Orientadores: Sérgio Furtado dos Reis, Sergio Ivan Perez / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_CarolinaLemesNascimento_M.pdf: 1856991 bytes, checksum: 0333e9b5415ace1df307eb389ef0260c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Mudanças climáticas são fenômenos responsáveis por influenciar dinâmicas de populações ao longo da história evolutiva das espécies. Quando mudanças no clima ocorrem de maneira abrupta suas consequências podem ser refletidas na distribuição, no tamanho e na persistência das populações sob o efeito destas mudanças. O Quaternário foi uma época caracterizada por mudanças climáticas rápidas e intensas. Estimar a demografia histórica de populações nesta escala de tempo é uma forma de avaliar como flutuações no clima influenciaram populações ancestrais. Dados genéticos nos permitem recuperar informação sobre o tamanho populacional em escalas de tempo amplas e buscar associações entre flutuações no tamanho das populações e variações no clima. A demografia histórica de populações do peixe de água doce Poecilia vivipara habitantes da planície Quaternária do norte do Rio de Janeiro foi estimada com o objetivo de avaliar se fenômenos em escalas de tempo ancestrais deixaram uma assinatura no genoma dos indivíduos de populações contemporâneas. Subsequentemente, foi avaliado se as assinaturas genéticas são reflexo de respostas populacionais às variações climáticas intensas ocorridas no Quaternário. Para estimar a demografia histórica de P. vivipara, utilizou-se o método Skyline-Plot Bayesiano (BSP), sendo o gene mitocondrial citocromo b o marcador molecular analisado. A dinâmica populacional ancestral de P. vivipara revelou uma mudança de regime nos últimos 75 mil anos, que pode estar associada direta ou indiretamente às variações climáticas do Quaternário. Flutuações no nível do mar, geradas pelas mudanças climáticas do Quaternário, podem estar relacionadas com as flutuações no tamanho populacional de P. vivipara. Estudos incluindo outras regiões do genoma e com maior detalhamento sobre variações climáticas locais podem contribuir para gerar estimações mais confiáveis da história populacional de P. vivipara e sua potencial relação com eventos climáticos / Abstract: Paleoclimatic changes are responsible to influence population dynamics through the evolutionary history of species. When climatic changes occur suddenly its consequences can be reflected in the distribution, size and persistence of populations. The Quaternary was a time of massive climatic changes. The estimation of the demographic history of populations at such timescales allows the assessment of how climatic fluctuations have influenced ancestral populations. Genetic data are available and allow recovering information about population sizes in wide timescales and searching for associations between population size fluctuations and climatic change. The historical demography of freshwater fish Poecilia vivipara populations inhabiting the Rio de Janeiro Northern Quaternary Plain was estimated aiming to evaluate if phenomena in ancestral timescales leaves a signature in the genomes of its modern representatives. Subsequently, we evaluate if the genetic signatures are the result of population responses to massive climatic changes occurred in Quaternary. The Bayesian Skyline-Plot (BSP) was utilized to estimate the demographic history of P. vivipara, with the mitochondrial gene cytochrome b as molecular marker. The ancestral population dynamics of P. vivipara revealed a regime change in the last 75,000 years, which can be direct or indirectly associated to Late Quaternary climatic variations. Sea level fluctuations, generated by Quaternary climatic changes, could be related to population size fluctuations of P. vivipara. Studies including other genome regions and with more details about local climatic variations can create more reliable estimations of the P. vivipara population history and its potential relationship with climatic events / Mestrado / Biodiversidade Animal / Mestra em Biologia Animal

