Doctor of Philosophy / Department of Biology / Stephen Keith Chapes / Ehrlichia chaffeensis is an obligate, intracellular bacterium that causes human monocytic ehrlichiosis (HME). The bacteria are vectored by the Lone Star tick (Amblyomma americanum), which is found primarily in the Midwestern and Southeastern United States E. chaffeensis was first reported in 1986 and HME was designated a nationally reportable disease by the United States Centers for Disease Control in 1999. Ehrlichia grows in several mammalian cell lines, but NO consensus model for pathogenesis exists for arthropods or vertebrates. Moreover, the host genes required for intracellular growth of this bacteria are unknown. We first established that the bacteria could infect and replicate both in vitro and in vivo in Drosophila melanogaster S2 cells and adult flies, respectively. We performed microarrays on S2 cells, comparing host gene expression between permissive or non-permissive conditions for E. chaffeensis growth. A total of 210 permissive, exclusive and 83 non-permissive, exclusive genes were up-regulated greater than 1.5-fold above uninfected cells. We screened flies mutant for genes identified in our microarrays for their ability to support Ehrlichia replication. Five mutant stocks were resistant to infection with Ehrlichia (genes CG6479, separation anxiety, CG3044, CG6364, and CG6543). qRT-PCR confirmed that bacterial load was decreased in mutant flies compared to wild-type controls. In particular, gene CG6364 is predicted to have uridine kinase activity. Thus, the in vivo mutation of this gene putatively disrupts the nucleotide salvage pathway, causing a decrease in bacterial replication. To further test the function of gene CG6364 in bacterial replication, we obtained cyclopentenyl cytosine (CPEC) from the National Cancer Institute. CPEC is a cytidine triphosphate (CTP) inhibitor known to deplete CTP pools in various cancers and to exhibit antiviral activity. Consequently, it inhibits de novo nucleotide synthesis, but doesn’t affect the nucleotide salvage pathway. When S2 cells were treated with CPEC and infected with Ehrlichia, an increase in bacterial replication was confirmed by qRT-PCR. Furthermore, addition of cytosine to S2 cells also resulted in increased bacterial replication. Therefore the nucleotide salvage pathway through cytidine appears necessary for bacterial replication. Our approach has successfully identified host genes that contribute to the pathogenicity of E. chaffeensis in Drosophila.

Master of Science / Department of Biology / S. K. Chapes / Ehrlichia chaffeensis is a Gram-negative, obligatorily intracytoplasmic bacterium and the causative agent of a tick-borne disease, human monocytic ehrlichiosis. In vertebrates, E. chaffeensis exhibits tropism for monocytes /macrophages. However, no clear requirements for cell tropism have been defined in ticks. Previously, our group identified two host genes that control E. chaffeensis replication in vivo in Drosophila. We used these two genes, CG6364 and separation anxiety (san) to test the hypothesis that E. chaffeensis replicates in arthropod hemocytes. Using the UAS/GAL4 RNAi system, we generated F1 flies (RNAi flies) and confirmed ubiquitous-or tissue-specific reduction in the transcript levels of the targeted genes. When RNAi flies were screened for Ehrlichia infections, we found that when either CG6364 or san were specifically suppressed in the hemocytes or in the fat body E. chaffeensis failed to replicate or cause infection. Deletion of these genes in the eyes, wings or the salivary glands did not impact fly susceptibility or bacterial replication within these organs. Our data demonstrate that in Drosophila, E. chaffeensis replicates within the hemocytes, the insect homolog of mammalian macrophages, and in the fat body, the liver homolog of mammals. This study provides insights about replication sites of E. chaffeensis in arthropods.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2006. / Available online via OhioLINK's ETD Center; full text release delayed at author's request until 2007 Aug 10

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2010. / Title from PDF title page (viewed on June 28, 2010). Includes bibliographical references (p.179-204).

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6106_DISSERTAÇÃO - MARA RÚBIA.pdf: 928755 bytes, checksum: ecd1f0d756f2f2262aa834ca9d8c7351 (MD5) Previous issue date: 2012-06-26 / Objetivou-se com este estudo determinar por meio da nested-PCR a prevalência da Ehrlichia canis em cães da região de Alegre-ES, e avaliar sua correlação com a presença de mórulas e trombocitopenia. Para isso, foram colhidas amostras sanguíneas de 85 cães, independente de raça, sexo, idade e estado de saúde. Com estas, foram confeccionadas lâminas para a pesquisa de mórulas, trombocitopenia, e execução da técnica de nested-PCR. Foi verificada uma prevalência de 1,17% ao pesquisar a presença de mórulas, 5,6% ao utilizar a técnica da nested-PCR, e foi verificada que 17,64% dos hemogramas apresentavam trombocitopenia. No entanto, somente 40% das amostras positivas pela nested-PCR, apresentaram trombocitopenia. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que a introdução de técnicas de diagnóstico molecular como a nested-PCR é um método importante para o auxílio no diagnóstico precoce de patologias.

