Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:20:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cappelli_AnaPaulaGameiro_M.pdf: 8746314 bytes, checksum: fffd531f3decda018f572cfc7c7f2be6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A desnutrição protéica promove redução da secreção de insulina devida inúmeras alterações moleculares nas células B pancreáticas. Recentemente foi demonstrado que o estado redox pode modular a secreção de insulina em condições fisiológicas. No entanto, a correlação entre as alterações no estado redox e na secreção de insulina em ratos submetidos à desnutrição protéica não é conhecida. Assim, nosso objetivo foi avaliar o impacto do estresse oxidativo na secreção de insulina em ilhotas de ratos desnutridos. Ratos machos Wistar foram tratados com dieta normoprotéica (NP-17%) ou hipoprotéica (LP-6%) por 60 dias. Após isolamento das ilhotas, foi medida atividade e o conteúdo protéico das enzimas antioxidantes SOD, GPx e a CAT. Para a secreção estática de insulina, as ilhotas foram pré-incubadas em 5.6 mM de glicose (GLI) com ou sem H2O2, na ausência ou presença de n-acetil cisteína (NAC) e posteriormente incubadas em diferentes concentrações de GLI. Observamos aumento da atividade da SOD (21.18±2.1-30.5.±2 µmoles/min/mg proteína NP-LP respectivamente), redução na CAT (9±1.2-5.22±0.73 µmoles/min/mg proteína NP-LP respectivamente) e nenhuma alteração na GPx em ilhotas de ratos desnutrido comparada com ilhotas de ratos controle. Apesar de observarmos tendência de aumento no conteúdo protéico das enzimas antioxidantes em LP, não houve diferença significativa de nenhuma das enzimas. A secreção de insulina de ratos LP que ficaram expostas a 33mM de glicose na incubação, retornou a níveis basais (GLI 2.8 mM) quando préincubado com 100 µM de H2O2, enquanto para as ilhotas de ratos controle foi necessário a adição de 300 ?M de H2O2 na pré-incubação para retornar aos níveis basais. Na presença de 10 mM de NAC + 150 µM de H2O2, durante a pré-incubação, e posterior incubação em 33 mM de glicose, observou-se redução significante da secreção de NP e aumento em LP. Estes resultados sugerem que as ilhotas pancreáticas de ratos desnutridos pré tratadas com H2O2 e posteriormente expostas a altas concentrações de glicose, são mais sensíveis ao H2O2 possivelmente devido à capacidade reduzida de detoxificação de espécies reativas de oxigênio (EROS). / Abstract: Protein malnutrition induces pacreatic B-cells molecular alterations, reducing insulin secretion. It has been recently demonstrated that redox status may control insulin secretion under physiological conditions. However, protein malnutrition effects in redox modulation of insulin secretion is unknown. Thus, our aim was to evaluate oxidative stress impact upon insulin secretion in isolated islets from protein undernourished rats. Male Wistar rats were treated with normoproteic diet (NP-17%) or with a low protein diet (LP-6%) for sixty days. After islets isolation, it was measured antioxidant enzymes SOD, GPX and CAT activities and protein content. For insulin secretion measurement, islets were pre-incubated with glucose 5.6 (GLI) mM with or without H2O2 at the presence and absence of N-acetyl-cisteyne (NAC) and after that islets were incubated with diferent GLI concentration. SOD and CAT activities were significant increased (21.18±2.1-30.5.±2 µmoles/min/mg protein for NP-LP respectively) and decreased (9±1.2-5.22±0.73 µmoles/min/mg protein for NP-LP respectively) respectively, whereas GPX did not show any alteration. Despite a tendency of increase in the LP protein content of antioxidant enzymes, no significant differences were observed. When incubated with glucose 33mM, LP insulin secretion returned to baseline values (GLI 2.8 mM) when it was pre-incubated with H2O2 100 µM, whereas NP islets returned to baseline levels when pre-incubated with H2O2 300 ?M. When islets were pre-incubated with NAC 10 mM + H2O2 150 µM and further incubated with glucose 33 mM, insulin secretion was reduced in NP, whereas in LP it was increased. Taken together, these datasuggest that pancreatic islets from undernourished rats when pre-treated with H2O2 and thereafter challenged with high glucose concentrations are more sensitive to H2O2, probably due to their lower capacity to detoxify reactive oxygen species (ROS). / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marlene Aparecida Schiavinato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T08:26:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PinzonTorres_JavierAlberto_D.pdf: 1532904 bytes, checksum: 9f5bb662cffba52fd08c58de00484c25 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As grandes quantidades de poluentes gasosos que as áreas urbano-industriais emitem contribuem para a degradação de ecossistemas com subseqüentes declínios na vegetação. A fotossíntese é um dos primeiros processos alterados pela ação destes poluentes e o dióxido de enxofre (SO₂), por ser um dos poluentes aéreos mais freqüentes e nocivos, afeta drasticamente a atividade fotossintética e causa graves injúrias nos tecidos foliares. O SO₂ difunde-se tão prontamente quanto o CO₂ para o interior da folha através dos estômatos e, na fase aquosa da câmara subestomática, se solubiliza formando bisulfito e sulfito, que são espécies iônicas de ação oxidante altamente agressiva para a célula. O sulfito, se não for rapidamente oxidado para sulfato em presença da luz, compete com o CO₂ tornando-se um inibidor da fixação fotossintética, enquanto que o bisulfito pode reagir com aldeídos e cetonas, formando hidroxisulfonatos, que são inibidores de várias enzimas. Durante a oxidação aeróbica dos sulfitos e bisulfitos há aumento da concentração de radicais livres que, se não forem exauridos rapidamente por enzimas de destoxificação, podem causar peroxidação dos ácidos graxos insaturados, ruptura dos lipídeos hidroperóxidos e co-oxidação das clorofilas nos cloroplastos. A resistência da planta à ação tóxica do SO₂ sugere vários mecanismos, dentre as quais se destacam: a redução da absorção de SO₂ por meio do fechamento estomático; a oxidação do sulfito a sulfato com posterior armazenamento do sulfato no vacúolo e incorporação ao metabolismo normal sob forma orgânica; e a eliminação pelo sistema antioxidante das peroxidases e da superóxido dismutase. Se um excesso de enxofre é absorvido e a concentração de tióis aumenta, o enxofre poderá ser acumulado na forma de glutationa, que é um tripeptídeo com uniões sulfídricas, ou os excessos de grupos sulfídricos e sulfitos poderiam ser convertidos em sulfetos ou perdidos na forma de ácido sulfídrico, por meio de trocas gasosas, retirando enxofre do metabolismo da planta. O objetivo do trabalho foi estudar os mecanismos imediatos de defesa e recuperação da taxa fotossintética em plantas de Centrolobium tomentosum sob condições de estresse induzido por SO₂, antes