Avances en ingeniería de tejidos y en terapias celulares requerirán el desarrollo de un nuevo abanico de tecnologías. Estas incluirán sistemas de cultivo de líneas primarias en tres dimensiones (3D) con el fin de construir tejidos artificiales, sistemas de transducción eficientes y sistemas de regulación genética compatibles en humanos para ajustar intervenciones moleculares. Todo ello permitirá reprogramar las células animales con el objetivo de obtener fenotipos deseados y de optimizar la productividad celular.El objetivo de esta tesis es (i) estudiar y manipular las propiedades (electro) fisiológicas de los tejidos artificiales de miocardio mediante la regulación de BMP-2 para controlar y regenerar la funcionalidad cardiaca, (ii) estudiar, inducir y caracterizar los procesos de diferenciación y transdiferenciación de microtejidos adiposos y oseos mediante la sobre expresión de los genes BMP-2 y ΔFosB para tratar enfermedades relacionadas con el tejido oseo como la osteoporosis, y (iii) evaluar la productividad de los microtejidos artificiales para optimizar los procesos de producción con células animales. Por último, el objetivo es también automatizar la producción de microtejidos artificials para satisfacer las necesidades de la industria.Microtejidos libres de scaffold no solo presentan una alternativa a la ingeniería de tejidos para terapias celulares y regeneración de tejidos, sino también tienen un gran potencial en estudios celulares para aplicaciones en la industria bio-farmacéutica. Mientras en el área de investigación, los microtejidos artificiales presentan un modelo para el estudio de nuevos genes y proteínas implicadas en diferentes procesos celulares (diferenciación, proliferación, apoptosis, síntesis de proteínas, etc.), en el area de desarrollo, los microtejidos artificiales representan una herramienta para el análisis de dichos genes y proteínas por su acción terapéutica. Finalmente, una vez la proteína terapéutica ha sido identificada, los microtejidos artificiales podrían proveer un ambiente más beneficioso para la producción de proteínas terapéuticas. / Advances in tissue engineering and cell-based therapies will require the development of a range of specific technologies. These include systems for the cultivation of primary cells in three dimensions (3D) to form artificial tissues, efficient gene transduction technologies, and human-compatible gene regulation systems for adjustable molecular interventions all of which should enable the rational reprogramming of mammalian cells to achieve desired cell phenotypes, functionality, and to optimize cellular productivity. The aim of this thesis is to (i) study and modulate the (electro) physiological properties of artificial myocardial microtissues by BMP-2 regulation to control and to regenerate cardiac functionality, (ii) study, induce and characterize differentiation and transdifferentiation processes of adipose- and bone-microtissues by overexpression of BMP-2 and ΔFosB genes in order to treat bone-related diseases such as osteoporosis, and (iii) evaluate artificial microtissue productivity to optimize mammalian production processes. Finally, the purpose is also to automate artificial microtissue production in order to satisfy requirements for industrial scale applications.Scaffold-free artificial microtissues represent an alternative to existing tissue engineering strategies for cell-based therapies and tissue regeneration, as well as for cell-based biopharmaceutical applications. Within a research context, artificial microtissues could be used as a cell culture model to study/screen novel molecules/genes/proteins that are involved in different cellular processes (e.g. differentiation, proliferation, apoptosis, protein synthesis and secretion), while in a development context, artificial microtissues could be used as a tool to evaluate such target molecules/genes/proteins for their therapeutic action. Finally, once a therapeutic molecule/protein is identified, artificial microtissues may provide a more suitable or optimized environment for therapeutic protein production.