Orientadores: Eliana Maria Zanotti Magalhães, Roseli Tuan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palasio_RaquelGardiniSanches_M.pdf: 32439761 bytes, checksum: e30767ddf6f947a1346867f1f0a27494 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O planorbídeo Biomphalaria tenagophila (Orbigny, 1835) (Gastropoda: Planorbidae) é a espécie hospedeira intermediaria do Schistosoma mansoni Sambon, 1907 predominante no estado de São Paulo. No estado de São Paulo a espécie está relacionada com a transmissão da maioria dos casos autóctones de esquistossomose. Exemplares de B. tenagophila provenientes de várias localidades da bacia Litorânea Paulista foram analisados quanto ao polimorfismo de um trecho do gene mitocondrial rRNA16S e o segmento ITS2 que integra o cistron de DNA ribossômico nuclear. Paralelamente foi testada a suscetibilidade de populações de B. tenagophila das localidades de Itariri, Caraguatatuba, Ilha Bela e São Sebastião com linhagens diferenciadas de S. mansoni. As localidades amostradas representam pontos importantes na transmissão da esquistossomose no estado de São Paulo, devido as condições de infraestrutura, por serem áreas inundáveis e pela presença de contingente humano de outras áreas do Brasil. Nesta situação, destacam-se o município de Itariri, onde ocorreram os maiores números de casos de esquistossomose no Vale do Ribeira e os municípios de Caraguatatuba e São Sebastião que ao longo dos anos vem tendo um aumento no número de casos autóctones. Do total de 1635 espécimes de Biomphalaria coletados nas coleções de água doce do Litoral Norte e Sul do estado de São Paulo observamos a predominância de 84% da espécie B. tenagophila e 16% da espécie Biomphalaria straminea (Dunker, 1848). As análises moleculares indicaram que existem duas subpopulações de B. tenagophila nesta área, com haplótipos exclusivos para Juquiá e Registro, e sequências que compartilham o mesmo haplótipo do Litoral Norte e de Itariri. As taxas de infecções para as linhagens SJ e SJS mostraram que os caramujos do Litoral Norte foram mais suscetíveis que os caramujos do município de Itariri, talvez pode ser devido a proximidade dos municípios do Litoral Norte com o Vale do Rio Paraíba, local de origem da linhagem. A maior taxa de infecção correspondeu uma maior mortalidade nos moluscos de Caraguatatuba e Ilha Bela, indicando que o parasita afetou a sobrevida dos moluscos. Os resultados deste trabalho mostraram que todas as populações testadas foram resistentes às linhagens BH e SE. Os resultados sugerem haver uma correlação positiva entre a suscetibilidade ao S. mansoni e a redução da variabilidade genética nas populações de caramujos testadas. Desta forma, o risco de infecção dos hospedeiros intermediários por S. mansoni estaria relacionado com populações de caramujos geneticamente homogêneas. Desta forma o grau de diversidade genética pode ser um indicador de risco para a transmissão da esquistossomose / Abstract: The planorbid Biomphalaria tenagophila (Orbigny, 1835) (Gastropoda: Planorbidae) is the predominant intermediate host specie of Schistosoma mansoni Sambon, 1907 in São Paulo state, where is most related to autochthonous cases of schistosomiasis transmission. Specimens of B. tenagophila were obtained from several locations of São Paulo Coastal Basin and analyzed for the polymorphism of a portion of the mitochondrial gene rRNA16S and the ITS2 segment, wich integrates the cistron of nuclear ribosomal DNA. In parallel it was tested the susceptibility of B. tenagophila populations from the municipalities of Itariri, Caraguatatuba, Ilha Bela and São Sebastião, with different strains of S. mansoni. These sampling sites represent important points of schistosomiasis transmission in São Paulo state due to infrastructure conditions, floodable areas and the presence of human contingent of other Brazilian areas, in particular the municipality of Itariri, where occurred the highest number of cases of schistosomiasis in the Ribeira Valley and in the cities of São Sebastião and Caraguatatuba that over the years it has had an increase in the number of autochthonous cases. Of the total 1635 of Biomphalaria specimens collected in freshwater pools from the North and South Coasts of the state of São Paulo, it was observed the predominance of 84% B.tenagophila species and the presence of Biomphalaria straminea (Dunker, 1848) in 16%. The molecular analysis indicates that there are two subpopulations of B. tenagophila in this area, one with an exclusive and unique haplotype from Juquiá and Registro, and the other with sequences which share the same haplotype from the North Coast and Itariri. The infection rates of SJ and SJS strains show the snails from the North Coast are more susceptible than the snails from the municipality of Itariri. This, in hypothesis, can be caused due to the proximity of the cities of the North Coast and the Paraíba River Valley, site of origin of those strains. The highest infection rate corresponded to a higher mortality rate of the mollusks from Caraguatatuba and Ilha Bela, indicating the effect of the parasite in the snails' survival. The results of this study show that all tested populations were resistant to the BH and SE strains. The results suggest a positive relationship between S. mansoni susceptibility and the reduction of genetic variability in the snails populations tested. Therefore, the S. mansoni infection risk of the intermediate hosts would be related to genetically homogeneous snails' populations. And with that, genetic diversity can be an indicator of risk for the transmission of schistosomiasis / Mestrado / Biodiversidade Animal / Mestra em Biologia Animal

