L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est un processus fondamental des cellules eucaryotes. Elle se caractérise par la formation d’invaginations à la membrane plasmique aboutissant à la création de petites vésicules par l’action de la dynamine. Dans le cerveau, elle est impliquée dans la dépression synaptique à long terme, un corrélat cellulaire de la mémoire. La morphologie complexe des neurones et le contrôle précis du code neuronal suggèrent qu’elle puisse être régulée spatialement et temporellement dans ces cellules. Le but de mon travail a été de développer de nouveaux outils pour visualiser et perturber l’EDC afin d’étudier ce type de régulation. Le premier de ces outils est pHuji, un senseur de pH rouge génétiquement encodable. Je l’ai utilisé avec un senseur de pH vert existant pour montrer que dans les cellules NIH- 3T3, le récepteur β2-adrénergique est internalisé dans une sous-population de vésicules contenant le récepteur à la transferrine constitutivement endocyté. Le deuxième est une nouvelle méthode d’imagerie permettant de visualiser l’activité d’endocytose de structures recouvertes de clathrine optiquement stables dans des neurones d’hippocampe. J’ai ainsi pu suivre pour la première fois la cinétique d’internalisation de récepteurs au glutamate de type AMPA dans des conditions de plasticité. Enfin, j'ai élaboré un test combinant imagerie et patch-clamp afin de développer un bloqueur peptidique spécifique de l'EDC. En utilisant des peptides dimériques, j’ai montré que la dynamine se lie à ses partenaires via des interactions multimériques. En conclusion, ce travail propose une boite à outils permettant d’élucider les mécanismes de l’EDC avec une grande résolution spatiale et temporelle. / Clathrin mediated endocytosis (CME) is a fundamental process of all eukaryotic cells. At the level of the plasma membrane, it is characterized by the formation of deep invaginations resulting in the creation of small vesicles after membrane scission by dynamin. In the central nervous system, it is involved in the expression of synaptic long term depression, a proposed cellular correlate of learning and memory. The complex morphology of neurons and the precise timing of neuronal firing suggest that endocytosis may be spatially and temporally regulated in those cells. The aim of the work presented here was to develop new tools to visualize and perturb CME in order to study such regulation. The first tool to be characterized was pHuji, a genetically encoded red pH-sensor. I used it in combination with an existing green pHsensor to demonstrate that in NIH-3T3 cells, the β2-adrenergic receptor was internalized in a subset of vesicles containing the constitutively endocytosed transferrin receptor. The second tool is a new imaging method that allowed me to monitor the endocytic activity of optically stable clathrin coated structures in hippocampal neurons. I was thus able to visualize for the first time the kinetics of internalization of AMPA-type glutamate receptors under plasticity inducing conditions. Finally, I set up an assay combining imaging and cell dialysis in order to develop a specific peptide-based inhibitor of CME. Using dimeric peptides, I found that the interplay between dynamin and its binding partners relies on multimeric interactions. Altogether, this work provides a toolbox to decipher the mechanisms of vesicle formation with high spatial and temporal resolution.

Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection / Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection