A estimativa incorreta da carga viral pode levar à decisão terapêutica equivocada, portanto métodos acurados de quantificação se fazem necessários. Diversas técnicas comerciais estão disponíveis para a quantificação da carga viral do HIV-1: a maioria destas se baseiam na detecção de ácidos nucléicos e outras na detecção de enzimas e antígenos. O grau de automação varia nas diferentes técnicas assim como os procedimentos de isolamento, amplificação e detecção. A correlação e a concordância entre estas técnicas têm sido estudadas e há relatos de discordância entre os valores de carga viral produzidos por diferentes métodos. O conhecimento sobre o efeito das variações entre as técnicas se faz necessário para assegurar a interpretação adequada dos resultados. A interpretação dos resultados correta é particularmente importante quando estes estão próximos a pontos de corte utilizados para definições de rebote viral e falha virológica. Objetivos: O objetivo deste estudo é comparar as técnicas de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0) para quantificação do HIV-1. Métodos: 1000 amostras recebidas no HIV/GUM Research Laboratory do Chelsea and Westminster Hospital para quantificação da carga viral do HIV-1 durante os meses de Dezembro de 2009 e Janeiro de 2010 foram testadas pelos métodos de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Resultados: Uma superquantificação sistemática foi observada nos resultados testados por PCR. Esta superquantificação ficou evidente nos resultados entre 50 e 250 cópias. Uma concordância elevada foi observada na análise dos pontos de corte de 500 e 1000 copias/mL. Uma correlação linear forte foi observada entre estas técnicas na análise das amostras que obtiveram resultados dentro do limite comum de detecção de ambas as técnicas, porém o nível de concordância foi insatisfatório. Conclusão: A superquantificação observada nos resultados obtidos pelo Cobas AmpliPrep TaqMan HIV- 1 v2.0 em relação ao bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 é provavelmente o resultado de uma sensibilidade aumentada desta técnica. Nós recomendamos cautela quando resultados de duas metodologias diferentes são comparados, especialmente quando se comparam metodologias convencionais com aquelas baseadas em PCR em tempo real. / Introduction: AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is characterised by a severe immune dysfunction caused by the HIV (Human Immunodeficiency Virus). The HIV viral load quantification is an essential tool to monitor HIV-infected patients. The HIV quantification is a disease progression marker and it is a key indicator in treatment efficacy. Inaccurate viral RNA values may subsequently lead to inappropriate treatment decisions hence accurate quantification methods are necessary. Several different methodologies are available to quantify the HIV viral load: a number of them are based on nucleic acid detection and others in detection of enzymes and antigens. Automation is also variable among these methods in addition to differences in isolation, amplification and detection. Several studies have been carried out to evaluate their correlation and agreement and some have evidenced discordant viral load values assessed by different assays. The knowledge about these differences should be taken in to account when analysing viral load results, particularly when low-level viraemia is concerned or those close to endpoints employed for definition of virological failure. Objectives: In this study, two methods to quantify viral load are evaluated: one is based on real-time PCR (AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) and the other is based on branched-DNA technology (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Methods: 1000 plasma samples received at the HIV/GUM Research Laboratory within Chelsea and Westminster Hospital for HIV-1 viral load quantification between December 2009 and January 2010 were tested by both Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 and Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 methods. Results: Results obtained show that Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 PCR systematically overquantifies the viral loads results when compared to bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0. Conclusion: The overquantification by Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 over bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 is likely to be a result of its increased sensitivity. We recommend caution when comparing results from different methodologies, especially when a conventional assay and a real-time PCR assay are concerned.