La biomimètica o biomimetisme són termes que simbolitzen el concepte “aprendre de la naturalesa”, és a dir, aprendre dels seus sistemes, processos i models, a fi d’utilitzar la natura com a font d’inspiració per solucionar problemes de l’home. El biomimetisme és actualment un concepte recurrent en l’àrea d’enginyeria de teixits i d’ell en sorgeixen idees per obtenir plataformes més elegants i sofisticades que puguin imitar millor les interacciones entre les cèl•lules i el seu ambient. Aquesta tesi pretén desenvolupar models, en dues i en tres dimensions, mitjançant la recreació d’un o més factors característics de l’ambient natural de la cèl•lula i que juguen un paper important en el comportament cel•lular. Se sap que tant les propietats químiques com les mecàniques de la matriu extracel•lular influeixen sobre les funcions cel•lulars. És per això que es va dissenyar un nou film polimèric que pogués combinar un hidrogel, amb propietats mecàniques variables, amb un monòmer reactiu capaç d’immobilitzar biomolècules. Degut a la complexitat del polímer dissenyat, va ser necessari recórrer a una tècnica de polimerització superficial molt versàtil com és la deposició química iniciada en fase vapor (més coneguda pel seu acrònim en anglès iCVD). Els polímers varen ser àmpliament caracteritzats i es va corroborar que podien ser modificats amb petites biomolècules com ara pèptids senyalitzadors. Les superfícies resultants són bioactives i permeten l’adhesió de cèl•lules endotelials. Unes altres superfícies biomimètiques, rellevants en l’àmbit de l’enginyeria de teixits d’os, es varen obtenir a partir d’una hidroxiapatita sintetitzada pel mètode de sol-gel submergint-la en diferents medis fisiològics. La dissolució i posterior reprecipitació dels ions proporcionen una capa d’apatita amb una composició similar a la que es troba in vivo. Els experiments evidencien la importància de partir d’un material relativament soluble. És per això que la hidroxiapatita pura no és capaç d’induir la precipitació d’aquesta apatita biomimètica in vitro. Diversos investigadors han relacionat la capacitat de formar apatita amb la bioactivitat del material, entenent bioactivitat com l’habilitat d’aquests materials de promoure la unió amb l’os. Per a l’enginyeria de teixits, però, és necessari un ambient tridimensional per tal de generar un teixit artificial. S’ha desenvolupat un nou model basat en l’ús d’un gel molt tou per tal d’obtenir un teixit dur com el de l’os. Malgrat que aquests dos conceptes poden semblar contradictoris, les cèl•lules adquireixen l’habilitat d’allargar-se ràpidament i crear una densa xarxa cel•lular dins d’aquest ambient poc restrictiu des d’un punt de vista mecànic. La consegüent contracció del sistema acaba formant un constructe més petit i resistent. Aquest és un sistema biomimètic ja que promou una gran interacció cel•lular i també la condensació de les cèl•lules, esdeveniments que tenen lloc també durant el desenvolupament de l’os i el cartílag. El model es va caracteritzar extensament amb cèl•lules ostoprogenitores MC3T3-E1 que es diferenciaren amb inducció química. A més a més, es va demostrar que l’ambient tridimensional podia promoure l’expressió espontània de marcadors osteogènics. Degut a les interessants propietats del sistema, el mateix model es va utilitzar per induir la diferenciació condrogènica de fibroblastos dermals humans. Aquests tipus cel•lular no ha estat gaire explorat en l’àmbit de l’enginyeria de teixits, malgrat que ofereix un gran potencial en teràpia regenerativa. Aquest treball proporciona proves de la capacitat condrogènica d’aquestes cèl•lules en el sistema tridimensional prèviament desenvolupat. / La biomimètica o biomimetismo son términos que simbolizan el concepto “aprender de la naturaleza”, es decir, aprender de sus sistemas, procesos y modelos, y utilizarlos como fuente de inspiración para solucionar problemas del hombre. El biomimetismo es actualmente un concepto recurrente en el área de ingeniería de tejidos y de este surgen ideas para obtener plataformas más elegantes y sofisticadas que puedan mimetizar mejor las interacciones entre las células y su ambiente. La presente tesis se centra en desarrollar modelos, tanto en dos como en tres dimensiones, mediante la recreación de uno o más factores que caracterizan el ambiente natural de la célula y que tienen su rol importante en el comportamiento celular. Se conoce que tanto las propiedades químicas como mecánicas de la matriz extracelular influyen en las funciones celulares. Debido a esto, se diseñó un nuevo film polimérico que pudiera combinar un hidrogel, con propiedades mecánicas variables, con un monómero reactivo, capaz de inmovilizar biomoléculas. Debido a la complejidad del polímero diseñado, fue necesario recurrir a una técnica de polimerización superficial muy versátil como es la deposición química iniciada en fase vapor (más conocida por su acrónimo en inglés iCVD). Los polímeros fueron ampliamente caracterizados y se corroboró que podían ser modificados con pequeñas biomoléculas como péptidos señalizadores. Las superficies resultantes son bioactivas y permiten la adhesión de células endoteliales. Se obtuvieron otro tipo de superficies biomiméticas relevantes en el ámbito de la ingeniería de tejidos de hueso, a partir de una hidroxiapatita