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2009. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 115 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Mata Atlântica brasileira concentra uma das maiores diversidades biológicas da Terra com cerca de 7% das espécies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espécies de anuros do Brasil (c.a. 500 espécies), mas sofre intensa perda e fragmentação de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlântica, a Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espécies já descritas. Acredita-se, porém, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificação de espécies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte à identificação morfológica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, são utilizados para a realização de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificação molecular de espécies (DNA barcode) na comunidade de anfíbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivíduos, entre adultos e girinos de 23 espécies, agrupados em seis famílias distintas. Desses 99 indivíduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referência e foram realizadas, com sucesso, a determinação de espécies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espécies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificações haviam sido determinadas com base em critérios morfológicos, agruparam em clados de mesmo gênero, porém de espécies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Além de altos valores de distância intraespecífica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distâncias interespecíficas nulas (0%) temos a indicação de possíveis equívocos em determinações de espécies feitas exclusivamente por critérios morfológicos. Nesse caso, as discordâncias morfológica e molecular são exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificação morfológica e a escassez de chaves de identificação dessas espécies em estágio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificação de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivíduos em estágios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificação morfológica, suporta a correta identificação das espécies de anfíbios anuros. / The Brazilian Atlantic Forest focuses one of the greatest biological diversity of the Earth with about 7% of the planet's animal and plant species. This biome is currently home to more than 50% of anurans species from Brazil (c.a. 500 species), but it suffers severe loss and fragmentation of habitat. One of the main fragments of the Atlantic Forest, the Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) houses a wide anuran fauna, with about 71 species had already described. It is believed, however, that lots of them still need to be identified and studied. The identification of these species based on molecular characters has proven to be an alternative to support a morphological identification, and in this context the mitochondrial DNA genes, such as 16S are used to perform barcode. The goal of this study was to test the methodology for molecular identification (DNA barcode) in anurans of REGUA community using 16S mitochondrial gene. For this, tissues of 99 individuals, including adults and tadpoles of 23 species, grouped into six different families were collected. Of these 99 individuals, 88 were amplified correctly to the reference gene and were successful determination of 84 species of anurans (95.45%) of the REGUA. Scinax albicans, Scinax flavoguttatus and Hylodes charadranaetes species whose identifications had been determined based on morphological criteria, grouped into clades of the same gender, but different species when analyzed by methodologies neighbor-joining and maximum-likelihood. In addition to high intraspecific distances (2,18%, 3,49% and 3,77% respectively) and interspecific distances to nil (0%), we have an indication of possible mistakes of species determinations made by a morphological criterion. In this case, the morphological and molecular disagreements are exclusively on tadpoles, demonstrating the difficulty of morphological identification and the shortage of identification of these species larval stage. The results show that the 16S mitochondrial gene had its use in identifying the anurans REGUA confirmed and indicate that the case studies with individuals in larval stages, as in tadpoles , the methodology of the barcode when complemented morphological identification, supports the correct identification of species of anurans amphibians .