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Doenças tireoideanas são bastante comuns, sendo sua maioria benigna. A relação entre os diversos tipos de doenças tireoideanas, bem como seus aspectos moleculares, são pouco conhecidos. O bócio (hiperplasia), por exemplo, é descrito por alguns como relacionado com carcinoma (tumor maligno) papilífero, enquanto que outros afirmam não haver relação causal entre as duas doenças. A questão mais desafiante, porém, refere-se à distinção entre adenoma (tumor benigno) e carcinoma folicular, que atualmente é feita apenas após à cirurgia, não permitindo tratamento diferenciado para os dois tipos de tumor. Este trabalho buscou identificar genes diferencialmente expressos entre tecido tireoideano normal, bócio, adenoma e carcinoma papilífero utilizando microarrays. Carcinomas foliculares não foram incluídos devido ao número e tamanho reduzidos das amostras. Dois tipos de array foram utilizados: arrays em membranas de nylon, contendo 213 clones obtidos por DDRT-PCR de amostras de tireóide, e arrays em vidro, contendo 3800 clones ORESTES. Experimentos utilizando o primeiro tipo de array identificaram três genes diferencialmente expressos, cuja expressão foi analisada por RT-PCR em 10 amostras de cada tipo de tecido. Dois deles foram capazes de diferenciar carcinomas papilíferos de tecido normal e bócio com 89% de precisão para o tumor maligno e 80% para os tecidos não malignos. Os arrays em vidro foram utilizados para avaliar o perfil de expressão de aproximadamente 10 amostras de cada tipo de tecido tireoideano. Foram identificados 160 clones diferencialmente expressos entre quaisquer dois tipos de tecido, cujas seqüências foram determinadas e comparadas com as dos bancos de dados. Dentre os genes mais interessantes destacam-se o correspondente à ATPase Na/K, cuja expressão está reduzida nos carcinomas em relação a tecidos normais e adenomas, o da proteína PDCD4, envolvida em morte celular programada, mais expresso em adenomas e tecidos normais em comparação com carcinomas e bócios, e os da calgizzarin (S100A11) e da &#945;1-anti-tripsina, ambos mais ativos nos carcinomas do que nos demais tecidos. Todos esses genes já foram descritos como diferencialmente expressos em algum tipo de tumor. Este trabalho levou à padronização da metodologia de microarray em lâminas de vidro em nosso laboratório, bem como à identificação de genes que podem elucidar as alterações envolvidas na formação do bócio, adenoma e carcinoma papilífero. A implantação da técnica de amplificação de mRNA em nosso laboratório viabilizou a utilização de 10 amostras de carcinoma folicular, cuja massa de RNA total era insuficiente para as hibridizações. Essas amostras serão hibridizadas, juntamente com 10 amostras de adenoma, com microarrays contendo 4800 genes humanos conhecidos para a busca de genes diferencialmente expressos, de grande interesse diagnóstico. / Thyroid diseases are very common and are usually benign. The causal relationships among the different types of disease, as well as their molecular aspects, are not well understood. The goiter (hyperplasia), for instance, is described by some as related to papillary carcinoma (a malignant tumor), while others say there is no causal relationship between the two diseases. The most defying question, however, concerns the distinction between adenoma (benign tumor) and follicular carcinoma, which is currently made only after surgery, not allowing distinct treatments for the two kinds of tumor. This work aimed to identify differentially expressed genes among normal thyroid tissue, goiter, adenoma and papillary carcinoma using microarrays. Follicular carcinomas were not included due to the reduced number and size of the samples. Two kinds of array were used: arrays in nylon membranes, with 213 clones isolated from thyroid samples by differential display (DDRT-PCR); and glass slide arrays containing 3800 ORESTES clones.Experiments using the first type of array identified three differentially expressed genes, whose expression was analyzed by RT-PCR in 10 samples of each kind of tissue. Two of these genes were able to differentiate papillary carcinomas from goiters and normal tissues with precisions of 89% for the malignant tumor and 80% for the non-malignant tissues. Glass slide arrays were used to evaluate gene expression profile of approximately 10 samples of each type of thyroid tissue. 160 clones differentially expressed between any two tissues were identified, and their sequences were determined and compared with databases. Among the most interesting genes are Na/K ATPase gene, whose expression is reduced in carcinomas compared to normal tissues and adenomas, the gene corresponding to PDCD4 protein, involved in program cell death, with elevated expression in adenomas and normal tissues than carcinomas and goiters, and the genes of calgizzarin (S100A11) and &#945;1-antitrypsin, both more active in carcinomas than the other tissues. All these genes have already been described as differentially expressed in at least one type of human cancer. This work led to the standardization of glass slide microarray technology in our laboratory, and to the identification of genes that may clarify the alterations involved in the formation of goiter, adenoma and follicular carcinoma. The implementation of mRNA amplification technique in our laboratory allowed the utilization of 10 samples of follicular carcinoma, whose mass was insufficient for microarray hybridizations. These samples will be hybridized along with 10 samples of adenomas, with microarrays containing 4800 known human genes to search for differentially expressed genes, of great diagnostic interest.