sintetizada por el método sol-gel sumergiéndolas en diferentes medios fisiológicos. La disolución y posterior reprecipitación de los iones proporcionan una capa de apatita con una composición similar a la que se encuentra in vivo. Los experimentos evidencian la importancia de partir de un material relativamente soluble. Precisamente debido a esto la hidroxiapatita pura no es capaz de inducir la precipitación de esta apatita biomimética in vitro. Varios investigadores han relacionado la capacidad de formar apatita con la bioactividad del material, entendiendo bioactividad como la habilidad de estos materiales de promover la unión con el hueso. De todos modos, en ingeniería de tejidos, es necesario un ambiente tridimensional para generar un tejido artificial. Se ha desarrollado un nuevo modelo basado en el uso de un gel blando para obtener tejido duro como el del hueso. Aunque estos conceptos pueden parecer contradictorios, las células adquieren la habilidad de estirarse rápidamente y de formar una densa red celular dentro de este gel tan poco restrictivo desde un punto de vista mecánico. La consiguiente contracción del sistema acaba formando un constructo mucho más pequeño y resistente. Este es un sistema biomimético ya que promueve una gran interacción celular y también la condensación de las células, eventos que también ocurren durante el desarrollo de hueso y cartílago. El modelo se caracterizó extensamente con células osteoprogenitoras MC3T3-E1 que se diferenciaron bajo inducción química. Además, se demostró que el microambiente tridimensional podía promover la expresión espontánea de marcadores osteogénicos. Debido a las interesantes propiedades del sistema, el mismo modelo se usó para inducir la diferenciación condrogénica de fibroblastos dermales humanos. Este tipo celular no ha sido demasiado explorado en ingeniería de tejidos, a pesar de que puede tener un gran potencial en terapia regenerativa. Este trabajo proporciona pruebas de la capacidad condrogénica de estas células en el sistema tridimensional previamente desarrollado. / Biomimetics or biomimicry are terms that imply “learning from nature”, from its systems, processes and models, in order to use nature as inspiration to solve human problems. In tissue engineering, biomimetics is nowadays a recurrent term and a source of ideas to obtain more elegant and sophisticated platforms that could better mimic the interactions between cells and their environment. This thesis is focused on developing models both in two- and three-dimensions by recreation of one or more factors of the cell natural environment that are known to play an important role in cell behavior. Since both the chemical and mechanical properties of the extracellular matrix are known to effectively influence cell function, an innovative polymeric thin film was designed combining a hydrogel with tunable mechanical properties and a reactive molecule, capable to immobilize biomolecules. Due to the complexity of the polymers, a versatile technique such as initiated chemical vapor deposition (iCVD) was required for the synthesis. Extensive characterization revealed that nanostructured hydrogels were obtained and that small biomolecules, such as signaling peptides, could be attached on the surface. The final surfaces are bioactive and support endothelial cell attachment. Relevant biomimetic surfaces for bone tissue engineering could also be obtained from a sol-gel synthesized hydroxyapatite after immersion in different physiological media. The dissolution and posterior reprecipitation of the ions rendered a final apatite layer with a composition similar to that found in vivo. The experiments evidenced the importance of starting from a rather soluble material and, thus, pure hydroxyapatite was not able to promote apatite precipitation in vitro. This capacity has been related to the material bioactivity by many researchers in terms of its ability to bond to bone in tissue engineering applications. However, for tissue engineering a three-dimensional environment is required to build tissue-like constructs. A new model was developed based on the use of a very soft gel to obtain hard tissue. Although the concepts might seem to work in opposite directions, cells gain the ability to rapidly elongate and form a dense cellular network within this unrestrictive environment. Subsequent contraction of the whole system rendered a smaller and stronger final tissue-like construct. This system was considered biomimetic as it promotes high cell-cell interaction and cellular condensation, which are events that occur in bone and cartilage development. This system was extensively characterized with osteoprogenitor MC3T3-E1 cells that could undergo full osteogenic differentiation under chemical induction. More interestingly, the three-dimensional microenvironment was also able to promote by itself spontaneous expression of bone-related markers. Due to the interesting properties of this system, the same model was used to induce chondrogenic differentiation of human dermal fibroblasts. This cell type has been poorly explored for tissue engineering applications, but it might have great potential in future therapeutic platforms. This work provides proof of concept of chondrogenic potential of these cells in this three-dimensional system.

