Bei der Duchenne Muskeldystrophie (DMD) handelt es sich um eine erblich bedingte, progredient verlaufende Muskelschwäche mit frühzeitigem tödlichem Ausgang. Durch eine Mutation des Dystrophingens kommt es aufgrund fehlender mechanischer Stabilität der Muskelzellen zur Muskelschwäche und dem Ersatz von Muskelgewebe durch Binde- und Fettgewebe. Ein weiteres Kennzeichen der Erkrankung ist ein pathologisch erhöhter Kalziumgehalt der Muskelzellen, der zu gestörten Signalwegen und dem Zelltod führt. Die DMD kommt auch bei Mäusen vor, wobei das Mdx-Mausmodell das bekannteste und am besten erforschte Modell der Erkrankung ist. Die Mäuse besitzen im Gegensatz zum Menschen allerdings ein De- und Regenerationspotenzial der Muskulatur, was die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die menschliche DMD erschwert, da sich die Pathophysiologie der Mäuse abgemildert darstellt. Daher ist es notwendig, das Modell hinsichtlich der Degeneration der Muskulatur zu verbessern, was durch eine unilaterale Injektion von Botox in den rechten M.masseter, die zu dessen Lähmung führt, gewährleistet werden sollte. Das vom Bakterium Clostridium botulinum produzierte Endotoxin Botulinumtoxin A (Botox) wird in der Zahnmedizin unter anderem eingesetzt, um die Masseterhypertrophie zu behandeln. Botox hemmt die Freisetzung von Acetylcholin an der neuromuskulären Endplatte, was zur Hemmung der Muskelkontraktion führt, welche beendet wird, wenn durch das Sprossen neuer Axone eine Reinnervation der Muskulatur stattfindet. Unter dem Einfluss von Botox zu unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich die Expression der kalziumregulierenden Gene der Mdx-Mäuse dahingehend verändern, dass ein verschlechterter Phänotyp bei den dystrophen Mäusen resultiert. Das Mdx-Mausmodell sollte der menschlichen DMD angepasst werden, indem das regenerative Potenzial der dystrophen Mäuse durch die Botox-Injektion und dem damit verbundenen unilateralen Funktionsverlust der Muskulatur unterbrochen wird. Weiterhin stellte sich die Frage, ob durch die Botox-Injektion auch bei den gesunden Mäusen ein Duchenne-ähnlicher Phänotyp auf der behandelten Seite erzeugt werden kann. Dazu wurden in dieser Arbeit die Kaumuskeln M.masseter, M.temporalis und die Zunge von 100 Tage alten Kontroll- und Mdx-Mäusen hinsichtlich ihres Kalziumstoffwechsels 3 bzw. 6 Wochen nach der Botox-Injektion untersucht. Die Genexpression der untersuchten Gene wurde durch quantitative RT-PCR erhoben. Bei der Kontrollgruppe waren 3 Wochen nach der Botox-Injektion im rechten M.masseter alle untersuchten Gene mit Ausnahme von Atp2a1 und Pvalb erhöht. Die erhöhten Expressionen im Vergleich zur linken Seite lagen zwischen dem 1,7-und 15,3fachen. Sechs Wochen nach der Botox-Injektion waren alle Gene im rechten M.masseter mit Ausnahme von Atp2a2 und Sln zwischen dem 1,9- und 4,6fachen erhöht. Bei Sln kam es zu einer Reduktion um 88% verglichen mit der linken Seite. Im M.temporalis der Kontrolltiere konnten 3 Wochen nach der Injektion die Gene Slc8a1 und Sln um das 1,8- bzw. 13,2fache erhöht im Vergleich zur linken Seite nachgewiesen werden. Atp2a1 wurde im rechten M.temporalis um 47% weniger exprimiert als auf der linken Seite. Sechs Wochen nach der Injektion konnten im M.temporalis keine Veränderungen mehr festgestellt werden. Bei den Mdx-Mäusen wurde 3 Wochen nach der Botox-Injektion im rechten M.masseter bei den Genen Atp2a2, Pln und Sln erhöhte Genexpressionen um das Doppelte, 2,2- und 2,8fache im Vergleich zur linken Seite nachgewiesen. Im M.temporalis kam es 3 Wochen nach der Injektion auf der rechten Seite zu einer Erhöhung von Sln um das 8,5fache im Vergleich zur linken Seite. Sechs Wochen nach der Injektion gab es in beiden rechten Muskeln keine Veränderungen mehr. Bei den gesunden Mäusen konnte durch die Botox-Injektion zu keinem der beiden Untersuchungszeitpunkte und in keiner der Muskelproben ein Duchenne-ähnlicher Phänotyp erzeugt werden, auch wenn einzelne Gene eine Verschlechterung des Phänotyps anzeigen, gleichzeitig andere Genveränderungen jedoch auf einen positiven Einfluss auf den Phänotyp schließen lassen. Die Funktion des