que algum tipo de injúria foliar ou fitotoxicidade, como clorose ou necrose foliar, se tornassem visíveis. Para isto, uma câmara de indução foi especialmente construída, de modo a permitir coletar amostras foliares in vivo, enquanto o estresse estava acontecendo. Dentro da câmara de indução foi colocada uma espécie nativa, Centrolobium tomentosum, que havia sido mantida até então sob condições ambientais naturais, na casa de vegetação do Departamento de Fisiologia Vegetal (Unicamp). Os ensaios com SO₂ foram realizados na câmara de indução, em sistema fechado, e esta foi mantida em uma câmara de crescimento, sob condições controladas de luz, temperatura e umidade. Plantas de C. tomentosum entre oito meses e um ano de idade foram submetidas a diferentes concentrações de SO₂ com a finalidade de determinar a concentração mínima de SO₂ capaz de induzir, na taxa fotossintética, a sucessão das fases características de uma dinâmica de estresse. Foram utilizadas cinco plantas diferentes por cada concentração de SO₂ aplicada e registrou-se a taxa fotossintética utilizando um Sistema Portátil de Análise de Gases por Infravermelho (IRGA). Nas mesmas folhas foram analisados antioxidantes do tipo não enzimático (pigmentos fotossintéticos e ácido ascórbico) e antioxidantes do tipo enzimático (superóxido dismutase e glutationa redutase). Foi determinado que a concentração mínima para induzir a dinâmica de estresse em plantas de C. tomentosum foi de 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³, que equivale a uma concentração muito alta com relação às concentrações máximas recomendadas pelas organizações governamentais para o controle de poluição de ar. A sucessão de fases na taxa fotossintética foram as seguintes: - Taxa fotossintética antes da aplicação do SO&#8322: nesta fase, a taxa fotossintética registrou uma média de 4,4 μmol CO&#8322 m­­­­­ֿ² s­­­­­ֿ¹. Foram tomadas amostras foliares, cujas análises corresponderam ao controle. - Fase de alarme: iniciada imediatamente após a aplicação de 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³ e caracterizada por uma queda abrupta na taxa fotossintética de 92%. Posteriormente, veio o estresse propriamente dito, com registros muito baixos na taxa fotossintética. - Fase de restituição: na qual se observou a recuperação paulatina da taxa fotossintética. Fase de resistência: na qual, após 9 h da exposição ao SO₂, a taxa fotossintética registrou recuperação de 50%. Após 24 h do ensaio ter sido iniciado, a taxa fotossintética registrou os valores iniciais correspondentes ao controle, ou seja, uma recuperação completa. Em todas as fases, com exceção da fase de restituição, foram tomadas amostras foliares. Não foram observados sintomas de clorose ou necrose nas folhas de C. tomentosum após a exposição ao SO₂ e as análises químicas dos pigmentos fotossintéticos corroboram esta observação. Porém, nas fases de estresse e de recuperação completa, os teores de carotenóides aumentaram com relação ao controle. O incremento do ácido ascórbico teve a mesma tendência do que o dos carotenóides nas fases de estresse e de recuperação completa. A atividade da superóxido dismutase aumentou significativamente na fase de estresse, enquanto que a atividade da glutationa redutase aumentou significativamente na fase de recuperação completa. A dinâmica de estresse e o mecanismo imediato de destoxificação em plantas de C. tomentosum submetidas a 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³ sugerem que efetivamente houve um estresse oxidativo, que foi superado da seguinte maneira: na fase de alarme, o sulfito reagiu com a ribulose bisfosfato antes que fosse foto-oxidado para sulfato. Isto explica a inibição da carboxilação, com a queda abrupta da taxa fotossintética. Os oxi-radicais livres citotóxicos gerados nos cloroplastos, como conseqüência da foto-oxidação dos sulfitos, foram exauridos rapidamente pelo aumento, na fase de estresse, dos carotenóides e do ácido ascórbico e pelo aumento da atividade da superóxido dismutase. Porém, o enxofre proveniente do SO₂ não foi imediatamente acumulado na forma de glutationa. Isso somente ocorreu quando a planta recuperou completamente a taxa fotossintética. Desta maneira, verificou-se que C. tomentosum é uma espécie resistente que poderia ser utilizada em espaços onde as emissões de SO₂ são altas, como nas indústrias químicas, petroquímicas, siderúrgicas e de fertilizantes, dentre outras. / Abstract: Large quantities of gaseous pollutants emited by urban-industrial areas emit contribute to the degradation of ecosystems with subsequent declines in vegetation. The photosynthesis is one of the first processes altered by the action of these pollutants and sulphur dioxide (SO₂), as one of the most common and harmful air pollutants, drastically affect the photosynthetic activity and cause serious injuries in the leaf tissue. The SO₂ diffuses itself as promptly as the CO₂ into the leaf through the stomata, and in the aqueous phase of the substomatal cavity it solubilizes forming bisulphite and sulphite, which are ionic species of highly aggressive oxidant action to the cell. Sulphites, if it is not quickly oxidized to sulphate in the presence of light, it competes with CO₂ becoming an inhibitor of photosynthetic fixation, while the bisulphite can react with aldehydes and ketones, forming hidroxisulphonates, which are inhibitors of several enzymes. During the aerobics oxidation of sulphites and bisulphites there are increase in the concentration of free radicals that cause peroxidation of unsaturated fatty acids, lipid hydroperoxides and disruption of co-oxidation of chlorophylls in chloroplasts, if not quickly eliminated by enzymes of detoxification. The resistance of the plant to the toxic action of SO₂ suggests several mechanisms, among which stand out: the reduction of SO₂ absorption through the stomatal closure, the oxidation of sulphite to sulphate with the subsequent storage of sulphate inside the vacuole and the incorporation in the normal metabolism in organic way, and the scavenging by antioxidant system of peroxidases and superoxide dismutase. If an excess of sulphur is absorbed and the concentration of thiols increase, the sulphur may be accumulated in the form of glutathione, which is a tripeptide with sulphidric bindings, or the excesses of sulphidric groups and sulphites could be converted into sulfides or lost in the form of sulphidric acid, through gas exchange, removing the sulphur from the metabolism of the plant. The objective was to study the mechanisms of immediate protection and recovery of the photosynthetic rate in plants of Centrolobium tomentosum under conditions of stress induced by SO₂, before some kind of leaf injury or phytotoxicity, like chlorosis or leaf necrosis, became visible. For this, an induction chamber has specially been constructed to allow collect of leaf samples in vivo, while the