Les sarcoglycanopathies sont des dystrophies musculaires récessives (LGMD2D, E, C, F) causées par des mutations dans les gènes codant les sarcoglycanes (SG) alpha,béta, gamma et delta. Ces protéines transmembranaires font parties d’un complexe interagissant avec la dystrophine, pour protéger les fibres musculaires contre le stress mécanique du à la contraction. La perte de l’expression membranaire d’une des SG peut entrainer l’absence du complexe entier à la membrane. Les mutations trouvées chez des patients sont à 66% des mutations faux-sens ; certaines d’entre-elles peuvent avoir une prévalence importante, comme R77C, la mutation la plus fréquente dans l’alpha-sarcoglycanopathie. Nous avons précédemment démontré que les SGs mutées sont retenues dans le réticulum endoplasmique par le contrôle qualité (ERQC), et qu’il est possible de sauver cette protéine mutée en inhibant l’activité d’une enzyme clé de l’ERQC, l’alpha-mannosidase, par traitement pharmacologique à la Kifunensine. Ce traitement s’est cependant avéré toxique.Ce projet de thèse vise donc à identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour les sarcoglycanopathies. Dans cette optique, nous avons tout d’abord cherché un modèle in vitro nous permettant d’étudier différents mutants d’alpha-SG. Nous avons choisi de générer une lignée cellulaire stable en transduisant les trois SG béta, gamma et delta dans des cellules immortalisées. Cette lignée a ensuite été transfectée avec des mutants d’alpha-SG pour étudier différentes molécules thérapeutiques identifiées dans la littérature. Nos travaux ont permis de démontrer la capacité de 7 molécules à restaurer l’expression membranaire de mutants alpha-SG. Afin de pouvoir valider l’efficacité de ces molécules in vivo, nous avons généré un modèle murin exprimant la mutation béta-T153R. Nos résultats constituent une preuve de principe de l’efficacité de molécules pharmacologiques pour le traitement de patients atteints de sarcoglycanopathies. / Sarcoglycanopathies are recessive muscular dystrophies (LGMD2D, E, C, F) caused by mutations in genes coding for alpha, beta, gamma and delta-sarcoglycans (SG). These transmembrane proteins are part of a complex interacting with dystrophin to protect muscle fibers against mechanical stress due to contraction. Loss of membrane expression of one SG can cause the absence of the entire complex at the membrane. Mutations found in patients are at 66% missense mutations; some of them being highly prevalent like R77C, the most frequent mutation in alpha-sarcoglycanopathy. Interestingly, we previously demonstrated that mutated SGs are retained in the endoplasmic reticulum by the quality control (ERQC), and that it is possible to rescue the mutated protein by inhibiting the activity of a key ERCQ enzyme: alpha-mannosidase I, using Kifunensine as a treatment.The aim of this PhD project is to identify new therapeutic molecules for sarcoglycanopathies. To do so, we first searched an in vitro model to study several alpha-SG mutants. We chose to generate a stable cell line, by transduction of immortalized cells with beta, gamma and delta-SG. This cell line was then transfected with alpha-SG mutants to study different therapeutic molecules identified in literature. Our work demonstrated the ability of 7 molecules to restore the membrane expression of several alpha-SG mutants. To validate the efficacy of those molecules in vivo, we generated a mouse model expressing the beta-T153R mutation. Our results are a proof of principle of the efficacy of pharmacological molecules to treat sarcoglycanopathies.

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires à progression lente. Des mutations du gène de la dysferline causent la LGMD de type 2B, mutations dans le gène de la cavéoline-3 (cav-3) causent LGMD de type 1C et des mutations dans le gène anoctamine-5 (ano-5) sont liées aux LGMD. Dans le but d'analyser les mécanismes moléculaires des LGMD et d'étudier les potentielles interactions de la dysferline, de la cav-3 et de l'ano5, des expériences sur des cellules musculaires primaires portant des mutations associées aux gènes DYSF, CAV3 et ANO5 ont été analysées. Les études d'immunomarquage ont montré que la protéine dysferline et la cav-3 sont partiellement colocalisées dans des structures vésiculaires de la membrane plasmique des myotubes primaires humains. La purification biochimique des "detergent-resistant membranes" issus des myotubes différenciés a montré que la dysferline est associée aux " lipid raft " liées aux cytosquelettes d'actine. L'analyse de la microscopie électronique sur les myotubes issus des muscles des patients atteints de LGMD a montré des altérations dans l'abondance des cavéoles à la membrane plasmique qui est en corrélation avec les mutations causant la maladie. L'analyse de l'ultrastructure cellulaire a montré que la dysferline est localisée à la membrane plasmique mais également dans des vésicules cytosoliques. L'immunopurification de ces vésicules contenant de la dysferline a révélé la présence d'environ 500 protéines détectées par LC-MS, ce qui pourrait représenter des protéines structurales vésiculaires, ainsi que des nouveaux partenaires potentiels d'interaction de la dysferline. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of slowly progressive muscular dystrophies with common features such as hyperCKemia and skeletal muscle weakness. Mutations in the dysferlin gene cause LGMD 2B, in the caveolin-3 (cav-3) gene LGMD 1C and in the anoctamin-5 (ano-5) gene LGMD 2L, respectively. In order to reveal the molecular mechanisms underlying LGMD and to investigate the putative interactions of dysferlin, cav-3, and ano5, primary skeletal muscle cell lines with disease-related mutations in DYSF, CAV3, and ANO5 have been analyzed. Immunolabeling studies revealed that dysferlin and cav-3 are partially colocalized in vesicular structures at the plasma membrane. Biochemical purification of detergent-resistant membranes from differentiated myotubes showed that dysferlin is associated with lipid rafts linked to the actin-cytoskeleton. Transmission electron microscopy analysis of myotubes revealed alterations of caveolae abundance at the plasma membrane correlating with disease-causing mutations. Ultrastructural studies revealed localization of dysferlin at the plasma membrane, but also in cytosolic vesicles. These vesicles contained a subset of approximately 500 proteins detected by LC-MS, which might represent vesicular structural proteins, vesicle cargo, and putative new dysferlin interaction partners. Results from this study lead to the conclusion that caveolae play a crucial role in the context of LGMD. Dysferlin and cav-3 seem to be closely linked on structural as well as on functional level. Our results confirm that dysferlin is localized in cytosolic vesicles, which are involved in multiple cellular processes.