[EN] Nowadays, one of the biggest concerns that permanently keep the attention of main important sectors of human society is health. Modern medical science is compromised with not only providing good adequate treatments but also effective specific solutions for each type of disease or human pathology. In this direction, innovative approaches like tissue engineering or regenerative medicine, controlled drug delivery systems and nanomedicines emerge to bring alternatives to situations hard to solve with conventional treatment and strategies, including the replacement of damaged or diseases tissues and/or organs. Specifically, this research is mainly aimed to design a combined system for controlled, stable and localized release of therapeutic agents that are able to exert their effect selectively on the area that warrants treatment. This construct will have enough versatility to be adapted to almost any kind of treatment, from cancer to tissue regeneration, always that the key requirement of the treatment was the need to provide the treatment of localized, stable and controlled manner. With the purposes of making easier the understanding as well as the design of the system, I was decided, for the proof of concept, to use drugs and materials with known activity applied on tissue regeneration and for the treatment of chronic wounds. The system in question consists of three main elements: 1) The first element is the polymer conjugates of therapeutic agents, which contribute to increasing the selectivity of the therapeutic action of the drug, as well as improved stability, bioavailability and biocompatibility thereof. If the drug is hydrophobic, conjugation contributes to increase its solubility in water, and in the case of proteins used as therapeutic agents, the combination helps reduce the body's immune response, increasing the chance of successful of the treatment. 2) The second element are the biodegradable polymeric microparticles, which in this case act like encapsulation agents for polymeric conjugate , thus allowing to have a second control point in the release kinetics of the therapeutic agents . Simultaneously, the microparticles also play a role in modifying the texture of the final construct, ascribing mechanical and physicochemical properties that help to improve some biological properties of the final material, such as the affinity, adhesion and cell proliferation. 3) The third element consists of a nanoporous membrane made of a biodegradable polymer by electrospinning, which constitute the unifier element of the whole system. This membrane provides manageability to the construct and is itself the last point of control in the release kinetics of the therapeutic agent or agents. Besides, it must be biocompatible and stable at ambient conditions, since this probably is going to be exposed to the environment while protecting the wound, in the case of this kind of application. These three elements, which themselves are complex systems separately, are systematically combined to achieve a synergistic relationship between them so that each one power the qualities of the other two. The resulting construct was characterized and it demonstrated to have characteristic properties that can be used as a control parameter during manufacture of this new material. Also, preliminary biological studies developed "in vitro" indicated that the proposed system may be a good candidate for deeper studies as alternative treatment for chronic wounds and other pathologies that require localized administration for long periods of time. / [ES] Actualmente, una de las mayores preocupaciones que permanentemente laman la atención de los principales sectores de la sociedad humana es la salud. La ciencia médica moderna está comprometida no solo con suministrar tratamientos adecuados, sino más bien ofrecer soluciones efectivas y específicas para cada tipo de enfermedad o patología humana. En este sentido, estrategias innovadoras como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, los sistemas de liberación controlada de fármacos y las nanomedicinas, surgen como buenas alternativas para abordar situaciones difíciles de resolver aplicando los tratamientos y estrategias terapéuticas convencionales, como es el caso cuando se hace necesario reemplazar tejidos o incluso órganos dañados por algún traumatismo o enfermedad. Concretamente, el presente trabajo de investigación tiene por objetivo principal diseñar un sistema combinado para la liberación controlada, estable y localizada de agentes terapéuticos que sean capaces de ejercer su efecto de forma selectiva sobre la zona que amerita el tratamiento. Este constructo tendrá la versatilidad suficiente como para poder adaptarse a casi cualquier tipo de tratamiento, desde el cáncer hasta la regeneración de tejido, siempre que el requisito clave del tratamiento sea la necesidad de suministrar el tratamiento de manera localizada, estable y controlada. Para efectos de facilitar la compresión y el diseño del sistema se escogió para la prueba de concepto materiales y fármacos asociados a la regeneración de tejidos, como tratamiento para casos de heridas crónicas. El sistema en cuestión está constituido por tres elementos principales: 1) El primer elemento son los conjugados poliméricos de agentes terapéuticos que contribuirán a aumentar la selectividad de la acción terapéutica del fármaco, así como también a mejora la estabilidad, biodisponibilidad y biocompatibilidad de los mismos. En caso de que el fármaco sea hidrofóbico, la conjugación contribuye a aumentar su solubilidad en agua, y en el caso de usar proteínas como agentes terapéuticos, la conjugación contribuye a disminuir la respuesta inmunológica del cuerpo incrementando las posibilidad de éxito del tratamiento. 