Tübingen, Univ., Diss., 2005.

Erlangen, Nürnberg, Universiẗat, Diss., 2005. / Enth. 1 Sonderabdr. aus: Cellular microbiology ; 5. 2003. - Beitr. teilw. dt., teilw. engl.

Ulm, Univ. Diss., 2005.

Würzburg, University, Diss., 2008.

Marburg, Univ., Diss., 2009

Stuttgart, Univ., Diss., 2003.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2003.

Die Einführung der Tyrosinkinaseinhibitoren (TKIs) stellt einen Meilenstein der Hämatoonkologie im 21. Jahrhundert dar. Im Kontext der chronisch myeloischen Leukämie (CML) konnte das BCR-Abl-Fusionstranskript als pathognomonisches Korrelat identifiziert werden. Dessen pharmakologische Hemmung über bestimmte TKIs korrelierte nicht nur mit hervorragenden Remissionsraten, sondern auch mit einer deutlich besseren Verträglichkeit. Dasatinib verfügt als Zweitgenerations-TKI neben einer hohen Bindungsaffinität zum BCR-Abl-Fusionstranskript als Multi-TKI auch über weitere Zielstrukturen, zu welchen u.a. die Kinasen der Src-Familie (SFKs) gehören. Diese übernehmen bei verschiedenen Immunzellen wichtige regulatorische Funktionen. Bei einem Teil der CML-Patienten kann die TKI-Therapie unterbrochen werden und es findet sich eine anhaltende Remission. Hierfür wurden immunmodulatorische Effekte der TKIs angenommen. Für Dasatinib konnten in vitro und in vivo immunmodulatorische Effekte, u.a. auf T- und NK-Zellen nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten mögliche immunmodulatorische Effekte auf dendritische Zellen monozytärer Abstammung (moDZ) in vitro untersucht werden. Die Generierung von moDZs erfolgte mittels Zugabe von IL-4 und GM-CSF aus Monozyten gesunder Blutspender. Dasatinib wurde in klinisch relevanten Konzentrationen (10-50 nM) ab Beginn der DZ-Generierung zugegeben, für ausgewählte Experimente auch kurz vor Reifung mit LPS. Dabei wurde der Einfluss von Dasatinib auf die Generierung von moDZs sowie wichtige Funktionen unreifer (Endozytose) und reifer DZs (Expression von zellulären und humoralen Effektorfunktionen) analysiert. Dasatinib bewirkte in einer Konzentration von 50 nM eine verminderte Generierung von moDZs aus Monozyten. Phänotypisch zeigte sich dabei eine verminderte Expression des DZ-typischen Markers CD1a bei einer persistierenden Expression des monozytären Markers CD14. Parallel fand sich auch eine Population CD1a/CD14-koexprimierender Zellen. Daneben konnte auch eine Apoptosesteigerung unter Dasatinib nachgewiesen werden. In Bezug auf die Makropinozytose FITC-konjugierter Dextranpartikel wurde keine relevante Modulation beschrieben. Nach Reifung mit LPS bewirkte Dasatinib 50 nM eine verminderte Expression der costimulatorischen Oberflächenmarker CD80 und CD86, sowie eine verminderte Sekretion von IL-12. Zusammenfassend zeigen unter Dasatinib generierte moDZs Eigenschaften, welche auch bei regulatorischen DZs beschrieben wurden. Eine Behandlung mit Dasatinib könnte folglich Immunantworten negativ modulieren. / The introduction of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) represents a hallmark of hemato-oncology in the 21st century. The BCR-Abl fusion transcript was identified as the pathognomonic correlate of the chronic myeloid leukemia (CML). Therapy with TKIs correlated with excellent remission rates as well as a good tolerability. As a second-generation TKI, dasatinib has a high affinity to the BCR-Abl fusion transcript and addresses as a multi-TKI several other targets, including the Src-family-kinases (SFKs). SFKs play an important role in regulating various immune cells. In some CML patients, TKI therapy can be interrupted and sustained remission is found. In this respect immunomodulatory effects of the TKIs were assumed. For dasatinib, immunomodulatory effects, e.g. on T and NK cells, have been demonstrated in vitro and in vivo. Within the scope of this work, possible immunomodulatory effects on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) were investigated in vitro. MoDCs were generated from monocytes of healthy blood donors by addition of IL-4 and GM-CSF. Dasatinib was added in clinically relevant concentrations (10-50 nM) from the beginning of DC generation and for selected experiments just before maturation with LPS. Possible effects of dasatinib on the generation of moDCs as well as important functions of immature (endocytosis) and mature DCs (expression of cellular and humoral effector functions) were then analyzed. Dasatinib hampered the generation of moDCs at a concentration of 50 nM. Phenotypically, a reduced expression of the DC marker CD1a was shown with a persistent expression of the monocytic marker CD14. Simultaneously a population of CD1a/CD14-coexpressing cells was found. Additionally an increase in apoptosis was demonstrated with dasatinib treatment. Dasatinib treatment did not affect macropinocytosis of FITC-conjugated dextran particles. Dasatinib 50 nM hampered the expression of CD80 and CD86, as well the secretion of IL-12 in LPS-matured moDCs. In summary, moDCs generated during dasatinib treatment show properties that have also been described in regulatory DCs. Treatment with dasatinib could therefore negatively modulate immune responses.