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Mata Atlântica brasileira concentra uma das maiores diversidades biológicas da Terra com cerca de 7% das espécies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espécies de anuros do Brasil (c.a. 500 espécies), mas sofre intensa perda e fragmentação de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlântica, a Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espécies já descritas. Acredita-se, porém, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificação de espécies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte à identificação morfológica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, são utilizados para a realização de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificação molecular de espécies (DNA barcode) na comunidade de anfíbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivíduos, entre adultos e girinos de 23 espécies, agrupados em seis famílias distintas. Desses 99 indivíduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referência e foram realizadas, com sucesso, a determinação de espécies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espécies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificações haviam sido determinadas com base em critérios morfológicos, agruparam em clados de mesmo gênero, porém de espécies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Além de altos valores de distância intraespecífica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distâncias interespecíficas nulas (0%) temos a indicação de possíveis equívocos em determinações de espécies feitas exclusivamente por critérios morfológicos. Nesse caso, as discordâncias morfológica e molecular são exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificação morfológica e a escassez de chaves de identificação dessas espécies em estágio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificação de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivíduos em estágios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificação morfológica, suporta a correta identificação das espécies de anfíbios anuros. / The Brazilian Atlantic Forest focuses one of the greatest biological diversity of the Earth with about 7% of the planet's animal and plant species. This biome is currently home to more than 50% of anurans species from Brazil (c.a. 500 species), but it suffers severe loss and fragmentation of habitat. One of the main fragments of the Atlantic Forest, the Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) houses a wide anuran fauna, with about 71 species had already described. It is believed, however, that lots of them still need to be identified and studied. The identification of these species based on molecular characters has proven to be an alternative to support a morphological identification, and in this context the mitochondrial DNA genes, such as 16S are used to perform barcode. The goal of this study was to test the methodology for molecular identification (DNA barcode) in anurans of REGUA community using 16S mitochondrial gene. For this, tissues of 99 individuals, including adults and tadpoles of 23 species, grouped into six different families were collected. Of these 99 individuals, 88 were amplified correctly to the reference gene and were successful determination of 84 species of anurans (95.45%) of the REGUA. Scinax albicans, Scinax flavoguttatus and Hylodes charadranaetes species whose identifications had been determined based on morphological criteria, grouped into clades of the same gender, but different species when analyzed by methodologies neighbor-joining and maximum-likelihood. In addition to high intraspecific distances (2,18%, 3,49% and 3,77% respectively) and interspecific distances to nil (0%), we have an indication of possible mistakes of species determinations made by a morphological criterion. In this case, the morphological and molecular disagreements are exclusively on tadpoles, demonstrating the difficulty of morphological identification and the shortage of identification of these species larval stage. The results show that the 16S mitochondrial gene had its use in identifying the anurans REGUA confirmed and indicate that the case studies with individuals in larval stages, as in tadpoles , the methodology of the barcode when complemented morphological identification, supports the correct identification of species of anurans amphibians .

Orientadores: Aníbal Eugênio Vercesi, Flávio Vieira Meirelles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:18:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiaratti_MarcosRoberto_D.pdf: 26150066 bytes, checksum: 12cccf5f865b2ef08f186cad0c922cb6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O DNA mitocondrial (mtDNA) dos mamíferos é composto por cerca de 16.500 pares de bases, tem herança exclusivamente materna, e codifica 13 polipeptídios essenciais para a função mitocondrial. Centenas a milhares de cópias de mtDNA estão presentes nas células somáticas dependendo da necessidade energética do tecido. No entanto, oócitos contêm mais de 150.000 cópias, no mínimo uma ordem de magnitude maior que a quantidade presente na maioria das células somáticas. Além disso, uma vez que o mtDNA não é replicado durante o desenvolvimento inicial, a quantidade de mtDNA por célula diminui a cada ciclo celular. Portanto, o número de cópias presentes no oócito deve ser suficiente para atender às necessidade energéticas das células embrionárias até que a replicação do mtDNA seja restabelecida. Considerando que há uma grande variabilidade da quantidade de mtDNA entre oócitos e que alguns trabalhos têm relacionado infertilidade e cópias de mtDNA no oócito, a quantidade de mtDNA poderia ser utilizada para selecionar embriões mais competentes a se