2) El segundo elemento son micropartículas poliméricas biodegradables, que en este caso actúan con agentes de encapsulación para los conjugados poliméricos, permitiendo así contar con un segundo punto de control en la cinética de liberación de los agentes terapéuticos. Simultáneamente, las micropartículas también cumplen un papel de modificador de la textura del constructo final, adjudicándole propiedades mecánica y fisicoquímicas que contribuyen a mejorar las propiedades biológicas del material final, como son la afinidad, la adhesión y la proliferación celular. 3) El tercer elemento consiste en una membrana polimérica biodegradable nanoporosa hecha por electrospinning, que constituyen el elemento unificados del sistema, aporta manejabilidad al constructo y es en sí mismo el último punto de control en la cinética de liberación del agente terapéutico. Este último debe ser biocompatible y estable en condiciones ambientales, puesto que probablemente este expuesto al ambiente mientras protege la herida, en el caso concreto de este tipo de aplicación. Estos tres elementos, que en sí mismos constituyen sistemas complejos por separado, se han combinado sistemáticamente para alcanzar una relación sinérgica entre ellos de manera que cada uno potencia las cualidades de los otros dos. El constructo resultante se caracterizó demostrando tener propiedades características que se pueden utilizar como parámetro de control durante la fabricación del mismo. Así mismo estudios in vitro del sistema desarrollado señalan que puede ser un buen candidato para el tratamiento de heridas crónicas entre otras patologías que requieran tratamientos localizados. / [CA] Actualment, una de les majors preocupacions que permanentment llepen l'atenció dels principals sectors de la societat humana és la salut. La ciència mèdica moderna està compromesa no solament amb subministrar tractaments adequats, sinó més aviat oferir solucions efectives i específiques per a cada tipus de malaltia o patologia humana. En aquest sentit, estratègies innovadores com l'enginyeria de teixits o la medicina regenerativa, els sistemes d'alliberament controlat de fàrmacs i les nanomedicines, sorgeixen com a bones alternatives per a abordar situacions difícils de resoldre aplicant els tractaments i estratègies terapèutiques convencionals, com és el cas quan es fa necessari reemplaçar teixits o fins i tot òrgans danyats per algun traumatisme o malaltia. Concretament, el present treball de recerca té per objectiu principal dissenyar un sistema combinat per a l'alliberament controlat, estable i localitzada d'agents terapèutics que seguen capaços d'exercir el seu efecte de forma selectiva sobre la zona que amirita el tractament. Aquest constructe tindrà la versatilitat suficient com per a poder adaptar-se a quasi qualsevol tipus de tractament, des del càncer fins a la regeneració de teixit, sempre que el requisit clau del tractament sega la necessitat de subministrar el tractament de manera localitzada, estable i controlada. Per a efectes de facilitar la compressió i el disseny del sistema es va escollir per a la prova de concepte materials i fàrmacs associats a la regeneració de teixits, com a tractament per a casos de ferides cròniques. El sistema en qüestió està constituït per tres elements principals: 1) El primer element són els conjugats polimèrics d'agents terapèutics que contribuiran a augmentar la selectivitat de l'acció terapèutica del fàrmac, així com també a millora l'estabilitat, biodisponibilitat i biocompatibilitat dels mateixos. En cas que el fàrmac sega hidrofòbic, la conjugació contribueix a augmentar la seua solubilitat en aigua, i en el cas d'usar proteïnes com a agents terapèutics, la conjugació contribueix a disminuir la resposta immunològica del cos incrementant les possibilitat d'èxit del tractament. 2) El segon element són microparticles polimèriques biodegradables, que en aquest cas actuen amb agents d'encapsulació per als conjugats polimèrics, permetent així comptar amb un segon punt de control en la cinètica d'alliberament de l'agent terapèutics. Simultàniament, les microparticles també compleixen un paper de texturitzant del constructe final, adjudicant-li propietats mecànica i fisicoquímiques que contribueixen a millorar la propietats biològiques del material final, com són l'afinitat, l'adhesió i la proliferació cel·lular. 3) El tercer element consisteix en una membrana polimèrica biodegradable nanoporosa feta per electrospinning, que constitueixen el element unificats del sistema, aporta manejabilitat al constructe i és en si mateix el ultimi punt de control en la cinètica d'alliberament de l'agent terapèutic. Aquest últim ha de ser biocompatible i estable en condicions ambientals, ja que probablement aquest exposat a l'ambient mentre protegeix la ferida, en el cas concret d'aquest tipus d'aplicació. Aquests tres elements que en si mateixos constitueixen sistemes complexos per separat, s'han combinat sistemàticament per a aconseguir una relació sinergètica entre ells de manera que cadascun potencia les qualitats dels altres dos. El constructe resultant es va caracteritzar demostrant tenir propietats característiques que es poden utilitzar com a paràmetre de control durant la fabricació del mateix. Així mateix estudis in vitro del sistema desenvolupat assenyalen que pot ser un bon candidat per al tractament de ferides cròniques entre altres patologies que requeriren tractaments localitzats. / Rodríguez Escalona, GDJ. (2016). DEVELOPMENT OF CONTROLLED DRUG DELIVERY SYSTEMS OF POLYMERIC NANOMEDICINES ASSOCIATED TO SCAFFOLDS FOR TISSUE REGENERATION [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63231