Ziel: Unter dem Tyrosinkinaseinhibitor Dasatinib haben sich bei Patienten Nebenwirkungen gezeigt, die eine immunmodulierende Wirkung des Medikamentes vermuten lassen. Diese Arbeit hatte daher zum Ziel die Auswirkungen von Dasatinib auf dendritische Zellen zu untersuchen. Material und Methoden: Es wurden dendritische Zellen mittels Zugabe von IL4 und GM-CSF aus Monozyten gesunder Spender generiert. Anschließend wurden die Zellen nach Zugabe von Dasatinib mit Zymosan (25 µg/ml) oder LPS (100 ng/ml)zur Ausreifung gebracht und die Phosphorylierung der Signaltransduktionsproteine p38, ERK, Akt, c-jun sowie die Translokation der NFkB-Bestandteile RelA und RelB in den Zellkern mittels Westernblot gemessen. Zudem erfolgt eine Konzentrationsbestimmung der sekretierten Interleukine 10 und 12 im Kulturmedium mittels ELISA. Ergebnisse: Dasatinib inhibierte die die Phosphorylierung der Kinasen p38 und ERK nach Stimulation mit LPS und Zymosan. Zudem kam es zu einer reduzierten Sekretion von Interleukin 10 und einer vermehrten Sekretion von Interleukin 12 unter Dasatinib nach Stimulation mit LPS. Fazit: Dasatinib verstärkt die Sekretion von Interleukin 12 und vermindert die Sekretion von Interleukin 10 in ausgereiften dendritischen Zellen durch Hemmung der Kinasen p38 und ERK, vermutlich indirekt vermittelt über Src-Kinasen. Dies könnte eine Erklärung für immunmodulatorische Effekte wie das Auftreten von Autoimmunerkrankungen und eine LGL-Expansion bei mit Dasatinib behandelten Patienten bieten. / Objective: The tyrosine kinase inhibitor Dasatinib has shown to cause side effect in patients, which suggest a immunomodulating effect of the drug. This study therefore aimed to examine the effects of Dasatinib on dendritic cells. Materials and methods: We generated dendritic cells out of monocytes of healthy individuals under the influence of IL4 and GM-CSF. We then added Dasatinib to the cell culture and induced maturation with zymosan (25 µg/ml) or LPS (100 ng/ml)and examined the phosphorylation of the signaling proteins p38, ERK, Akt and c-jun and the translocation of NFkB-members RelA and RelB into the nucleus with westernblot. We also measured the concentration of secreted interleukin 10 and 12 in the cell culture medium using ELISA. Results: Dasatinib inhibited the phosphorylation of p38 and ERK following LPS- and zymosan-induced maturation. It also enhanced the secretion of interleukin 12 and decreased the secretion of Interleukin 10 after LPS-induced maturation. Conclusion: Dasatinib enhances the secretion of interleukin 12 and inhibits the secretion of interleukin 10 in mature dendritic cells via reduced phosphorylation of p38 and ERK, probably indirectly via inhibition of Src-kinases. These results could provide an explanation for immunomodulating effect of Dasatinib observed in patients like autoimmune disorders and LGL-expansion.

Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erhältlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die jährlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer während der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer Störung der zellulären Immunantwort führt. Diese Immunsuppression begünstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten Ländern begleitet von mangelhafter ärztlicher Versorgung und Unternährung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion führt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Auslösung einer primären, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und könnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tatsächlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-Stämme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypstämme im Vergleich mit Vakzinestämmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem stärkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen führte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schlüsselzytokin für die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) führten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verstärkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytohämagglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten. / Measles virus (MV) is a member of the paramyxoviridae. Despite the existence of a effective attenuated life vaccine measles still remains a important infectious disease which causes the death of over one million people each year. Although a protective and MV-specific immune response is generated during the infection MV induces a profound general immunosuppression disturbing the cellular immune system. This immunosuppression favours bacterial and viral secondary infections which especially in developing countries when accompanied by insufficient medical care and malnutrition leads to a fatal outcome of MV infections. The molecular basis underlying this MV-associated immunosuppression is hardly understood. Dendritic cells (DC) are now seen as a link between the innate and the adaptive immune system. They are decisively involved in the induction of a primary adaptive T cell response. In the case of MV infection DC might play a role both in establishing a MV specific and protective immune response and in inducing the MV-associated immunosuppression.. Indeed, DC generated in vitro using human monocytes from peripheral blood (MoDC) can be infected with MV strains. Compared with vaccine strains so called wildtype strains showed faster infection kinetics and a more pronounced cytopathic effect (CPE) in infected MoDC cultures. Additionally, infection of MoDC cultures led to activation and maturation of the cells resulting in upregulation of costimulatory molecules and secretion of proinflammatory cytokines. Besides tumour necrosis factor alpha (TNF-a) type I interferon (IFN) could be found which induced the expression of the costimulatory surface molecule CD86. Furthermore, MV infection influenced the secretion of interleukin 12 (IL-12) which is recognised as being a key regulator in the polarisation of T cell responses. Infections with the prototypic vaccine strain ED-B resulted in a drastic reduction or repression of the amount of IL-12 released under all conditions tested. Instead, a infection with the MV wildtype strain WTF induced IL-12 secretion by MoDC without additional stimulation and enhanced the secretion of IL-12 after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). In spite of the observed activation of MoDC after infection with MV in a functional assay, the allogenic mixed leukocyte reaction (MLR), these cultures induced no T cell proliferation. The lack of T cell proliferation correlated with the number of MV-infected MoDC. In addition, MV-infected MoDC cultures blocked the proliferation of T cell cultures stimulated with phytohemagglutinin (PHA) or staphylococcus enterotoxin A (SEA). This dominant inhibitory effect was absent when MoDC cultures were infected with recombinant MV lacking the MV specific glycoproteins H and F.