Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-12T21:44:56Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EpidemiologiaRiquetsiosesÁrea.PDF: 5058201 bytes, checksum: 49dcb477bb4df804ac26bb580665dbc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T15:59:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EpidemiologiaRiquetsiosesÁrea.PDF: 5058201 bytes, checksum: 49dcb477bb4df804ac26bb580665dbc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T15:59:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EpidemiologiaRiquetsiosesÁrea.PDF: 5058201 bytes, checksum: 49dcb477bb4df804ac26bb580665dbc9 (MD5) Previous issue date: 2007 / A Ordem Rickettsiales abriga um grupo de parasitas intracelulares obrigatórios, responsáveis por várias doenças humanas conhecidas como riquetsioses. Artrópodes hematófagos e seus hospedeiros são responsáveis pela disseminação da doença ao homem. Desde a década de 20, o Brasil apresenta histórico de doença riquetsial, onde a febre maculosa Brasileira destaca-se como a mais comum e a mais letal dessas riquetsioses. Embora os métodos sorológicos ainda sejam os mais indicados na confirmação da doença, o emprego de técnicas de biologia molecular vem modelando uma nova realidade ao diagnosticar e detectar cada vez mais patógenos específicos em todo o mundo. O município de Santa Cruz do Escalvado, localizado no Vale do Piranga, Zona da Mata, Minas Gerais, é considerado foco antigo para riquetsioses. Dentro do município, na localidade de Soberbo foi construída em 2004, a Usina Hidrelétrica de Candonga, alterando assim, a paisagem natural da região. Com o objetivo de compreender a atual situação desse município, dentro de uma concepção de ocupação e transformação do espaço geográfico como nosso marco teórico, buscamos avaliar o nível de transmissão de riquetsioses na população de animais domésticos e silvestres coletados em duas localidades pertencentes ao município, utilizando métodos sorológicos e ferramentas da biologia molecular. Foram capturados 94 vertebrados silvestres dentre eles, os roedores Rattus rattus, Nectomys squamipes e Oryzomys subflavus, além de gambás Didelphis aurita. Dos roedores capturados, foram obtidos tecidos (fígado e baço). Foram coletados 427 ectoparasitos, entre Amblyomma cajennense, Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Boophilus microplus e pulgas da espécie Ctenocephalides canis em animais domésticos (cães e eqüinos). Foram também coletadas 166 amostras de soro dos roedores e dos animais domésticos, sendo estas submetidas à reação de imunofluorescência indireta utilizando antígenos específicos para Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia felis, Rickettsia bellii e Rickettsia amblyommii. Após a extração de DNA das amostras de tecidos de roedores e de pools dos ectoparasitos coletados, foi realizada a amplificação através de PCR duplex, contendo pares de oligonucleotídeos iniciadores gênero-específicos (CS e 17kDa), sendo o produto obtido reamplificado com um par de iniciadores internos de 17 kDa (full nested PCR). Os produtos amplificados foram visualizados em gel de poliacrilamida 8% corado pela prata e as amostras positivas foram purificadas, seqüenciadas e comparadas com outras seqüências depositadas no GenBank. A análise das seqüências obtidas de tecidos de roedores permitiu a identificação do gênero Rickettsia em pools de ectoparasitos das espécies A. cajennense, A. nitens e B. microplus coletados em eqüinos e da espécie R. sanguineus em pulgas coletadas em cães. Os dados sorológicos apontam o R. rattus como o único roedor sororeativo com 81,25% de positividade para riquétsias do Grupo da febre maculosa, comparado aos demais roedores capturados, cujos resultados sorológicos foram negativos. Foi também encontrada uma freqüência sorológica relativamente expressiva entre os gambás capturados apresentando 14,3% para R. rickettsii e 14,3% para riquétsias do Grupo da febre maculosa (GFM). Os eqüídeos apresentaram 5,4% de sororeatividade para R. bellii e 2,7% para riquétsias do GFM, enquanto os cães apresentaram somente 2% para R. rickettsii e 2% para R. parkeri. ___________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Order Rickettsiales evolves a group of obligate intracellular parasites, responsible for many diseases known as rickettsioses. Hematophagous arthropods and their hosts are responsible for the disease dissemination to man. Since the 20’s, Brazil shows a description of the rickettsial disease, where the Brazilian spotted fever appears as the most common and with more high case-fatality ratio rickettsiose. Although serologic methods continues to be most indicated in the disease’s confirmation, the use of molecular biology techniques has been molding a new reality in diagnoses and detect even more specific pathogens in the whole wide world. The city of Santa Cruz do Escalvado, located in the Piranga Valley, Zona da Mata, Minas Gerais, is considered an old focus for rickettsioses. In the city, in Soberbo, was built in 2004 the hydroelectric UHE-Candonga, modifying then, the natural landscape of the place. Trying to comprehend the current situation of this place, considering the occupation and transformation of the geographic space, we have investigated the level of rickettsioses infection in domestic and wild animal’s population of two localities of the city, by using serologic and molecular biology methods. There were captured 94 wild vertebrates among them, the rodent Rattus rattus, Nectomys squamipes and Oryzomys subfalus, and also Didelphis