desenvolverem. Para testar esta hipótese utilizou-se como modelo experimental o bovino uma vez que o desenvolvimento embrionário desta espécie é muito mais similar ao do humano que o de camundongo. Para tanto, em um primeiro experimento foram utilizados oócitos bovinos provenientes de folículos de diferentes tamanhos. Oócitos oriundos de folículos pequenos, os quais são sabidamente menos competentes a se desenvolverem a blastocisto, continham menos mtDNA comparado com oócitos oriundos de folículos maiores. No entanto, devido a grande variabilidade do número de cópias, num segundo experimento embriões partenogenéticos no estádio de uma célula sofreram biópsia para se determinar o conteúdo de mtDNA antes de serem cultivados para acessar a capacidade de desenvolvimento. Em contraste com achados prévios, o número de cópias de mtDNA nas biópsias não diferiu entre embriões competentes e incompetentes, indicando que o conteúdo de mtDNA não está relacionado com a competência de desenvolvimento a blastocisto. Para confirmar este achado, embriões no estádio de uma célula foram depletados em mais de 60% do seu conteúdo de mtDNA por centrifugação seguido da remoção de parte da fração citoplasmática rica em mitocôndrias. Surpreendentemente, os embriões depletados desenvolveram-se normalmente a blastocisto, os quais continham número de cópias de mtDNA similar a controles não manipulados. O desenvolvimento dos embriões depletados foi acompanhado por um aumento na expressão de genes (TFAM e NRF1) que controlam a replicação e transcrição do mtDNA, indicando uma habilidade intrínseca do embrião bovino em restaurar o conteúdo de mtDNA no estádio de blastocisto. Em conclusão, embriões bovinos competentes são capazes de regular o conteúdo de mtDNA no estádio de blastocisto independentemente do número de cópias presente no oócito. Estes achados contrariam o que foi descrito em camundongos, ressaltando a necessidade de estudos com espécies mais semelhantes ao homem antes do uso clínico do mtDNA como ferramenta para o diagnóstico de fertilidade em mulheres. Além disso, este trabalho tem implicação na manipulação da herança mitocondrial e, portanto, na prevenção da transmissão de sérias patologias causadas por mutações no mtDNA / Abstract: The mammalian mitochondrial DNA (mtDNA) is composed by only about 16,500 base pairs, is exclusively inherited from the mother, and encodes 13 polypeptides essential for mitochondrial function. Hundreds to thousands mtDNA copies are found in somatic cells depending on the energetic requirement of the tissue. However, oocytes contain more than 150,000 copies, at least an order of magnitude greater than most somatic cells. Moreover, since replication of mtDNA is downregulated during early development, the mtDNA content per cell decreases after each cell cycle. Therefore, mtDNA copy number in oocytes should be enough to support the energetic requirement of embryonic cells until mtDNA replication to be restablished. Considering there is a wide variability of mtDNA copy number among oocytes and there are reports showing a link between infertility and oocyte mtDNA copy number, the content of mtDNA could be used to select embryos more competent to develop. To test this hypothesis we used the bovine as an experimental model since its embryonic development is more similar to human than the murine is. Therefore, in a first experiment bovine oocytes derived from follicles of different sizes were used. Oocytes obtained from small follicles, known to be less competent to develop into blastocysts, contained less mtDNA than those originated from larger follicles. However, due to the high variability in copy number, in a second experiment a more accurate approach was examined in which parthenogenetic one-cell embryos were biopsied to measure their mtDNA content and then cultured to assess development capacity. Contrasting with previous findings, mtDNA copy number in biopsies was not different between competent and incompetent embryos, indicating that mtDNA content is not related to early developmental competence. To further examine the importance of mtDNA on development, one-cell embryos were partially depleted of over than 60% of their mtDNA by centrifugation followed by the removal of the mitochondrial-enriched cytoplasmic fraction. Surprisingly, depleted embryos developed normally into blastocysts, which contained mtDNA copy numbers similar to non-manipulated controls. Development in depleted embryos was accompanied by an increase in the expression of genes (TFAM and NRF1) controlling mtDNA replication and transcription, indicating an intrinsic ability to restore the content of mtDNA at the blastocyst stage. In conclusion, competent bovine embryos are able to regulate their mtDNA content at the blastocyst stage regardless of the copy numbers present in oocytes. These findings are in disagreement with that reported for mice, highlighting the need for studies using species more similar to human before the clinical use of mtDNA as a diagnostic tool in woman fertility. Moreover, these findings are important to manipulate mitochondrial inheritance and, therefore, to prevent transmission of important disorders caused by mtDNA mutations / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Les îles du Sud-Ouest de l'océan Indien (SOOI) abritent une faune et une flore exceptionnelle et constituent l'un des cinq hotspot de biodiversité les plus importants au monde. L'abeille domestique Apis mellifera occupe divers habitats dans la majorité de ces îles et interagit avec une flore indigène et endémique. Elle est également exploitée par l'Homme pour l'apiculture. A. mellifera a divergé en plusieurs lignées évolutives et sous-espèces dans son aire d'origine. Parmi-elles, A. m. unicolor a été décrite comme endémique de Madagascar et appartient