Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2006. / Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 122- 131). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users.

Universiẗat, Diss., 2004--Heidelberg.

No description available.

The aim of the work presented in this thesis was to establish chromatin immunoprecipitation method in our laboratory as a tool to study target genes of the nuclear receptor NHR-25 in C. elegans. Once the method is established, it will be also useful for studies of other DNA binding proteins. ChIP was performed in transiently transfected cells HEK293 and analyzed using PCR and qPCR. Although ChIP is typically used to find authentic target genes in the cell or in organisms, testing protein-DNA interactions by ChIP in transient transfection system (by transfecting both the expression vector of the protein of interest and a vector containing potential binding sequence/promoter of the protein) can be useful as it serves as a relatively quick tool to confirm the direct binding. Since the detection is by PCR, this method is sensitive yet less costly non radioactive method to analyze protein-DNA interaction. For the first step towards ChIP in C. elegans; pulling down tagged protein directly from the worm was also performed as a preparation for in vivo analysis of NHR-25 regulated genes.

SILVA, Ivanice Bezerra da. Caracterização estrutural de uma lectina nociceptiva obtida de sementes da espécie Platypodium elegans VOG. 2017. 107 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia de Recursos Naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PPGBiotec (ppgbiotec@ufc.br) on 2017-07-06T13:55:40Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T20:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T20:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) Previous issue date: 2017 / A native lectin (nPELa), purified from seeds of the species Platypodium elegans, Dalbergieae tribes, was crystallized and structurally characterized by methodologies such as X-ray diffraction crystallography and bioinformatics tools. The obtained crystals (of orthorhombic type) were diffracted with quality and nPELa structure was solved with excellence through molecular substitution, with resolution of 1.6 Å. The nPELa monomer showed an N-glycosylation site at the Asn119 residue, therefore, confirming the literature prediction. In addition, nPELa has a metal binding site and a conserved carbohydrate recognition domain, in a similar way to what was shown by other Dalbergieae tribe lectins, such as PAL (Pterocarpus angolensis) and CTL (Centrolobium tomentosum). As molecular docking analysis suggests high affinity of this lectin for different mannosides, mainly trimanosides, formed by α-1,3 or α-1,6 glycosidic bond, as evidenced by the obtained scores. In addition, molecular dynamics simulations were performed as a way of demonstrating the structural behavior of nPELa in aqueous solution, as isolated lectin or associated with specific ligands. The results demonstrated a high stability of nPELa in solution, and structural modifications presented at its carbohydrate recognition site allow the interaction between the lectin and the different ligands tested. Different modifications were observed during simulations for each one of the glycans tested, which included different number of hydrogen bonds and hydrophobic interactions, through changes in residues involved. In addition, nPELa was evaluated for its nociceptive activity in rats and was reported as a first lectin of the Dalbergieae tribe which exhibited hypernociceptive activity in a manner dependent on the carbohydrate recognition site. / Uma lectina nativa (nPELa), purificada a partir de sementes da espécie Platypodium elegans, tribo Dalbergieae, foi cristalizada e estruturalmente caracterizada, através de metodologias como a cristalografia por difração de raios X e ferramentas de bioinformática. Os cristais obtidos (do tipo ortorrômbico) foram difratados com qualidade e a estrutura de nPELa foi resolvida com excelência através de substituição molecular, em uma resolução de 1,6 Å. O monômero de nPELa apresentou um sítio de N-glicosilação no resíduo Asn119, assim confirmando a predição da literatura, antes baseada apenas em dados de sequência primária. Além deste, nPELa apresenta um sítio de ligação a metais e um domínio de reconhecimento a carboidratos conservados, semelhantes ao demonstrado para outras lectinas da tribo Dalbergieae, como PAL (Pterocarpus angolensis) e CTL (Centrolobium tomentosum). As análises de docking molecular sugerem a alta afinidade desta lectina por diferentes manosídeos, principalmente trimanosídeos, formados por ligações do tipo α-1,3 ou α-1,6, evidenciado através dos escores obtidos. Além disso, simulações de dinâmica molecular foram realizadas, como forma de demonstrar o comportamento estrutural de nPELa em solução aquosa, sendo a lectina isolada ou associada a ligantes específicos. Os resultados obtidos demonstraram a alta estabilidade de nPELa em solução e as modificações estruturais apresentadas em seu sítio de reconhecimento a carboidratos permitem a interação entre a lectina e os diferentes ligantes testados. Diferentes modificações foram observadas durante as simulações para cada um dos glicanos testados, que incluíram variações no número de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, através de mudanças nos resíduos envolvidos. Além disso, nPELa foi avaliada quanto a sua ação nociceptiva em ratos, sendo relatada como a primeira lectina da tribo Dalbergieae que apresentou atividade hipernociceptiva, de uma maneira dependente do sítio de reconhecimento a carboidratos.