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Banca: Marlos Gonçalves Sousa / Banca: Ricardo Duarte Silva / Resumo: A erliquiose em cães pode conduzir o animal ao óbito, tanto por alterações hematológicas quanto clínicas, que se explicam pelo caráter catabólico multifatorial da doença. O comprometimento adrenocortical pode ser esperado em virtude dos desafios impostos ao sistema imune, gerados pelas infecções e inflamações. Este estudo visou avaliar a ocorrência de alterações hormonais relacionadas às glândulas adrenais, em cães infectados naturalmente por Ehrlichia canis (n=21), positivos na identificação de anticorpos anti-E.canis (Dot-ELISA) e DNA da bactéria (nPCR). Para tanto, foram pesquisadas as concentrações séricas de cortisol, sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e proteínas de fase aguda (proteína C reativa e haptoglobina) pré e pósestimulação com o hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), e comparadas com os valores obtidos de cães saudáveis (n=10). Os resultados demonstraram resposta semelhante dos cães doentes e saudáveis ao teste de estimulação com ACTH, no que concerne ao cortisol. Isto sugere que cães com erliquiose de ocorrência natural mantêm a capacidade de secretar cortisol adequadamente diante o estímulo do ACTH. As concentrações de DHEA-S foram significativamente mais elevadas nos cães doentes, nos momentos pré e pós-ACTH, em relação aos saudáveis, o que ilustra o estresse do organismo na doença em estudo. Não foram observadas diferenças significativas entre os momentos dentro de cada grupo. Aparentemente, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração de DHEA-S dosado uma hora após sua administração, sugerindo que a resposta ao estímulo hormonal não foi detectada. Da mesma forma, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração das proteínas de fase aguda, embora se apresentassem significativamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ehrlichiosis in dogs may lead to death both for hematological and for clinical alterations that might be explained for its multifactorial catabolic character. The adrenocortical disruption may be expected during the course of the disease due to challenges on the immune system, generated by infection and inflammation. This study aimed to evaluate the occurrence of hormonal disturbances associated to the adrenal glands in dogs naturally infected by Ehrlichia canis (n=21), positive at the identification of anti-E. canis antibodies and of the bacterial DNA (nPCR). For this purpose, serum concentration of cortisol, dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) and acute phase proteins (C reactive protein and haptoglobin) pre and post-stimulation with adrenocorticotropic hormone (ACTH) were assessed and compared to values obtained from healthy dogs (n=10). The results have shown similar cortisol response to the ACTH stimulation test between sick and healthy dogs. It suggests that dogs with ehrlichiosis of natural occurrence maintain the capacity of secreting cortisol properly before the ACTH stimulation. DHEA-S concentrations were significantly increased in sick dogs at pre and post-ACTH moments, in relation to healthy dogs, which illustrates the organic stress in the studied disease. Significant differences between both moments were not observed in the groups. Apparently, ACTH stimulation has not interfered in DHEA-S concentration, assessed one hour after its administration, suggesting that the response to the hormonal stimulation was not detected. The same way, ACTH stimulation has not interfered in the acute phase concentrations, although they were significantly increased in sick dogs, which reinforces the role of an inflammatory process in the course of the disease. The results indicate... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A shotgun genome sequencing project was undertaken in the expectation that access to the entire protein coding potential of E. Ruminantium (Welgevonden) will facilitate the identification of vaccine candidate genes against heartwater. The 1,516,355 bp sequence is predicted to encode 888 proteins and 41 stable RNA species. The most prominent feature is the large number of tandemly repeated and duplicated sequences, some of continuously variable copy number. These repeats have mediated numerous translocation and inversion events and seem to be responsible for the generation of both new full and partial protein coding sequences. There are 32 predicted pseudogenes, most of which are truncated fragments of genes associated with repeats. Of the 13 members of the order Rickettsiales compared in this study, E. Ruminantium has the lowest coding capacity (62%), lowest GC content (27.5%), but the highest proportion of repetitive sequences, which comprise 8.5% of the genome. Metabolic reconstruction of E. Ruminantium revealed the metabolic and biosynthetic capabilities typical of an obligate intracellular organism. We identified a number of genes unique to E. Ruminantium, most of which are not functionally characterised in any organism, and those shared with 12 other members of the Rickettsiales. Bioinformatic tools were used to identify possible vaccine candidates from the annotated genome sequence. The protective properties of seven open reading frames (ORFs), which induced cellular immune responses in vitro, were tested in vivo Only 20% survival was obtained in sheep immunised with a DNA formulation consisting of three ORFs. We found that the levels of peripheral blood mononuclear cell proliferation and interferon-gamma (IFN-γ) production did not correlate with each other, nor with the levels of protection, suggesting that the current assays are just not reliable and that IFN-γ expression alone is not an indicator of protection. Therefore more cytokines and different assays will have to be investigated to define in detail what constitutes a protective immune response against E. Ruminantium infection. However, the data generated from the genome sequence will continue to facilitate novel approaches to study the organism and to develop an efficacious vaccine against heartwater. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2010. / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de E. canis em cultivo celular, no 27o dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E. canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no HOVET, foi obtido no 14o dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às seqüências dos genes 16S r RNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos &plusmn; 40) de 31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP), respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população 4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações 1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank. Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães no país. / The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital (HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E. canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks, being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14 when dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E. canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies Anti-E. canis (titers &plusmn; 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9% (58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar (P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II, SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E. canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in this country.