marsupialis opossum. Of the rodents captured, was made a tissue collection (liver and spleen). There were collected 427 ectoparasites among Amblyomma cajennense, Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Boophilus microplus and Ctenocephalides canis fleas in domestic animals (canines and equines). There were also collected 166 samples of serum of rodents and of domestic animals, and those samples were evaluated through indirect immunofluorescence reaction using specific antigen for Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia felis, Rickettisia bellii, and Rickettisia amblyommii. DNA obtained from rodent tissue samples and from pools of collected ectoparasites, was amplified by a PCR duplex system, with oligonucleotides primers pairs (CS and 17kDa genes), and the obtained product was re-amplified with a pair of inner primers for 17 kDa gene (full nested PCR). The amplified product were visualized in polyacrylamide gel 8% silver stained and the positive samples were purified, sequenced, and compared with others sequences in the GenBank. The analysis of the sequences obtained from rodent tissues allowed the identification of Rickettsia ssp sequence, as well as in pools of ectoparasites from A. cajennense, A. nitens and B. microplus species collected in equines and the R. sanguineus and fleas collected in canines. The serologic data points the R. rattus as the only rodent with 81,25% of seroreactivity to spotted fever-group rickettsiae (SFG) when compared to the rest of captured rodents, with negative serologic results. There were also found a relatively expressive serologic frequency among opossums captured with 14,3% to R. rickettsii and 14,3% to spotted fever-group rickettsiae (SFG). The equines showed 5,4% of seroreactivity to R. bellii and 2,7% to spotted fever-group rickettsiae (SFG), while canines showed only 2% to R. rickettsii and 2% to R. parkeri.

Until 2014, scientific knowledge on the diversity of Chilean Ixodoidea summarized 19 species and only agents of Borrelia and Rickettsia genera had been detected. The objectives of this study were to evaluate the occurrence of further agents of Anaplasma, Borrelia, Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia and Hepatozoon by means of molecular tools. Obtained sequences were inserted into a phylogenetic context in order to evaluate their relatedness to microorganisms of know pathogenic roles. As agents of Coxiella genus resulted to be related to endosymbiotic bacteria, data on these organisms was used to perform a taxonomic study with ticks of the Ornithodoors capensis sensu lato complex. The results confirm that Chilean ticks harbor at least three new borrelial, one new rickettsial, and three new Hepatozoon species for science. Moreover, Rickettsia amblyommatis, Rickettsia hoogstraalii and Rickettsia lusitaniae are added to the list of Chilean rickettsiae. Although ticks were positive to Anaplasmataceae PCRs, an accurate study including longer fragments of the 16S RNA targeted gene must be performed in order to confirm their specific identity. Coxiella-like endosymbionts are specific of every of the four O. capensis s. l. species analyzed in this study, and therefore constitute a useful tool in order to confirm the identities and define genetic boundaries of ticks of this group in South America. Finally, the results of this study add at least five new species of Argasidae family into Chilean fauna of ticks, and point the occurrence of several forms that need further assessment in order to accurately confirm their identities. / Até 2014, o conhecimento científico sobre a diversidade de Ixodoidea no Chile estava representado por 19 espécies e apenas agentes infecciosos dos gêneros Borrelia e Rickettsia haviam sido descritos. O objetivo deste estudo foi o de avaliar a ocorrência de outros patógenos transmitidos por carrapatos por meio de técnicas moleculares orientadas para a deteção de Anaplasma, Borrelia, Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia e Hepatozoon. As sequências obtidas foram analisadas filogeneticamente, identificando-se suas posições em comparação à de organismos de papeis patogénicos já conhecidos. Como os agentes do gênero Coxiella apresentaram proximidade filogenética em relação a bactérias congenêricas endosimbiontes, os dados sobre estas foram utilizados para realizar um estudo taxonômico em carrapatos do complexo Ornithodoros capensis sensu lato. Em geral, os resultados confirmam a presença de pelo menos três novas espécies de Borrelia, uma nova Rickettsia, e três novas espécies de Hepatozoon para a ciência. Rickettsia amblyommatis, Rickettsia hoogstraalii e Rickettsia lusitaniae foram inseridas como novos agentes associados a carrapatos no Chile. Embora alguns carrapatos fossem positivos para a presença de bactérias da família Anaplasmataceae, futuros estudos devem ser desenvolvidos para confirmar a sua condição especifica, especialmente através da obtenção de maiores fragmentos do gene codificante para RNA 16S. Os organismos tipo Coxiella são específicos para cada uma das quatro espécies de carrapatos do grupo O. capensis analisados neste estudo. Portanto, constituem uma ferramenta de valor taxonômico para confirmar as identidades e limites genéticos destes. Finalmente, os resultados deste estudo adicionam pelo menos cinco novas espécies de carrapatos para a família Argasidae no Chile e apontam a ocorrência de várias morfotipos de condição incerta que precisam de maiores análises para esclarecer a com certeza a sua posição taxonômica.