stress was happening. Inside the induction chamber it was put a native species, Centrolobium tomentosum, which had been kept under natural environmental conditions at a greenhouse of the Department of Plant Physiology (UNICAMP). The tests were conducted with SO₂ in the chamber of induction, in a closed system, and this was maintained in a growth chamber, under controlled light, temperature and humidity conditions. Plants of C. tomentosum between eight months and one year old were submited to different concentrations of SO₂ in order to determine the lowest concentration of SO₂ capable to induce, in the photosynthetic rate, the succession of phases that are characteristics of a dynamics of stress. There were used five different plants for each concentration of SO₂ applied, and the photosynthetic rate was recorded using a Portable System for Analysis of gases by Infrared (IRGA). In the same leaves, non-enzymatic antioxidants (photosynthetic pigments and ascorbic acid) and enzymatic antioxidant (superoxide dismutase and glutathione reductase) were analysed. It was determined that the lowest concentration to induce the dynamics of stress in plants of C. tomentosum was 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³, which represents a very high concentration regarding the maximum concentrations recommended by governmental organizations to the air pollution control. The succession of phases in the photosynthetic rate was as follows: - Photosynthetic rate before the implementation of SO₂: at this stage, the photosynthetic rate recorded an average of 4.4 μmol CO₂ m­­­ֿ² sֿ¹. Leaf samples were taken, whose analyses correponded to the control. - Phase of alarm: it has begun immediately after the injection of 258,07 g SO₂ m­ֿ³ characterized by the sharp fall in the photosynthetic rate of 92%. Then the stress itself begun, with very low records in photosynthetic rate. - Phase of restitution: in which there was observed the gradual recovery of the photosynthetic rate. - Phase of resistance: in which, after 9 hours of exposure to SO₂, the photosynthetic rate recorded recovery of 50%. After 24 hours of the beginning of the assay, the photosynthetic rate recorded the initial value corresponding to the control, that is, a complete recovery. In all stages, except in the stage of restitution, leaf samples were taken. There were no symptoms of chlorosis or necrosis in the leaves of C. tomentosum after exposure to SO₂ and chemical analysis of photosynthetic pigments corroborate to this observation. However, in stages of stress and complete recovery, the levels of carotenoids increased in relation to the control. The increase of ascorbic acid had the same trend of that of carotenoids in stages of stress and complete recovery. The activity of superoxide dismutase increased significantly in the stage of stress, while the activity of glutathione reductase increased significantly during the complete recovery. The dynamics of stress and the immediate mechanism of detoxification in plants of C. tomentosum submitted to 258,07 g SO₂ m­­­­­ֿ³ suggest that effectively there was actually an oxidative stress, which was overcame in the following way: during the alarm, the sulfite reacted with ribulose bisphosphate before the photo-oxidation to sulphate. This explains the inhibition of carboxylation, with a sharp decrease in the photosynthetic rate. The citotoxic free radicals generated in the chloroplasts, as a result of the photo-oxidation of sulphites, were quickly scavenged by the increase, in the phase of stress, of carotenoids and ascorbic acid and the increasing activity of superoxide dismutase. However, the sulphur from SO₂ has not been immediately accumulated in the form of glutathione. It only occurred when the plant recovered completely the photosynthetic rate. Thus, it was found that C. tomentosum is a resistant species that could be used in areas where SO₂ emissions are high, as in the chemical, petrochemical, steel and fertilizers factories, among others. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil) e outros nitróxidos cíclicos reduzem a injúria tecidual em modelos animais de inflamação por mecanismos que não são completamente entendidos. A mieloperoxidase (MPO) tem um papel fundamental na produção de oxidantes por neutrófilos e, portanto, é um importante alvo para anti-inflamatórios. Ao amplificar o potencial oxidativo do H2O2, a MPO produz HOCl e radicais livres através de seus intermediários oxidantes MPO-I [MPO-porfirina•+-Fe(IV)=O] e MPO-II [MPO-porfirina-Fe(IV)=O]. Esses fatos nos levaram a sintetizar e avaliar a capacidade inibitória sobre a atividade clorinante da MPO in vitro e in vivo do tempol e de três derivados hidrofóbicos substituídos na posição 4 do anel piperidina [(4-azido, 4-benzenosulfonil e 4-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)]. In vitro, todos os nitróxidos inibiram a clorinação da taurina mediada pela MPO a pH 7,4 com valores similares de IC50 (1,5-1,8 µM). As constantes cinéticas das reações do tempol com MPO-I (k = 3,5 x 105 M-1 s-1) e MPO-II, cuja cinética indicou um comportamento de saturação (K= 2,0 x 10-5 M; k = 3,6 x 10-2 s-1), foram determinadas. Modelagens cinéticas indicaram que, em presença de taurina, MPO não produz HOCl livre. Tomados conjuntamente, os resultados indicaram que o tempol age principalmente como um inibidor reversível da MPO por levar ao acúmulo de MPO-II e de complexo [MPO-II-tempol] que não participam do ciclo clorinante. Para examinar se nitróxidos inibem a atividade da MPO in vivo selecionamos como modelo a inflamação aguda induzida pela carragenina na pata de ratos. A atenuação da inflamação na pata mostrou correlação com a lipofilicidade do nitróxido em tempos iniciais, mas as diferenças nos efeitos foram pequenas (menor que 2 vezes) quando comparadas com as diferenças de lipofilicidade (maior que 200 vezes). Nenhuma inibição da atividade da MPO foi evidente in vivo porque os níveis de atividade nas patas dos ratos correlacionaram com os níveis de MPO. Do mesmo modo, em animais não-tratados ou tratados com nitróxidos, todos os parâmetros empregados para monitorar a inflamação (edema, níveis de proteínas oxidadas e nitradas e exsudação plasmática) correlacionaram com os níveis de MPO. Os efeitos dos nitróxidos in vivo foram também comparados com aqueles da hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (ABAH) e da colchicina. Tomados conjuntamente, os estudos in vivo indicaram que os nitróxidos atenuam a inflamação induzida pela carragenina principalmente por inibirem a migração celular. De acordo com essa conclusão, estudos in vivo, mostraram que tempol diminuiu a migração de neutrófilos humanos e de cultura (HL-60 diferenciadas em neutrófilos) ativados com PMA ou fMLP com IC50 25 µM. Nesse caso, a polimerização da actina é inibida apenas quando as células são pré-incubadas com tempol por 30 min. Nesse intervalo