o presente trabalho teve como objetivo realizar o estudo químico das sementes de Trichilia elegans ssp. Elegans A. Juss. (coletadas no município de Corumbá, MS), visando o isolamento e identificação ou elucidação estrutural dos seus metabólitos secundários, particularmente limonóides. Da fase diclorometânica, obtida de uma partição efetuada com o extrato etanólico das sementes, foram isoladas, através de técnicas cromatográficas de separação (cromatografia em colunas de sílica gel, de Sephadex LH 20 e CLAE em fase reversa), dezoito substâncias, compreendendo: dois protolimonóides, onze limonóides com esqueleto do tipo obacunol (abertura dos anéis A e D), quatro com esqueleto do tipo ivorensato de metila (abertura dos anéis A, B e D) e 3β-O-β-D-glicopiranosilsitosterol. Todas as substâncias são inéditas, com exceção do esteróide glicosilado e de dois limonóides com esqueleto do tipo obacunol (kihadaninas A e B). As determinações estruturais foram efetuadas com base em dados espectroscópicos de RMN 1H e 13C, incluindo experimentos bidimensionais (COSY 1H-1H, COSY 1H-13C, HMQC, NOESY e HMBC); a partir de informações obtidas dos espectros de massas e na região do IV e através de dados de difração de raios-X. Quatro dos limonóides obtidos foram submetidos a um ensaio biológico de atividade antitumoral, utilizando-se linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, porém, mostraram-se inativos. / The present work describes the isolation and identification or structural elucidation of the chemical constituents of the seeds of Trichilia elegans ssp. Elegans A. Juss., collected in Corumbá, MS. From the dichloromethane solubles, obtained from partition of the ethanolic extract from the seeds, eighteen substances have been isolated, after a combination of column and flash chromatography on silica gel, gel filtration and reversed phase HPLC separations. The isolated substances have been characterized as two new protolimonoids, nine new obacunol- and four new methyl ivorensate-type limonoids, in addition to two known limonoids belonging to the obacunol group (kihadanins A and B) and 3-O-&#946-D-glucopyranosyl-sitosterol. The structures of these compounds have been established on the basis of 1D (1H, 13C) and 2D (1H-1H and 1H-13C COSY, HMQC, HMBC and NOESY) NMR spectroscopic techniques, IR and mass spectral data and X-ray crystallographic analyses. Four of the isolated limonoids have been tested against DNA reparr deficient mutants of Saccharomyces cerevisiae but, nevertheless, shown to be inactive.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cryptococcus neoformans species Complex comprises the main agents of cryptococcosis, an important systemic mycosis of nature and opportunistic. These species are capable of expressing multiple virulence factors that contribute to the development of resistance to antifungal therapeutic use. Research seeking new effective therapy measures are necessary. Heat shock proteins (Hsp) have been shown to be a promising molecular target for medical treatment of various diseases such as various forms of cancer and atherosclerosis. Studies have demonstrated that the expression of these chaperonins is also required for the maintenance of cellular homeostasis in different fungal pathogens. From this perspective, this study aimed to investigate the effect of blocking the protein Hsp90 front of sensitivity to antifungal agents in vitro planktonic cells and sessile, production of virulence factors in vitro and in vivo virulence in Cryptococcus neoformans species Complex. Therefore, the action of yeast Hsp90 protein was blocked with radicicol drug - an antibiotic capable of inhibiting the ATPase activity of Hsp90 - and then the cultures were evaluated for in vitro susceptibility to antifungal agents for therapeutic use in planktonic cells and associated in biofilms. We also assessed the effect of inactivation of Hsp90 on the production of virulence factors capsule, melanin and proteases. In addition, the in vivo virulence was investigated in a model of experimental infection using the nematode Caenorhabditis elegans. The results revealed that radicicol inhibited the growth of planktonic cells Cryptococcus spp. (n=12) with values of minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 0.5 to 2 &#956;g/mL. We observed synergy between pharmacological and radicicol azoles. Furthermore, blockade of Hsp90 potentiated the effect of in vitro antifungal agents, particularly for the fluconazole and itraconazole, which MIC values were reduced by up to 64 times the face of isolated cells (n=12). Although the blockade of Hsp90 by isolated radicicol was not able to inhibit biofilm formation and biofilm formed of Cryptococcus spp. (n=12) (p>0.05), the inactivation of Hsp90 potentiated the effect of amphotericin B, azoles, especially fluconazole, when tested in combination with radicicol (p<0.05). Moreover, blockade of Hsp90 significantly reduced the volume of capsular Cryptococcus spp. (n=4) (p<0.05). However, no difference was observed in production of melanin by radicicol treated cells (n=4) (p>0.05) as well as the production of protease by strains of Cryptococcus spp. (n=4) (p>0.05). By contrast, inactivation of Hsp90 decreased virulence Cryptococcus spp. in vitro and in vivo in C. elegans (p<0.0001) as well as maximize the effect of fluconazole in vitro and in vivo. Therefore, Hsp90 is an important target for the development of antifungal strategies. However, further studies are needed to better understand the role of Hsp90 in fungal pathogens of the genus Cryptococcus spp. / O Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii compreende os principais agentes da criptococose, uma importante micose de natureza sistÃmica e carÃter oportunista. Essas espÃcies sÃo capazes de expressar mÃltiplos fatores de virulÃncia que contribuem para o surgimento de resistÃncia aos antifÃngicos de uso terapÃutico. Pesquisas que buscam novas medidas eficazes de terapia sÃo necessÃrias. ProteÃnas do choque tÃrmico (Hsp) tÃm se demonstrado um alvo molecular promissor em Ãrea mÃdica para o tratamento de diversas doenÃas, tais como diferentes tipos de cÃncer e aterosclerose. Estudos demonstram que a expressÃo dessas chaperoninas tambÃm à necessÃria para a manutenÃÃo da homeostase celular em diferentes patÃgenos fÃngicos. Nessa perspectiva, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do bloqueio das proteÃnas Hsp90 frente à sensibilidade a antifÃngicos in vitro em cÃlulas planctÃnicas e sÃsseis, produÃÃo de fatores de virulÃncia in vitro e virulÃncia in vivo no Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii. Para tanto, a aÃÃo das proteÃnas Hsp90 fÃngicas foi bloqueada com o fÃrmaco radicicol â um antibiÃtico capaz de inibir a atividade ATPÃsica das Hsp90 â e, em seguida, as culturas foram avaliadas quanto à sensibilidade in vitro a antifÃngicos de uso terapÃutico em cÃlulas planctÃnicas e associadas em biofilmes. TambÃm foi avaliado o efeito da inativaÃÃo das Hsp90 sobre a produÃÃo dos fatores de virulÃncia cÃpsula, melanina e proteases. AlÃm disso, a virulÃncia in vivo foi investigada em modelo de infecÃÃo experimental utilizando o nematÃdeo Caenorhabditis elegans. Os resultados revelaram que o radicicol inibiu o crescimento das cÃlulas planctÃnicas de Cryptococcus spp. (n=12), com valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) que variaram de 0,5 â 2 &#956;g/mL. Observou-se sinergismo farmacolÃgico entre o radicicol e os azÃlicos. Ademais, o bloqueio das Hsp90 potencializou o efeito dos antifÃngicos in vitro, sobretudo para o fluconazol e o itraconazol, os quais tiveram os valores de CIM reduzidos em atà 64 vezes frente Ãs cÃlulas isoladas (n=12). Embora o bloqueio das Hsp90 pelo radicicol isolado nÃo tenha sido capaz de inibir a formaÃÃo de biofilme e biofilme formado de Cryptococcus spp. (n=12) (p>0,05), a inativaÃÃo das Hsp90 potencializou o efeito da anfotericina B e derivados azÃlicos, sobretudo o fluconazol, quando testados em combinaÃÃo com o radicicol (p<0,05). AlÃm disso, o bloqueio das Hsp90 reduziu significativamente o volume capsular de Cryptococcus spp. (n=4) (p<0,05). PorÃm, nÃo observou-se diferenÃa na produÃÃo de melanina por cÃlulas tratadas com o radicicol (n=4) (p>0,05) assim como na produÃÃo de proteases pelas cepas de Cryptococcus spp. (n=4) (p>0,05). Em contrapartida, a inativaÃÃo das Hsp90 diminuiu a virulÃncia de Cryptococcus spp. in vitro e in vivo em C. elegans (p<0,0001) alÃm de potencializar o efeito do fluconazol in vitro e in vivo. Portanto, as Hsp90 sÃo um importante alvo para o desenvolvimento de estratÃgias antifÃngicas. Todavia, estudos mais aprofundados sÃo necessÃrios para melhor compreender o papel das Hsp90 nos patÃgenos fÃngicos do gÃnero Cryptococcus spp.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Considerando o potencial biotecnológico de Cunninghamella elegans em degradar compostos recalcitrantes do meio ambiente, este trabalho teve como finalidade investigar a degradação do dibenzotiofeno por C. elegans associados a estudos morfológicos e ultraestruturais. As amostras tratadas com DBT foram submetidas à cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas GC-MS. Os metabólitos formados, pelo processo de biodegradação do DBT foram 5-óxido dibenzotiofeno, 5,5-dióxido dibenzotiofeno, 2- hidroxibifenil, resultados que sugerem a utilização da via metabólica 4S pelo fungo. Uma segunda via metabólica também é sugerida a via dioxigenação angular, que utiliza o DBT como fonte de carbono, remove o enxofre em forma de sulfito e sulfato e tem como produto final o ácido benzóico. O perfil de crescimento demonstrou que o crescimento de C. elegans foi estimulado pelas concentrações 0,5mM, 1,0mM e 2,0mM de DBT. O total de proteínas extracelulares revelou variações nas condições estudadas. A morfologia de C. elegans apresentou alterações no padrão de ramificação das hifas, variação na forma das ramificações, tornando-se mais curtas, delgadas, bifurcadas, bilaterais ou unilaterais e aparecimento de protuberância na base da ramificação primária em função da concentração do dibenzotiofeno. A análise por microscopia de fluorescência demonstrou variação na distribuição, forma e localização de filamentos de actina. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou que hifas de C. elegans em presença de DBT apresentaram menor eletrondensidade, intensa ramificação e corpos intracelulares em diferentes formas e tamanhos. Com a microscopia eletrônica de transmissão foram observadas modificações relativas à quantidade e tamanho de corpos eletrondensos e vacúolos na hifa, menor quantidade de mitocôndrias, variações na textura e eletrondensidade na parede celular. O estudo citoquímico para catalase revelou variações na intensidade e distribuição de produtos de reação na parede celular e no citoplasma nas amostras tratadas com DBT. O presente estudo confirmou o potencial biotecnológico de C. elegans no processo de biodegradação de DBT

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4550_1.pdf: 1556901 bytes, checksum: 7211d60fc3190af07041b1ecd6e03ea5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / O polifosfato inorgânico (PoliPi) é um homopolímero formado por unidades repetitivas de fosfato, unidas através de ligações fosfoanidrídicas, .descoberto há mais de cem anos. Esta molécula é ubiquitária na natureza, sugerindo o envolvimento do PoliPi em importantes processos metabólicos celulares. Os fungos são organismos de grande interesse prático e científico, por apresentarem grande potencial de aplicação em várias áreas da biotecnologia. Apesar da grande importância do PoliPi a via fisiológica de produção, assim como sua função não estão totalmente esclarecidas, principalmente em seres eucariotos. Neste trabalho foram avaliados os aspectos bioquímicos e fisiológicos da acumulação de PoliPi em dez amostras de Cunninghamella elegans. Os experimentos foram realizados de acordo com um planejamento fatorial de dois níveis (22) sem ponto central. Os resultados obtidos demonstraram que a concentração de glicose no meio de cultura e a temperatura de cultivo influenciam significativamente o processo de acumulação de PoliPi. O planejamento fatorial permitiu a modelagem matemática do acúmulo de PoliPi para cada amostra testada. C. elegans UCP 542 apresentou o maior rendimento na acumulação de PoliPi, correspondendo a 5.77 &#956;g de Pi/mg. Observou-se que o PoliPi é acumulado durante todas as fases de crescimento de C. elegans, sendo a fração álcali-solúvel produzida em maior quantidade. A atividade das fosfatases ácida e alcalina foi detectada em todas as amostras, contudo não observou-se uma correlação com o processo de acumulação de PoliPi. Todas as amostras de C. elegans testadas demonstraram habilidade em acumular PoliPi, destacando-se C. elegans 542, que demonstrou grande potencial de utilização em processos biotecnológicos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4414_1.pdf: 421863 bytes, checksum: 1dc983d91fb57f58244502a9a24c4406 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O perfil de crescimento e o consumo de fosfato e glicose, bem como o conteúdo de fósforo, a distribuição, estrutura e localização de polifosfato foram avaliados em Cunninghamella elegans cultivada em meios contendo diferentes concentrações de fosfato. Os resultados permitiram evidenciar a influência dessas concentrações sobre a produção de biomassa e o metabolismo do polifosfato no organismo estudado. A maior concentração de fosfato no meio de cultivo proporcionou maior rendimento da biomassa ao longo do crescimento. Observou-se uma relação entre consumo de fosfato e glicose com o crescimento e a quantidade de polifosfato total nos micélios cultivados em diferentes concentrações de fosfato. Diferentes frações do polifosfato celular de C. elegans foram identificadas e quantificadas através de extrações seqüenciais. A citoquímica ultrastrutural foi utilizada, com sucesso, para identificar a localização e a distribuição de polifosfato em C. elegans. Os resultados revelaram diferenças no padrão de marcação citoquímica nas diferentes fases do crescimento e meios de cultivo. Uma marcação uniforme do polifosfato foi observada sobre a superfície celular, em especial, na parede celular e na membrana citoplasmática. Produtos de reação, resultantes da marcação citoquímica, foram também visualizados em estruturas trabeculares, vacuolares e vesiculares, sob a forma de corpos eletrondensos e grânulos dispersos no citoplasma. Os resultados demonstraram o potencial de C. elegans na acumulação de polifosfato, sugerindo uma possível aplicação em processos biotecnológicos