As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-β, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mariacarolinaferrerisarkismadrid_dissert.pdf: 2834086 bytes, checksum: 6c83e7649397cb555812544b997d81d3 (MD5) Previous issue date: 2007-12-04 / Yellow fever is an infectious disease caused by the yellow fever virus (YFV), a Flavivirus transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes. Despite the existence of the yellow fever vaccine, the disease is endemic in South America and Africa, causing public health problems such as dispersed outbreaks, epidemics with variable impact and the risk of re-emergency of the urban cycle due to the occurrence of sylvatic disease. Aim. The knowledge of the components of YFV replication complex is still incipient but it is known that there are interactions among viral RNA, viral proteins and host proteins and, due to evidences of the existence of protein-protein interactions related to the NS5 protein of other Flavivirus, the target of our study was YFV NS5 protein. Once protein-protein interactions present basic importance for the activation, the regulation and the control of diverse biologic functions related to these interactions, the identification and the characterization of them are essential for a better comprehension of the pathogenesis and for the rational design of drugs for YFV. Material and Method. The YFV NS5 gene was divided in its two domains, which were independently cloned in a GAL4 DNA-BD plasmid, generating the methyltransferase (MT) and RNA polymerase (RNApol) baits. A two-hybrid system screening in Saccharomyces cerevisiae AH109 strain was performed utilizing RNApol bait and cDNA library of Hela cells, which was cloned in a GAL4 AD plasmid. MT bait showed to be toxic for the yeast. Results. All 204 obtained transformants were tested for activation of reporter genes HIS3, ADE2 and lacZ from AH109 and only 35 samples indicated positivity to, at least, two of the reporter genes assessed. Thirty three distinct cellular protein partners of the RNApol NS5 were identified after the sequencing of the clones and the comparison of its sequences with GenBank. Proteins Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ and MIF were chosen for next experiments. A plasmid linkage with these proteins was performed to exclude the possibility of false-positive clones and to confirm the protein-protein interactions identified in the initial screening. RNApol regions responsible for the Snf5 and eIF3S6IP interactions were mapped and a region of approximately 80 aminoacids was identified as the minimum domain requested for the interactions, called fragment A. Conclusion. The prominence of this YFV fragment as a determinant of protein interactions became more evident when its sequence was compared to the sequences of other Flavivirus, signalizing a homology from aminoacid 20 to 80, demonstrating that this fragment is a conserved region. Moreover, the production of a similarity model of RNA polymerase domain of YFV NS5 protein, using the known DENV NS5 protein structure, showed that the region of interaction is exposed and potentially capable of forming interactions. / A febre amarela é uma doença infecciosa causada pelo vírus da febre amarela (yellow fever virus YFV), um Flavivirus transmitido ao homem pela picada do mosquito Aedes aegypti. Mesmo com a existência de uma vacina anti-amarílica, a enfermidade conserva-se endêmica na América do Sul e na África, gerando problemas de saúde pública que incluem surtos isolados, epidemias de impactos variáveis e, principalmente, o risco da possível re-emergência da sua forma urbana a partir da ocorrência de surtos silvestres. Objetivo. Embora sejam mínimas as informações sobre os componentes do complexo de replicação do YFV, sabe-se que nele estão envolvidas interações entre o RNA viral, proteínas virais e proteínas do hospedeiro e, devido às evidências de interações proteína-proteína relacionadas à proteína NS5 de outros Flavivirus, o alvo principal do nosso trabalho foi NS5 do YFV. Como interações protéicas são de fundamental importância para ativação, regulação e controle de diversas funções biológicas a elas relacionadas fica evidente a relevância da identificação e caracterização das interações participantes desse processo para uma melhor compreensão da patogênese e para o desenho racional de drogas contra a febre amarela. Material e Método. O gene NS5 de YFV foi dividido em seus dois domínios, os quais foram clonados independentemente no plasmídeo com DNA-BD de GAL4, gerando as iscas metiltransferase e RNA polimerase. Em seguida, foi realizado um screening em sistema duplo-híbrido com a isca RNApol contra biblioteca de cDNA de células Hela clonada em vetor com AD de GAL4, uma vez que MT mostrou-se tóxica para a levedura hospedeira do experimento Saccharomyces cerevisiae, linhagem AH109. Resultados. Os 204 transformantes obtidos foram testados quanto à capacidade de ativação dos genes repórteres HIS3, ADE2 e lacZ de AH109 quando, então, apenas 35 amostras mostraram-se positivas para pelo menos dois dos repórteres testados. Após o seqüenciamento nucleotídico desses clones e comparação das seqüências com o GenBank, os resultados indicaram seqüências nucleotídicas codificadoras para 33 proteínas celulares diferentes como parceiras interativas de RNApol NS5, dentre as quais foram eleitas as proteínas Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ e MIF para o prosseguimento dos experimentos. Para excluir a possibilidade de pertencerem a uma classe de clones falso-positivos e confirmar as interações proteína-proteína identificadas na triagem inicial, foi efetuado o plasmid linkage. Após tal confirmação, foram mapeadas as regiões em RNApol responsáveis pelas interações com Snf5 e eIF3S6IP, tendo sido descoberta uma mesma região de aproximadamente 80 resíduos aminoácidos como o domínio mínimo requerido para tais interações, a qual foi denominada fragmento A. Conclusões. A relevância do fragmento A de YFV como determinante das interações protéicas tornou-se mais evidente quando sua seqüência foi comparada à de outros Flavivirus, mostrando a presença de uma homologia principalmente entre os aminoácidos 20 a 80, demonstrando que esse fragmento se comporta como uma região conservada entre os Flavivirus considerados. Além disso, a geração de um modelo de similaridade do domínio RNA polimerase da proteína NS5 de YFV, a partir de NS5 de DENV, demonstrou que a região de interação está exposta ao solvente, sendo, portanto, potencialmente capaz de formar interações.

As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-β, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.