à la lignée africaine A. Les objectifs de cette thèse étaient de caractériser l'abeille dans les archipels des Mascareignes, Comores et Seychelles en identifiant les lignées évolutives et sous-espèces présentes avec des marqueurs mitochondriaux (région intergénique COI-COII, gène ND2). Dans un second temps, une étude de la diversité et de la structure génétique a été réalisée sur ces mêmes populations insulaires (15 microsatellites). Un total de 4095 colonies ont été échantillonnées dans le SOOI et 238 dans l'aire naturelle continentale. Trois des quatre lignées évolutives (A, C et M) ont été détectées dans les 10 îles étudiées et ce en différentes proportions. La lignée africaine A et A. m. unicolor sont prépondérantes dans le SOOI excepté à Rodrigues (100% lignée européenne C). Dans toutes les îles de l'archipel des Comores et des Seychelles, 100% des colonies échantillonnées appartiennent à la lignée A, 95,2% à La Réunion et seulement 54,2% à Maurice. Les îles de l'archipel des Comores constitueraient une zone de contact entre la lignée africaine continentale et les populations d'A. m. unicolor. La diversité génétique nucléaire est forte dans les archipels du SOOI et est structurée par îles et archipels. En outre, les populations du SOOI se différencient fortement des populations continentales africaines et européennes. La combinaison des différents marqueurs privilégie l'hypothèse d'une colonisation ancienne et naturelle d'A. m. unicolor depuis Madagascar à La Réunion, Maurice et aux Seychelles. / The South West Indian Ocean (SWIO) islands are home to an exceptional flora and fauna and are considered as one the five most important biodiversity hotspots in the world. In most islands of this region, the honeybee Apis mellifera occupies diverse habitats. Regarding its ability as a generalist pollinator, honeybee interacts with native and highly endemic flora. Furthermore, this species is used by human for beekeeping as it is able to produce honey, pollen and other hive products. Within the large group of bees (Apidae), A. mellifera is a model of diversity that has diverged into several lineages and subspecies in its native range. Among the 28 recognized subspecies, A. m. unicolor has been described as endemic to Madagascar and belongs to the African A lineage. The Mascarenes, Comoros and Seychelles archipelagos surround this continental island but the A. mellifera populations present have been little or never studied. The aims of this thesis were to characterize the honeybee from the Mascarenes (La Réunion, Mauritius, Rodrigues), Comoros (Anjouan, Mohéli, Grande Comore, Mayotte) and Seychelles (Mahé, Praslin, La Digue) archipelagos by determining the evolutionary lineages and subspecies present. Secondly, a study of genetic diversity and structure were conducted on these same insular populations. For that, a large sampling was carried (n = 4095 colonies from the SWIO, and 238 from native continental areas) and was combined to molecular analyzes using mitochondrial markers (sequencing of the COI-COII intergenic region and ND2 gene) and nuclear markers (15 microsatellite loci). Three of the four evolutionary lineages (A, C and M) were detected in different proportions in the 10 studied islands. The African A lineage and A. m. unicolor subspecies were predominant in the SWIO excepted for Rodrigues exclusively from the European C lineage. All sampled colonies from the Seychelles and Comoros archipelagos belong to the African lineage while in La Réunion the proportion reach 95.2% and only 54.2% in Mauritius. The presence of the Z African sub-lineage has been described for the first time out of Africa in two Seychelles islands. Moreover, Comoros islands may constitute a contact area between the continental African lineage and A. m. unicolor populations (insular African lineage). The SWIO populations show high levels of nuclear genetic diversity and a structuration by island and archipelago. In addition, SWIO populations strongly differentiated from African and European continental populations. The combined results from different molecular markers favor the hypothesis of an ancient and natural colonization from Madagascar to La Réunion, Mauritius and Seychelles islands. Therefore, the previous referenced interactions between the honeybee and the endemic fauna and flora in the SWIO might be explained by a long cohabitation in addition to its generalist pollinator ability.

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

This thesis is a part of the project aimed at sequencing the genome and transcriptome of the bank vole (Clethrionomys glareolus). The role of natural selection in the evolution of mitochondrial DNA (mtDNA) has been subject to much discussion; while some studies did not provide evidence that selection affected the phylogeography of the studied species, other considered adaptive evolution important. The bank vole is the key model we use to study the adaptation to climate change. As with other species, the phylogeography of the bank vole has been based on the variation of a small part of mtDNA. The goal of the thesis was to sequence the entire mitochondrial genome for representatives of all main mtDNA lineages of the bank vole using the Sanger and Illumina technologies, and to assess the role of selection and adaptation in the evolution and phylogeography of this species. The adaptive evolution in mtDNA probably was not the main driving force during the postlacial colonization of Europe. However, signatures of adaptive evolution have been found - an amino acid change with possible functional consequences in one gene and an excess of radical changes in physical- chemical properties of amino acids in populations at the latitudinal (northern and southern) extremes of the bank vole distribution. Key...