Until 2014, scientific knowledge on the diversity of Chilean Ixodoidea summarized 19 species and only agents of Borrelia and Rickettsia genera had been detected. The objectives of this study were to evaluate the occurrence of further agents of Anaplasma, Borrelia, Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia and Hepatozoon by means of molecular tools. Obtained sequences were inserted into a phylogenetic context in order to evaluate their relatedness to microorganisms of know pathogenic roles. As agents of Coxiella genus resulted to be related to endosymbiotic bacteria, data on these organisms was used to perform a taxonomic study with ticks of the Ornithodoors capensis sensu lato complex. The results confirm that Chilean ticks harbor at least three new borrelial, one new rickettsial, and three new Hepatozoon species for science. Moreover, Rickettsia amblyommatis, Rickettsia hoogstraalii and Rickettsia lusitaniae are added to the list of Chilean rickettsiae. Although ticks were positive to Anaplasmataceae PCRs, an accurate study including longer fragments of the 16S RNA targeted gene must be performed in order to confirm their specific identity. Coxiella-like endosymbionts are specific of every of the four O. capensis s. l. species analyzed in this study, and therefore constitute a useful tool in order to confirm the identities and define genetic boundaries of ticks of this group in South America. Finally, the results of this study add at least five new species of Argasidae family into Chilean fauna of ticks, and point the occurrence of several forms that need further assessment in order to accurately confirm their identities. / Até 2014, o conhecimento científico sobre a diversidade de Ixodoidea no Chile estava representado por 19 espécies e apenas agentes infecciosos dos gêneros Borrelia e Rickettsia haviam sido descritos. O objetivo deste estudo foi o de avaliar a ocorrência de outros patógenos transmitidos por carrapatos por meio de técnicas moleculares orientadas para a deteção de Anaplasma, Borrelia, Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia e Hepatozoon. As sequências obtidas foram analisadas filogeneticamente, identificando-se suas posições em comparação à de organismos de papeis patogénicos já conhecidos. Como os agentes do gênero Coxiella apresentaram proximidade filogenética em relação a bactérias congenêricas endosimbiontes, os dados sobre estas foram utilizados para realizar um estudo taxonômico em carrapatos do complexo Ornithodoros capensis sensu lato. Em geral, os resultados confirmam a presença de pelo menos três novas espécies de Borrelia, uma nova Rickettsia, e três novas espécies de Hepatozoon para a ciência. Rickettsia amblyommatis, Rickettsia hoogstraalii e Rickettsia lusitaniae foram inseridas como novos agentes associados a carrapatos no Chile. Embora alguns carrapatos fossem positivos para a presença de bactérias da família Anaplasmataceae, futuros estudos devem ser desenvolvidos para confirmar a sua condição especifica, especialmente através da obtenção de maiores fragmentos do gene codificante para RNA 16S. Os organismos tipo Coxiella são específicos para cada uma das quatro espécies de carrapatos do grupo O. capensis analisados neste estudo. Portanto, constituem uma ferramenta de valor taxonômico para confirmar as identidades e limites genéticos destes. Finalmente, os resultados deste estudo adicionam pelo menos cinco novas espécies de carrapatos para a família Argasidae no Chile e apontam a ocorrência de várias morfotipos de condição incerta que precisam de maiores análises para esclarecer a com certeza a sua posição taxonômica.