M.temporalis gleicht außerdem den Funktionsverlust des M.masseter ausreichend aus. Bei den Mdx-Mäusen konnte im rechten M.masseter ebenfalls keine eindeutige Verschlechterung des Phänotyps 3 Wochen nach der Botox-Injektion nachgewiesen werden. Die veränderten Genexpressionen lassen sowohl positiven als auch negativen Einfluss auf den Phänotyp zu, sodass es in der Gesamtbetrachtung nicht zu einer Verschlechterung des Phänotyps kommen muss. Zum späteren Untersuchungszeitpunkt konnten bei den Mdx-Mäusen keinerlei Veränderungen hinsichtlich der Genexpression in den beiden Muskelproben nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die Botox-Wirkung nachgelassen bzw. aufgehört hat und es bereits zu einer Reinnervation im M.masseter kam, die auch durch das Regenerationspotenzial der Mdx-Mäuse erklärt werden kann. Auch in anderen Untersuchungen konnte der vielversprechende Ansatz einer durch Botox induzierten Muskellähmung nicht zu einer Verschlechterung des Phänotyps der Kaumuskeln bei gesunden und Mdx-Mäusen führen.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Muskeldystrophie Duchenne 1.2. Das Dystrophinprotein 1.3. Der Kalziumstoffwechsel 1.4. Tiermodelle 1.4.1. Maus 1.4.2. Hund 1.4.3. Schwein 1.4.4. Ratte 1.5. Botulinumtoxin in der Zahnmedizin 1.6. Ziele der Arbeit 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Geräte 2.1.2. Chemikalien 2.1.3. Kits 2.1.4. Sonden/Primer 2.1.5. Software 2.2. Methoden 2.2.1. Versuchstiere und Probengewinnung 2.2.2. Gelelektrophorese 2.2.3. RNA-Gewinnung 2.2.4. cDNA-Synthese 2.2.5. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) 2.2.6. Quantifizierungsmethoden 2.2.6.1. ΔΔCT-Methode 2.2.7. Statistische Auswertung 3. Ergebnisse 3.1. Gelelektrophorese 3.2. mRNA-Gehalt 3 Wochen nach Botox-Injektion 3.2.1. Expression von Atp2a1 3.2.2. Expression von Atp2a2 3.2.3. Expression von Atp2b4 3.2.4. Expression von Cacna1s 3.2.5. Expression von Pvalb 3.2.6. Expression von Pln 3.2.7. Expression von Ryr1 3.2.8. Expression von Slc8a1 3.2.9. Expression von Sln 3.3. mRNA-Gehalt 6 Wochen nach Botox-Injektion 3.3.1. Expression von Atp2a1 3.3.2. Expression von Atp2a2 3.3.3. Expression von Atp2b4 3.3.4. Expression von Cacna1s 3.3.5. Expression von Pvalb 3.3.6. Expression von Pln 3.3.7. Expression von Ryr1 3.3.8. Expression von Slc8a1 3.3.9. Expression von Sln 3.4. Vergleich der mRNA-Gehalte 3 Wochen und 6 Wochen nach der Botox-Injektion 3.4.1. Atp2a1 3.4.2. Atp2a2 3.4.3. Atp2b4 3.4.4. Cacna1s 3.4.5. Pvalb 3.4.6. Pln 3.4.7. Ryr1 3.4.8. Slc8a1 3.4.9. Sln 4. Diskussion 4.1. Erzeugung eines Duchenne-ähnlichen Phänotyps bei gesunden Mäusen durch Botox-Injektion 4.2. Verschlechterung des Phänotyps bei Mdx-Mäusen 4.3. Unterschiede zwischen den Untersuchungszeitpunkten 4.4. Schlussfolgerungen und kritische Auseinandersetzung mit dem Versuchsaufbau 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literatur 8. Danksagung 9. Anlage 1: Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 10. Anlage 2: Erklärung zur Einhaltung aktueller gesetzlicher Vorgaben

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Die progressiven Muskeldystrophien Duchenne (DMD) und Becker (BMD) entstehen durch verschiedene Mutationstypen (Deletionen, Duplikationen, Punktmutationen) im Dystrophin-Gen, welches als größtes Gen des Menschen 79 Exons aufweist und sich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms befindet. Es wurden Daten von 1365 Personen bezüglich der Häufigkeit der Mutationstypen sowie der Verteilung der einzelnen Mutationen auf die Exons des Dystrophin-Gens ausgewertet. Hieraus konnte ermittelt werden, dass sich bei 780 männlichen Patienten mit gesicherter Diagnose zu 65 Prozent Deletionen, 9 Prozent Duplikationen und 26 Prozent Punktmutationen nachweisen ließen. Desweiteren wurde gezeigt, dass sich bei der Verteilung der Deletionen auf das Dystrophin-Gen zwei hot spot Regionen finden, eine größere im Bereich der Exons 45 - 54 und eine kleinere im Bereich 11 - 20. Die Duplikationen weisen eine Häufung der betroffenen Exons am Anfang des Gens auf, wobei Exon 2 am häufigsten das erste betroffene Exon darstellt. Die Punktmutationen dagegen