de tempo, o tratamento com tempol promove a formação de O2•- via flavoenzimas de maneira dependente da concentração. Subsequente ativação dos neutrófilos de cultura com PMA resulta também em produção intracelular de O2•- e H2O2 que é inibida pelo pré-tratamento com tempol (IC50 = 38 µM). Esses estudos preliminares sugerem que o tempol interfere na migração celular de neutrófilos por atenuar a formação intracelular de ROS. A importância da atividade peroxidásica da superóxido dismutase (hSOD1) in vivo é certamente muito mais restrita do que a da MPO em processos inflamatórios no geral. Todavia, essa atividade peroxidásica da hSOD1 pode ter um papel na na patogenia da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Por essa razão, os efeitos do tempol sobre as consequências da atividade peroxidásica da hSOD1 (oxidação, dimerização, desenovelamento e agregação da enzima) também foram examinadas. Foi demonstrado que o tempol não interfere no ciclo catalítico da hSOD1, porém, inibe a dimerização da enzima, protegendo-a de desenovelamento e agregação. O nitróxido foi consumido no processo reagindo com o radical triptofanila no peptídeo 31VWGSIK36 como comprovado por MS. No conjunto, nossos estudos contribuem para esclarecer os múltiplos mecanismos pelos quais nitróxidos podem inibir processos oxidativos e inflamatórios. / Tempol (4-hydroxy-2 ,2,6,6-tetramethyl piperidine-1-oxyl) and other cyclic nitroxides reduce tissue injury in animal models of inflammation by mechanisms that are not fully understood. Myeloperoxidase (MPO) plays a key role in the production of oxidants by neutrophils and therefore is an important target for anti-inflammatory drugs. By amplifying the oxidative potential of H2O2, MPO produces HOCl and free radicals through its oxidizing intermediates MPO-I [MPO-porphyrin•+-Fe (IV)=O] and MPO-II [MPO-porphyrin-Fe (IV)=O]. In this context, we synthesized tempol and three more hydrophobic derivatives substituted in position 4 of the piperidine ring [(4-azido-4 benzenesulfonyl and 4-(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)] and evaluated their ability to inhibit the chlorinating activity of MPO in vitro and in vivo. In vitro, all the nitroxides inhibited the chlorination of taurine mediated by MPO at pH 7.4 with similar IC50 values (1.5 to 1.8 µM). The kinetic constants of the reactions of tempol with MPO-I (k = 3.5 x 105 M-1 s-1) and MPO-II, whose kinetic indicated a saturation behavior (K = 2.0 x 10-5 M; k = 3.6 x 10-2 s-1), were determined. Kinetic modeling indicated that in the presence of taurine, MPO does not produce free HOCl. Taken together, the results indicated that tempol acts primarily as a reversible inhibitor of MPO leading to accumulation of MPO-II and of the complex [MPO-II-tempol], which do not participate within chlorinating cycle. To examine whether nitroxides inhibit the activity of MPO in vivo, the acute inflammation induced by carrageenan in the rat paw was selected as model. The attenuation of inflammation in paws was correlated with the lipophilicity of the nitroxide in early times, but the differences in effects were small (less than 2-fold) when compared to the differences in lipophilicity (higher than 200 times). No inhibition of MPO activity was evident because the levels of activity in rat paws correlated with the levels of MPO. Similarly, in animals not treated or treated with nitroxides, all parameters used to monitor inflammation (swelling, levels of oxidized and nitrated proteins and plasma exudation) correlated with the levels of MPO. The effects of nitroxides in vitro were also compared with those of 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) and colchicine. Taken together, the in vivo studies indicated that nitroxides attenuate carrageenan-induced inflammation mainly by inhibiting cell migration. According to this conclusion, in vitro studies showed that tempol decreased migration of human and culture neutrophils (HL-60 differentiation to neutrophils) activated with PMA or fMLP with IC50 = 25 µM. In this case, actin polymerization is inhibited only when cells are preincubated with tempol for 30 min. During this time interval, treatment with tempol promotes the formation of O2•- via flavoenzymes in a concentration-dependent manner. Subsequent activation of culture neutrophils with PMA also results in intracellular production of O2•- and H2O2, which is inhibited by pretreatment with tempol (IC50 = 38 µM). These preliminary studies suggest that tempol interfere in neutrophil chemotaxis by attenuating the formation of intracellular ROS. The relevance of the peroxidase activity of superoxide dismutase (hSOD1) in vitro is certainly much narrower than that of MPO. Nevertheless, this peroxidase activity may have a role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, the effects of tempol on the consequences of the hSOD1 peroxidase activity (oxidation, dimerization, unfolding and aggregation of the enzyme) were also examined. Tempol inhibited the dimerization of hSOD1, protecting it from unfolding and aggregation, but not interfered in its catalytic cycle. The nitroxide was consumed in the process by reacting with the tryptophanyl radical of the segment 31VWGSIK36 as evidenced by MS. Overall, our studies contribute to clarify the multiple mechanisms by which nitroxides can inhibit oxidative and inflammatory processes.

Embora a citricultura seja uma importante atividade econômica no Brasil, nos últimos anos houve uma redução significativa da produção nacional. A baixa rentabilidade que o setor citrícola vem enfrentando, devido ao alto custo de produção, é decorrente principalmente dos problemas fitossanitários, com destaque para as doenças, que afetam diretamente a produtividade dos pomares. Atualmente, o huanglongbing (HLB) é a doença mais grave que afeta a citricultura mundial, sendo que os danos são severos em todas as variedades de citros. Diante desse fato, a transformação genética de plantas é uma alternativa para a obtenção de plantas transgênicas, com genes que estimulem o sistema de defesa das plantas, tornando-as resistentes a doenças. Apesar da eficácia dos protocolos existentes para a transformação genética de citros, uma desvantagem característica de plantas perenes é o ciclo reprodutivo lento, tornando difícil e demorado a validação de novos genes de interesse. Por isso, uma importante estratégia é o uso de plantas modelos, como o tomateiro, que possui ciclo curto e boa eficiência de transformação genética. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' e Citrus sinensis, contendo a construção gênica com o gene Csd1 (superóxido dismutase do cobre e do zinco), isolado de Poncirus trifoliata. A proteína codificada pelo gene Csd1, também conhecido como Sod1 (superoxide dismutase 1), é o mais potente antioxidante na natureza e é um importante constituinte de defesa celular contra o estresse oxidativo causado pela infecção bacteriana. O tomateiro Micro-tom foi utilizado como modelo de patogenicidade para validação do gene. Porém, devido a sua baixa eficiência de transformação genética, os experimentos de inoculação com o patógeno não foram realizados. Posteriormente, a caracterização da função do gene Csd1 em relação ao HLB será realizada com as plantas transgênicas de citros. A identificação de plantas transgênicas, de tomate e de laranja doce, foi realizada por meio da análise de PCR, utilizando primers para a detecção do gene Csd1. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A eficiência de transformação genética do tomateiro \'Micro-Tom\' e das cultivares de laranja doce, \'Hamlin\' e \'Pineapple\', foram respectivamente: 0,34%, 4,74% e 3,65%. A caracterização molecular pelas análises de Southern blot e RT-qPCR foi realizada apenas em plantas de citros. Foi possível confirmar a integração do transgene em 32 eventos obtidos. O número de eventos de inserção variou de 1 - 5, sendo a presença do gene endógeno Csd1, localizada em 3 locais distintos no genoma das plantas. O nível de mRNA do transgene foi verificada em 21 plantas que tiveram apenas uma única inserção do transgene no genoma. Os resultados obtidos mostram que houve transcrição do gene Csd1 nas plantas transgênicas, assim como, na testemunha não transgênica. A relação do nível de transcrição do transgene com a resistência das plantas ao patógeno será definida após a inoculação com Candidadus Liberibacter. / Although the citrus industry is an important economic activity in Brazil, in recent years there has been a significant reduction in the national citrus production. The low profitability of the citrus sector has faced due to the high production cost is mainly attributed to phytosanitary problems, particularly diseases that directly affect productivity of orchards. Currently, huanglongbing (HLB) is the most serious disease that affects the global citrus industry and the damage is severe in all citrus varieties. Genetic transformation of plants is an alternative to obtain transgenic plants with genes that stimulate the plant defense system, making it resistant to diseases. Despite the effectiveness of protocols for genetic transformation of citrus, a characteristic disadvantage of perennial plants is the slow reproductive cycle, hindering validation of new genes of interest. Therefore, an important strategy is the use of model plants, such as the tomato, which has a short cycle and good genetic transformation efficiency. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \"Micro-Tom \'and Citrus sinensis, containing the gene construct with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata. The protein encoded by the gene Csd1, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), is the most powerful antioxidant in nature and is important constituent of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. \'Micro-tom\' tomato was used as a model for pathogenic gene validation. However, due to its low efficiency of genetic transformation, the inoculation experiments with the pathogen were not realized. Posteriorly, the characterization of gene function Csd1 in relation to the HLB disease will be realize with citrus transgenic plants. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' and of Citrus sinensis, containing the gene construction with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata, for validation and for future study of this gene for resistance to HLB. Proteins encoded by the Csd1 gene, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), are the most powerful antioxidants in nature and are important constituents of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. The identification of transgenic plants of tomato and sweet orange was performed by the PCR analysis using primers for the detection of Csd1 gene. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to a greenhouse. The genetic transformation efficiency of tomato \'Micro-Tom\' and sweet orange cultivars, \'Hamlin\' and \'Pineapple\', were 0.34%, 4.74% and 3.65%, respectively. The molecular characterization with the Southern blot and RT-qPCR analyses was performed only in citrus plants. The transgene integration was confirmed in 32 plants. The number of insertion events ranged from 1-5 and the presence of Csd1 endogenous gene is found in three distinct locations in the plants genome. The mRNA level of the transgene was verified in 21 plants that had only a single transgene insertion into the plant genome. The results show that there was transcription of Csd1 gene in transgenic plants as well as in non-transgenic plants. The relation between the transgene transcript level with the resistance of plants to pathogens is set after inoculation with Candidadus Liberibacter.

O estresse oxidativo, causado por níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio (ROS), pode causar danos celulares. Várias enzimas, como as subunidades da alquil-hidroperóxido redutase (AhpC e AhpF) e as superóxido dismutases (SOD), são responsáveis por remover as ROS. Os mecanismos de regulação da expressão gênica de C. crescentus para os genes ahpC, sodA, sodB e sodC, foram analisados com fusões de transcrição ao gene repórter lacZ, permitindo a quantificação da expressão por ensaios da atividade de b-galactosidase, e RT-PCR quantitativo. As culturas foram cultivadas em meio PYE ou M2 e a expressão de cada gene foi avaliada na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (tBOOH), paraquat, menadiona, pirogalol, FeSO4 ou DDPi. Em C. crescentus ahpC é induzido por peróxidos e regulado por OxyR. As SODs são induzidas principalmente por superóxidos, sodB e sodC possuem indução de fase na fase estacionária e possivelmente estão sob o controle do sigma J, enquanto o gene sodA é regulado por sigma F e sigma J. / Oxidative stress, caused by increased levels of reactive oxygen species, can lead to damage in all cellular components. Several enzymes, as subunit of alkyl hydroperoxide reductase (AhpC and AhpF) and superoxide dismutases (SOD), are responsible for removing ROS. Mechanisms of gene expression of C. crescentus for genes ahpC, sodA, sodB and sodC, were evaluated with transcription fusions with the lacZ reporter gene were constructed, allowing the quantification of expression by b-galactosidase activity assays, furthermore we analyze of the gene expression by qRT-PCR assay. The cultures were grown in PYE and M2 media, and gene expression was evaluated in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (tBOOH), paraquat, menadione, pyrogallol, FeSO4 or DPPi. In C. crescentus ahpC is induced by peroxides and is under the control of OxyR. The SODs are mainly induced by superoxide, sodB and sodC are induction in stationary phase and are possibly under the control of sigma J, while the sodA gene is regulated by sigma F and sigma J.