Submitted by Rosina Valeria Lanzellotti Mattiussi Teixeira (rosina.teixeira@unisantos.br) on 2015-05-05T11:40:02Z No. of bitstreams: 1 Monica Luzia de Arruda Botelho.pdf: 2799331 bytes, checksum: af7b5537fd607b7e7bccb6a491e79d7c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-05T11:40:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monica Luzia de Arruda Botelho.pdf: 2799331 bytes, checksum: af7b5537fd607b7e7bccb6a491e79d7c (MD5) Previous issue date: 2013-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Between August 2011 and May 2012, 100 samples of ticks were collected from infected environments and domestic or stray dogs in the city of Cubatão, with a total amount of 828 specimens, 827 Rhipicephalus sanguineus and 01 Amblyomma ovale. The parasites were subdivided into three groups: a) collected from dogs taken to the city pound; b) collected from dogs in the city¿s veterinary clinic c) collected from dogs during a zoosanitary visit. In this group, parasites collected in infested homes were included. A convenience sample of 26 ticks was separated according to the address of collection and the investigation of Rickettsia sp, spotted fever Rickettsias and the Ehrlichia sp group in these ticks was conducted by means of Polymerase Chain Reaction (PCR). All samples showed negative for Rickettsia sp. For Ehrlichia sp all samples were negative for the dsb gene and six samples showed positive for the 16S gene (RNA ribosomal). The results demonstrate positivity in these specimens for a bacteria from the Anaplasmataceae family, which was also present in the only specimen of Amblyomma ovale collected. In conclusion, although no positivity was found for Rickettsia sp, the zoonotic risk for erlichiosis should be considered. Besides this, an increase in the sampling submitted to PCR could furnish more information concerning the risk of infection by Rickettsia sp in ticks in the city studied. / Durante o período compreendido entre agosto de 2011 e maio de 2012 foram identificados morfologicamente 828 espécimes de carrapatos, sendo 827 Rhipicephalus sanguineus e 01 Amblyomma ovale. Esse número de parasitos totaliza 100 amostras colhidas em ambientes infestados, bem como na superfície corporal de cães domiciliados e errantes no Município de Cubatão, observando-se os seguintes critérios: a) carrapatos colhidos em cães apreendidos ao canil do Serviço de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Cubatão; b) carrapatos colhidos em cães apresentados à consulta ambulatorial gratuita mantida pelo mesmo serviço; c) animais de propriedade de munícipes solicitantes de orientação técnica quanto à infestação de carrapatos nos domicílios e seus métodos de controle. Neste grupo foram incluídos também os parasitos encontrados no meio ambiente durante as visitas zoossanitárias às residências, com ou sem a presença de cães. Foi separada uma amostra de conveniência composta de 26 carrapatos de acordo com os locais de origem dos animais. A investigação de patógenos (Rickettsia sp, Rickettsias do grupo da febre maculosa e Ehrlichia sp) nos carrapatos foi realizada por meio da técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Todos os carrapatos submetidos à extração de DNA e PCR mostraram-se negativos quanto à infecção por Rickettsias. Para Ehrlichia sp as mesmas amostras mostraram-se negativas para o gene dsb e seis amostras mostraram-se positivas para o gene 16S (RNA ribossomal). Os resultados demonstram que existe positividade nesses espécimes para bactéria da família Anaplasmartaceae, inclusive no único espécime de Amblyomma ovale coletado. Conclui-se que, embora não tenha sido demonstrada positividade para Rickettsia sp na amostra examinada, o risco zoonótico para erliquiose deve ser avaliado. Estudos futuros em amostra mais abrangente poderão trazer mais informações acerca da possível presença de Rickettsia sp nos carrapatos infestantes dos cães domiciliados ou errantes no município.