verteilen sich zufällig über das Gen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass hinsichtlich der Verteilung der gleichen Mutationen auf das Dystrophin-Gen zwischen einer Gruppe von männlichen Patienten und der Gesamtheit aller Probanden einschließlich Konduktorinnen keine Unterschiede bestehen. Dagegen unterschieden sich die verschiedenen Mutationstypen im Vergleich miteinander hinsichtlich ihrer Verteilung auf das Dystrophin-Gen. Bei der Untersuchung der geographischen Verteilung der DMD und BMD konnte lediglich bei den Duplikationen eine Gleichverteilung in Deutschland bestätigt werden. / The progressive muscular dystrophies Duchenne (DMD) and Becker (BMD) originate from different mutation types (deletions, duplications, point mutations) in the dystrophin gene, the biggest human gene, which has 79 exons and is located on the short arm of the X-chromosome. Data of 1365 people were evaluated with regard to the frequency of the mutation types as well as the distribution of mutations over the exons of the dystrophin gene. We found that in 780 male patients with secured diagnosis, there were deletions in 65 percent of the cases, duplications in 9 percent and point mutations in 26 percent. Furthermore it was shown that the distribution of deletions in the dystrophin gene shows two hot spot regions, a larger one in the area of exons 45 - 54 and a smaller one in the area of exons 11 - 20. Duplications showed an accumulation of affected exons at the beginning of the gene, with exon 2 being the first affected exon most often. Point mutations in contrast are distributed over the gene randomly. Moreover it was found out that the distribution of mutations in the dystrophin gene did not differ between a group of male patients and the group of all patients including female carriers, whereas mutation types differed regarding their dissemination over the dystrophin gene. With the analysis of the geographic distribution of DMD and BMD a uniform geographical distribution over Germany could be confirmed merely with duplications.

MSc (Med), Genetic Counselling, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2009 / Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) are severe X-linked recessive, degenerative neuromuscular diseases. DMD/BMD are caused by deletions, duplications and point mutations in the DMD gene situated on the X-chromosome. Studies have shown that the risk of being a carrier for DMD/BMD has a psychosocial impact on individuals and affects their requests for DNA testing and their choices regarding reproduction. Very few articles have been published to date and this study is the first South African study to investigate the behaviours of individuals in DMD/BMD families. The study aimed to investigate why individuals attended genetic counselling and who referred them. It also aimed to identify factors that influence at-risk individuals‟ decisions regarding genetic counselling, carrier testing and reproduction. The study was retrospective and data were obtained by reviewing genetic counselling files at the Division of Human Genetics, National Health Laboratory Service and the University of the Witwatersrand. The sample consisted of 79 files of families seen for genetic counselling regarding DMD/BMD from 1995 to 2008. Subjects included the maternal female relatives of affected individuals, who were all of reproductive age (15-49 years); the total number of at-risk individuals identified was 237. Subjects were divided into three groups according to their assigned reproductive risks: low (0-9%), intermediate (10-24%) and high (>25%). The influence of reproductive risk and other identified variables on decisions to attend genetic counselling, have carrier testing and having children were analysed using chi-squared and logistic regression analysis. iii Reproductive risk and relationship to the affected individuals were shown to be significant predictors of individuals‟ decisions. Other factors that contributed significantly to the behaviour of at-risk individuals were ethnicity, age, whether a mutation was de novo and whether an individual had affected children.