Foi demonstrado o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) na patogênese de algumas retroviroses, levando muitas vezes à progressão e/ou persistência das mesmas. No entanto, o papel das espécies reativas de oxigênio resultante da modulação do sistema antioxidante, e seu envolvimento na infecção de bovinos naturalmente infectados pelo VLEB, até o presente trabalho, não tinha sido ainda investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou-se avaliar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo VLEB em bovinos naturalmente infectados, associado ou não ao estabelecimento da linfocitose persistente (LP). Assim, a avaliação do estresse oxidativo se deu pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase, e pela atividade antioxidante total; e a resposta imune pela quantificação das subpopulações de linfócitos, função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leuccitos polimorfonucleares, morte celular e proliferação linfocitária, além da avaliação hematológica e sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB). Os resultados do presente estudo apontaram para o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina, dado pela menor concentração de glutationa peroxidase e a tendência a menor atividade da superxido dismutase eritrocitárias nos animais infectados pelo VLEB, não podendo, contudo, ser associado à fase da infecção. Ademais, os marcadores de estresse oxidativo não apresentaram alterados nem sequer a atividade antioxidante total destes animais. Além disso, o presente trabalho apontou para menor proliferação de linfócitos e redução da apoptose de células CD5+ nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, corroborados pelo significante aumento da população de linfcitos B (CD21+), e dos principais co-marcadores das células infectadas, no caso células CD5+ e CD11b+, nestes animais. No entanto, não observou diferenças significativas na população de linfócitos T destes animais, nem sequer alteração da capacidade fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pela população de leucócitos polimorfonucleares nos animais infectados. / Abundant observations of multiple pathogenic interactions between reactive oxygen species (ROS) and the pathogenesis of some retroviruses have drawn attention to role of ROS on disease progression and/or persistence of infection. Therefore, the role of the oxidative stress resulted from the modulation of the antioxidant system in dairy cows naturally infected with BLV has not been studied yet. So, the present study tries to investigate the involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV associated or not with the persistent lymphocytosis (PL). Thus, the oxidative stress was evaluated by the malondialdehyde, reduced glutathione content, and by the activity of glutathione peroxidase and superoxide dismutase, and also total antioxidant activity. The immune response was also evaluated by the quantification of lymphocyte subsets, lymphocyte proliferation, polymorfonuclear leukocytes phagocytosis and intracellular hydrogen peroxide production, and cell death. The results of the present work point out to an involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV, given by a lower glutathione peroxidase activity and also a tendency towards lower superoxide dismutase activity, but it can be not associated with PL. Futhermore, the oxidative stress markers and also the total antioxidant status was not altered in infected animals. The present study also showed a lower lymphocyte proliferarion and apoptosis rates of CD5+ cells, strengthen by a higher B cells (CD21+) counts and also by a significant augment of CD5+ and CD11b+ positive cells that are often co-expressed by the infected cells. Although, no significant difference was observed in T cells counts. Moreover, the phagocytosis rates and the intracellular hydrogen peroxide production by the polymorphonuclear leukocytes are not altered in BLV infected dairy cows.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction: manganese dependent superoxide dismutase (SOD2), is an important antioxidant enzyme, superoxide dismutase to anion produced in mitochondria in hydrogen peroxide, which in turn is catalyzed by glutathione peroxidase (GPX) into water and oxygen. Although be crucial for healthy cell, the role of SOD2 in cancer is highly controversial because in some kinds of cancers this enzyme exhibits a marked antitumor activity, while in others have a pro-tumor role. Previous investigations involving a polymorphism in codon 16 of SOD2 gene in which there is an exchange of a valine with an alanine (Val16Ala-SOD2) have associated increased efficiency of enzyme SOD2 at high risk of some cancers. However, in certain types of tumors, such as colorectal cancer are conflicting results. Studies suggest that high levels in tumor cells SOD2 colorectal cancers are associated with tumor progression. Perhaps this difficulty in defining the role of SOD2 in colorectal cancer biology is linked to great influence of environmental factors on the gastrointestinal system, especially the diet. For this reason, the development of an unbalance pharmacological model to investigate the role of superoxide-anion imbalance hydrogen peroxide (Superoxide Anion Hydrogen Peroxide imbalance, AS-HP) in colorectal cancer may be relevant. Objective: This study investigated the in vitro effect of drug-AS-HP imbalance caused by exposure to paraquat and the porphyrin in the viability and proliferative rate of commercial line of colorectal cancer cells (HT-29) and the response of these cells to chemotherapy oxaliplatin. The study also assessed the effect of AS-HP unbalance in the modulation of the expression of apoptotic genes, cell cycle and oxidative in HT-29 cells. Methods. HT- 29 obtained from American Type Cell Culture Collection (ATCC) were grown in DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% antibiotic and antifungal in an oven with 5% CO2 and 37 ° C temperature. After 24 h the transfer of cells to 96-well plates at a concentration of 10 5 cells per well were exposed to these concentrations of 0.1 uM paraquat which is a superoxide-generating molecule or porphyrin which is a molecule with a similar effect SOD2 enzyme. Part of the cells was treated with oxaliplatin at a concentration of 20um and the other not. The effect on the viability, cell proliferation, cell cycle, apoptosis and modulation of genes of the cell cycle, apoptosis and oxidative metabolism (SOD1, SOD2, CAT, GPX, Caspase 3, Caspase 8, BAX, BCL-2 and P53colocar the name gene) was also evaluated. Assays were done in triplicate and compared by analysis of variance followed via test post hoc Tukey. Results: pharmacological imbalance AS-HP obtained via exposure of colorectal cancer cells to paraquat and porphyrin changed the standard of viability, cell cycle and in the modulation of gene expression. Both paraquat as nna porphyrin concentration 0.1 uM reduced the viability and proliferation rate of HT-29 cells. However, this effect was more pronounced in cells exposed to paraquat. The action of oxaliplatin was enhanced by the presence of paraquat when analyzed, the mortality rate, apoptosis, cell proliferation rate. Paraquat tamém induced cell cycle interruption phases S and G2 / M Any paraquat as porphyrin were able to modulate differentially markers of oxidative metabolism and expression of genes investigated. However, the results were quite heterogeneous. This heterogeneity may be associated with chromosomal instability in cancer cells that have high levels, and varied mutational. Conclusion: The results confirm the hypothesis that the AS-HP unbalance acts on the biology of colorectal cancer, and in particular increased levels of superoxide, not only increase the mortality rate but also inhibit cell proliferation enhancing so antitumor action of oxaliplatin. These results may be clinically relevant in the construction of pharmaceutical and / or nutritional strategies as the use of vitamins and other dietary supplements which operate in AS-HP sheet and to assist in the successful chemotherapeutic treatment of disease. / Introdução: a superóxido dismutase dependente de manganês (SOD2), é uma importante enzima antioxidante, que dismuta o ânion superóxido produzido na mitocôndria em peróxido de hidrogênio, que por sua vez é catalisado pela glutationa peroxidase (GPX) em água e oxigênio. Apesar de ser crucial para a célula saudável, o papel da SOD2 no câncer é bastante controverso, pois em alguns tipos de neoplasias apresenta uma clara ação antitumoral, enquanto que em outras tem um papel pró tumoral. Investigações prévias envolvendo um polimorfismo no códon 16 do gene da SOD2 no qual ocorre uma troca de uma valina por uma alanina (Val16Ala-SOD2), têm associado maior eficiência da enzima SOD2 com risco elevado de alguns tipos de câncer. Entretanto, em certos tipos de tumores, como o câncer colorretal os resultados são conflitantes. Estudos sugerem que os níveis elevados de SOD2 em células de tumores colorretais estão associados com a progressão do tumor. Possivelmente esta dificuldade em definir o papel da SOD2 na biologia do câncer colorretal esteja vinculado a grande influência de fatores ambientais sobre o sistema gastrointestinal, com destaque a dieta. Por este motivo, o desenvolvimento de um modelo farmacológico de desbalanço para investigar o papel do desbalanço ânion superóxido-peroxido de hidrogênio (Superoxide Anion Hydrogen Peroxide imbalance, AS-HP) no câncer colorretal pode ser considerado relevante. Objetivo: investigar o efeito in vitro do desbalanço farmacológico do AS-HP causado pela exposição ao paraquat e a porfirina na viabilidade e taxa proliferativa da linhagem comercial de células de câncer colorretal (HT-29) e na resposta destas células ao quimioterápico oxaliplatina. O estudo também avaliou o efeito do desbalanço AS-HP na modulação da expressão de genes apoptóticos, do ciclo celular e oxidativos nas células HT-29. Métodos. Células HT-29 obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em meio DMEM, 10% de soro bovino fetal, 1% de antibióticos e antifúngicos em estufa com CO2 a 5% e temperatura de 37oC. Após 24 h da transferência das células para placas de 96 poços na concentração de 10 5 células por poço, estas foram expostas a concentração de 0,1 uM de paraquat, que é uma molécula geradora de superóxido, ou de porfirina, que é uma molécula com efeito similar a enzima SOD2. Parte das células foi tratada com oxaliplatina na concentração de 20uM e outra não. O efeito na viabilidade, proliferação celular, ciclo celular, apoptose, e na modulação dos genes do ciclo celular, apoptose e metabolismo oxidativo (β-actina, SOD1, SOD2, CAT, GPX, Caspase 3, Caspase 8, BAX, BCL-2 e P53) também foram avaliados. Os ensaios foram realizados em triplicatas e comparados por análise de variância de uma via seguido de teste post hoc de Tukey. Resultados: o desbalanço farmacológico AS-HP obtido via exposição das células de câncer colorretal ao paraquat e porfirina alterou o padrão de viabilidade, ciclo celular e na modulação da expressão gênica. Tanto o paraquat quanto a porfirina na concentração 0,1 uM diminuíram a viabilidade e a taxa de proliferação das células HT-29. No entanto, este efeito foi mais pronunciado em células expostas ao paraquat. A ação da oxaliplatina foi potencializada pela presença do paraquat quando foram analisadas a taxa de mortalidade, apoptose, taxa de proliferação celular. O paraquat também induziu interrupção do ciclo celular nas fases S e G2 / M. Tanto o paraquat quanto a porfirina foram capazes de modular diferencialmente marcadores do metabolismo oxidativo e a expressão dos genes investigados. Entretanto, os resultados foram bastante heterogêneos. Esta heterogeneidade pode estar relacionada com a instabilidade cromossômica de células tumorais que apresentam níveis mutacionais altos e variados. Conclusão: os resultados obtidos corroboram a hipótese de que o desbalanço AS-HP age sobre a biologia do câncer colorretal, e que em especial o aumento nos níveis de superóxido, não só aumentam a taxa de mortalidade mas também inibem a proliferação celular, potencializando assim, a ação antitumoral da oxaliplatina. Estes resultados podem ser clinicamente relevantes na construção de estratégias farmacológicas e/ou nutricionais, como um adjuvante ao tratamento o uso de vitaminas ou outros suplementos dietéticos, que atuem no balanço AS-HP e que auxiliem no sucesso do tratamento quimioterápico da doença.

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques. / When atherosclerotic vascular obstructions are so extensive that direct revascularization techniques cannot be undertaken successfully, the severity of residual tissue ischemia will depend in large part on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). The mechanisms involved in neovascularization depend on the oxidative stress balance. Increased oxidative stress is a common feature of all cardiovascular risk factors and particularly aging. In the vascular wall, CuZnSOD is the predominant antioxidant enzyme. Nevertheless, its specific role in vascular aging and new blood vessels formation is currently unknown. Accordingly, we hypotheze that 1) CuZnSOD deficiency reduces neovascularization in response to ischemia 2) this reduction is partly due to vascular aging affecting mature endothelial cells and endothelial progenitor cells. We have demonstrated that CuZnSOD deficiency significantly reduces neovascularization in response to ischemia. This reduction is associated with increased oxidative stress and reduced NO bioavailability. CuZnSOD deficiency significantly decreases EPCs number (bone marrow, spleen). Moreover, these EPCs present significant increased oxidative stress levels, reduced NO production and decreased migration and incorporation into tubular-like structures capacities. Importantly, neovascularization in CuZnSOD deficient-mice can be rescued by an EPCs supplementation from control mice. vii We have also demonstrated that the blood flow recovery following ischemia was significantly reduced with aging. Both in old and young mice, CuZnSOD deficiency led to a further reduction of neovascularization. Interestingly, the resulting neovascularization potential in young CuZnSOD-deficient mouse was similar to that of an older wild type mouse. Oxidative stress levels were also increased to similar levels in these two groups. Both aging and CuZnSOD deficiency were associated with reduced number of bone marrow and peripheral EPCs. The effect of moderate aging alone on specific functional activities of EPCs was modest. However, CuZnSOD deficiency was associated with severe age-dependent defect in EPC fucntional activities. In summary, our resultats suggest that CuZnSOD protection against oxidative stress is essential for EPC functional activities and neovascularization in response to ischemia. The defective neovascularization observed in CuZnSODdeficient mice is associated with accelerated vascular aging. Our results suggest that in aging context, CuZnSOD has a critical role limiting increased oxidative stress and protecting both EPC functional activities and ischemic tissues integrity.