Introdução: A AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) é caracterizada por uma disfunção grave no sistema imunológico causada por uma infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus). A quantificação da viremia (carga viral) é uma ferramenta muito útil no monitoramento dos pacientes infectados pelo HIV, sendo um marcador de progressão da doença e eficácia do tratamento. A estimativa incorreta da carga viral pode levar à decisão terapêutica equivocada, portanto métodos acurados de quantificação se fazem necessários. Diversas técnicas comerciais estão disponíveis para a quantificação da carga viral do HIV-1: a maioria destas se baseiam na detecção de ácidos nucléicos e outras na detecção de enzimas e antígenos. O grau de automação varia nas diferentes técnicas assim como os procedimentos de isolamento, amplificação e detecção. A correlação e a concordância entre estas técnicas têm sido estudadas e há relatos de discordância entre os valores de carga viral produzidos por diferentes métodos. O conhecimento sobre o efeito das variações entre as técnicas se faz necessário para assegurar a interpretação adequada dos resultados. A interpretação dos resultados correta é particularmente importante quando estes estão próximos a pontos de corte utilizados para definições de rebote viral e falha virológica. Objetivos: O objetivo deste estudo é comparar as técnicas de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0) para quantificação do HIV-1. Métodos: 1000 amostras recebidas no HIV/GUM Research Laboratory do Chelsea and Westminster Hospital para quantificação da carga viral do HIV-1 durante os meses de Dezembro de 2009 e Janeiro de 2010 foram testadas pelos métodos de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Resultados: Uma superquantificação sistemática foi observada nos resultados testados por PCR. Esta superquantificação ficou evidente nos resultados entre 50 e 250 cópias. Uma concordância elevada foi observada na análise dos pontos de corte de 500 e 1000 copias/mL. Uma correlação linear forte foi observada entre estas técnicas na análise das amostras que obtiveram resultados dentro do limite comum de detecção de ambas as técnicas, porém o nível de concordância foi insatisfatório. Conclusão: A superquantificação observada nos resultados obtidos pelo Cobas AmpliPrep TaqMan HIV- 1 v2.0 em relação ao bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 é provavelmente o resultado de uma sensibilidade aumentada desta técnica. Nós recomendamos cautela quando resultados de duas metodologias diferentes são comparados, especialmente quando se comparam metodologias convencionais com aquelas baseadas em PCR em tempo real. / Introduction: AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is characterised by a severe immune dysfunction caused by the HIV (Human Immunodeficiency Virus). The HIV viral load quantification is an essential tool to monitor HIV-infected patients. The HIV quantification is a disease progression marker and it is a key indicator in treatment efficacy. Inaccurate viral RNA values may subsequently lead to inappropriate treatment decisions hence accurate quantification methods are necessary. Several different methodologies are available to quantify the HIV viral load: a number of them are based on nucleic acid detection and others in detection of enzymes and antigens. Automation is also variable among these methods in addition to differences in isolation, amplification and detection. Several studies have been carried out to evaluate their correlation and agreement and some have evidenced discordant viral load values assessed by different assays. The knowledge about these differences should be taken in to account when analysing viral load results, particularly when low-level viraemia is concerned or those close to endpoints employed for definition of virological failure. Objectives: In this study, two methods to quantify viral load are evaluated: one is based on real-time PCR (AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) and the other is based on branched-DNA technology (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Methods: 1000 plasma samples received at the HIV/GUM Research Laboratory within Chelsea and Westminster Hospital for HIV-1 viral load quantification between December 2009 and January 2010 were tested by both Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 and Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 methods. Results: Results obtained show that Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 PCR systematically overquantifies the viral loads results when compared to bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0. Conclusion: The overquantification by Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 over bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 is likely to be a result of its increased sensitivity. We recommend caution when comparing results from different methodologies, especially when a conventional assay and a real-time PCR assay are concerned.