AIMS: To evaluate the use of Manual Muscle Strength Tests (MMST), Timed Functional Tests (TFT) and Respiratory Function Tests (RFT) as measures of muscle strength in young boys with Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and specifically to evaluate the use of Peak Expiratory Flow (PEF). BACKGROUND: There is a need to measure the effect of treatments that potentially increase muscle strength in DMD. PEF may have advantages over Vital Capacity (VC) as a measure of respiratory function in young boys with DMD. METHODS: 17 boys with DMD (aged 5-10 years) were assessed regularly over one year. Assessment involved Respiratory Function Testing (PEF, VC, Forced Expiratory Volume in one second [FEV1]), Timed Functional Testing (walking 9 metres, climbing four stairs, arising from supine) and MMST. A single investigator performed MMST and TFTs. A separate investigator performed RFTs. For RFTs a percentage of predicted was calculated [PEF(%), FEV1(%), VC(%)].11/17 boys were treated with prednisolone which increases strength in DMD. RESULTS: At baseline, all boys had significant weakness. Mean (+/- SD) PEF(%) 69 +/- 13% and VC(%) 77 +/- 18% were abnormal. Baseline PEF(%) predicted correlated with MMST (P=0.003) and time to walk 9 metres (P=0.022). Baseline VC(%) correlated with MMST (P=0.049). There was a consistent statistically significant correlation between MMST and all TFTs. PEF was performed well on 80% of occasions, spirometry on 65%. Changes in PEF(%) showed statistically significant correlation with changes in all TFTs. The correlation was not statistically significant for VC(%) or FEV1(%). Prednisolone treated boys did better than those not treated. PEF, time to walk 9 metres and time to climb 4 stairs showed statistically significant improvement. The mean improvement from baseline in PEF(%) was 19 +/-14% in treated and 2 +/- 7% in untreated boys (P=0.012). CONCLUSIONS: MMST, TFTs and RFTs are valid measures of muscle strength in young boys with DMD. PEF is abnormal in young boys with DMD; correlates with other measures of strength and is sensitive to changes in strength. PEF is more easily performed than spirometry and has a role in monitoring muscle strength in young boys with DMD.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 octobre 2005). Bibliogr.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2002. / "December 2002." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 141-160). Also issued on the Internet.

No description available.

[Abstract]: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a fatal recessive genetic human disease affecting one in 3500 live male births. DMD is progressive, there is no cure, and patients typically die of respiratory or cardiac failure intheir second decade of life. Clinical disease symptoms are exacerbated at the onset of puberty and the physiological basis of this is unknown. The mdx mouse is the preferred experimental animal model of DMD, although aspectsof the model remain poorly understood. This dissertation characterises physiological and histological features of the dystrophic mdx mouse in response to manipulations of hormonal status including testosterone treatment, surgical castration, and oestrogen treatment. Sex-specificdifferences in the mdx were also examined. Furthermore, physiological and histological features of the dystrophic mdx mouse model throughout the mdx lifespan were evaluated. Cardiac muscle contractility, left atrial response to exogenous calcium, and the contractile properties of both fast-twitch (EDL)and slow-twitch (SOL) skeletal muscles were examined in male mdx miceranging from 14 to 330 days of age. Testosterone treatment produced a nonsignificant trend towards a dose-dependent decrease in both basal and maximal left atrial contractility in the mdx. Surgical castration produced nosignificant cardiac effects within mouse strains. The mdx castrates had a 45% lower maximum atrial force of contraction than control castrates (p<0.05). Conversely, oestrogen treatment significantly improved cardiaccontractility in the mdx. An increase in basal left atrial contractility was evident at doses of 0.08 mg/kg/day (p<0.05) and 0.16 mg/kg/day (p<0.01)and in maximum left atrial contractility at a dose of 0.16 mg/kg/day (p<0.01). Gender studies showed cardiac forces in mdx were not different between males and females at any age tested and that both sexes in mdx had adampened cardiac responsiveness to exogenous calcium. Skeletal muscle function studies showed that castration produced a 25% increase in mdx EDL specific force generation (p<0.01) and no increase in SOL forces.Oestrogen treatment produced a non-significant trend towards increased EDL forces and a 29% increase in SOL specific force at a dose of 0.16mg/kg/day (p<0.05). Gender studies revealed no differences between male and female mdx in terms of skeletal muscle force production. Further to the hormonal investigations, lifespan characterisation studies revealed that themdx mouse showed reduced basal and maximal left atrial contractility specifically at ages 14 and 90 days (p<0.05). Skeletal muscle studies showed that specific tetanic force production was significantly lower thancontrols at 19 (p<0.05), 21, 23, 27, and 330 days of age (p<0.01) for EDL muscles and at 19, 21, and 23 days of age in SOL muscles (p<0.01). These studies further improve our understanding of the mdx mouse as an experimental model of DMD and emphasises that the model is most appropriate a specific ages for specific muscles. These studies furtherillustrate that testosterone does not improve cardiac contractility in the mdx mouse but that oestrogen improves both cardiac and skeletal muscle function. Further research is warranted into the potential of oestrogen as atherapeutic agent in the treatment of both cardiac and skeletal musclemanifestations of DMD.

Thesis (M. Sc.)--University of New South Wales, 2003. / Also available online.