Apesar de vários avanços no combate ao câncer, a incidência do câncer de pele tipo melanoma e a mortalidade relacionada a essa doença tem aumentado. Considerando-se que a radiação ultravioleta (UV) é o principal agente causador de diversos danos à pele, inclusive o câncer de pele, é de grande importância medir de forma adequada as propriedades fotoprotetoras dos filtros solares. Diante dos problemas provocados pelo uso de filtros solares, as pesquisas têm se voltado no sentido de encontrar produtos naturais com propriedades antioxidantes visto que já foi demonstrado que muitos desses agentes naturais possuem efeitos anticarcinogênico, e antimutagênico. Assim, um dos objetivos desse trabalho foi a avaliação de três formulações fotoprotetoras comerciais por meio de parâmetros bioquímicos não comumente utilizados, mas que refletem o efeito dessas formulações no sistema antioxidante natural da pele e também no processo inflamatório induzido pela radiação UV. Esses efeitos foram mensurados in vivo em camundongos sem pelos, utilizando-se como marcadores o antioxidante não enzimático glutationa reduzida (GSH), enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), a enzima mieloperoxidase (MPO) e as citocinas IL-1? e TNF-?. Outro importante objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de um extrato de soja biotransformado (ESB) pelo fungo A. awamori em células de melanoma humano das linhagens 451LU e A375, altamente metastáticas, e estudar os mecanismos de ação pelos quais o extrato induz a morte celular por apoptose nestas células e também avaliar o potencial desse extrato para a prevenção e tratamento do câncer de pele. Os resultados mostraram que com relação ao processo inflamatório induzido pela radiação UVB, verificou-se que o FPS, apesar de avaliar somente o eritema, é um bom indicador do nível de proteção da pele, uma vez que todas as formulações apresentaram um potencial protetor contra o aumento da atividade da MPO e liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1? e TNF-?. No entanto, as formulações não forneceram proteção contra a depleção do antioxidante endógeno GSH e, apesar de possuírem mesmo FPS 15 essas formulações apresentaram diferentes níveis de proteção com relação à redução da atividade da enzima SOD induzida pela radiação UV. Os resultados referentes ao estudo do ESB mostraram que o tratamento das células de melanoma altamente invasivas com o extrato resultou em inibição do crescimento/viabiliade das células associado com a indução de apoptose. As análises revelaram que o ESB resultou em indução da clivagem de PARP e ativação das caspases-3, -7 e -8; aumento da expressão de TNF-R2 e da expressão de TRAIL e do receptor DR4. Além disso, o tratamento das células de melanoma com o extrato ESB aumentou a fosforilação e ativação de IKK, degradação de I?B? e translocação de p65/NF?B para o núcleo. Apesar de ser geralmente aceito que a ativação do NF-?B seja responsável pela resistência à apoptose, neste estudo foi demonstrado que a estimulação da via do NF-?B é necessária pela indução da apoptose mediada pelo extrato ESB. Finalmente, conclui-se que as formulações fotoprotetoras devem ser avaliadas de forma mais profunda, empregando-se diferentes métodos a fim de se garantir formulações mais eficazes tanto contra os danos induzidos tanto pela radiação UVB quanto pela radiação UVA. Além disso, esses estudos identificaram uma atividade anticâncer do extrato ESB que é altamente relevante para a quimioprevenção/quimioterapia contra o câncer de pele tipo melanoma. / Despite several advances in fighting cancer, the incidence of melanoma type skin cancer and the mortality related to this disease have increased. Considering that ultraviolet radiation (UV) is the main causative agent of various skin damages, including skin cancer, it is of great importance to adequately measure the photoprotective properties of sunscreens. Considering the problems caused by the use of sunscreens, researches have been focused towards finding natural products with antioxidant properties as it has been shown that many of these natural agents possess anticarcinogenic and antimutagenic effects. Thus, an objective of this study was to evaluate three marketed photoprotective formulations through biochemical parameters not commonly used, but which reflect the effect of these formulations on the skin\'s natural antioxidant system and also in the inflammatory process induced by UV radiation. These effects were measured in vivo in hairless mice, employing as markers reduced glutathione (GSH), a non-enzymatic antioxidant; superoxide dismutase (SOD), an antioxidant enzyme; myeloperoxidase (MPO) enzyme and IL-1? and TNF-? cytokines. Another important objective of this study was to evaluate the effect of a biotransformed soy extract (BSE) by the A. awamori fungus against 451LU and A375 human melanoma cell strains, highly metastatic, and to study the action mechanisms by which the extract induces cell death by apoptosis in these cells; in addition it was intended to evaluate the potential of this extract for the prevention and treatment of skin cancer. The results demonstrated that regarding the inflammatory process induced by UVB irradiation, it was found that the FPS, although only assessing the erythema, is a good indicator of the level of skin protection, since all formulations showed a protector potential against the increased MPO activity and the release of IL-1? and TNF-? pro-inflammatory cytokines. Nevertheless, the formulations did not provide protection against the depletion of the GSH endogenous antioxidant and, despite having the same nominal SPF (SPF=15), these formulations showed different levels of protection with respect to the reduction of SOD activity induced by UV radiation. The results of the BSE study demonstrated that the treatment of highly invasive melanoma cells with the extract resulted in the cell growth/viability inhibition associated with the induction of apoptosis. The analysis revealed that BSE resulted in induction of PARP cleavage and activation of caspase-3, -7 and -8, increased expression of TNF-R2 and expression of TRAIL and DR4 receptor. Furthermore, the treatment of melanoma cells with BSE extract increased phosphorylation and activation of IKK, degradation of I?B? and translocation of p65/NF?B to the nucleus. Although it is generally accepted that the activation of NF-kB is responsible for resistance to apoptosis, this study demonstrated that the stimulation of NF-?B is required for the induction of apoptosis mediated by BSE extract. Finally, it is concluded that the photoprotective formulations should be more deeply evaluated, using different methods in order to ensure more effective formulations against damages induced both by UVB radiation and UVA radiation. In addition, these studies identified an anticancer activity of the BSE extract that is highly relevant to chemoprevention/chemotherapy against melanoma type skin cancer.

A secreção de insulina é estimulada pela glicose, porém os ácidos graxos (AG) podem influenciar o processo secretório. A oxidação de AG é importante para a estimulação da secreção de insulina por aumentar o ATP, porém, existem vias dependentes e independentes de ATP. Os AG <font face=\"Symbol\">w-3 interferem em processos fisiológicos e na composição e função da membrana plasmática, promovendo potente ação anti-inflamatória. Considerando a importante relação da NAD(P)H oxidase com a secreção de insulina, o estudo das alterações induzidas pela suplementação com AG <font face=\"Symbol\">w-3 sobre o conteúdo de superóxido (O2<font face=\"Symbol\">&#183;) e a expressão da NAD(P)H oxidase, é importante para a compreensão da fisiologia das células <font face=\"Symbol\">b-pancreáticas. Neste estudo, o grupo suplementado apresentou redução do conteúdo de O2<font face=\"Symbol\">&#183;, redução da expressão das subunidades da NAD(P)H oxidase e aumento na expressão da superóxido dismutase (SOD1 e 2), quando comparado ao grupo controle. Embora desconhecido o mecanismo, este dado é relevante, pois pressupõe melhor regulação do estado redox durante a secreção de insulina. / Insulin secretion is stimulated by glucose (GSIS), but fatty acid (FA) may influence the secretory process. The oxidation of FA is important for the stimulation of insulin secretion by increasing the ATP, although there are dependent and independent ATP pathways. The <font face=\"Symbol\">w-3 FA change physiological processes, and affect the composition and function of the plasma membrane, promote potent anti-inflammatory action. Considering the important relationship of NAD(P)H oxidase with insulin secretion, the study of changes induced by supplementation with <font face=\"Symbol\">w-3 FA on the superoxide (O2<font face=\"Symbol\">&#183;) content, and expression of NAD(P)H oxidase, becomes of great importance for understanding the pancreatic <font face=\"Symbol\">b cells physiology. In this study, the group supplemented with <font face=\"Symbol\">w-3 FA showed a reduction of the O2<font face=\"Symbol\">&#183; content, reduced expression of NAD(P)H oxidase subunits, and increased the expression of the enzyme superoxide dismutase (SOD 1 and 2), compared to control. Although unknown the mechanism, this data is relevant, because it represents better regulation of the redox state during GSIS .