Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:51:08Z : No. of bitstreams: 1 semolin_lms_me_jabo.pdf: 459480 bytes, checksum: a04688b37ebdfeff1509f159e7641c20 (MD5) / O linfoma é uma doença linfoproliferativa caracterizada pela multiplicação clonal de linfócitos malignos no seio dos órgãos linfóides, afetando principalmente os linfonodos, ou outros órgãos viscerais sólidos, com prognóstico dependente de vários fatores, incluindo invasão tecidual. Enzimas proteolíticas MMP-2 e MMP-9 estão sendo estudadas quanto à importância neste processo de progressão tumoral por propiciarem a penetração e infiltração celular. Considerando a importância atual destas enzimas e o papel ainda não fundamentado nas neoplasias hematopoiéticas, avaliou-se a expressão de MMP-2 e MMP-9 em cães acometidos por linfoma multicêntrico e cães hígidos, através de técnica imuno-histoquimica de linfonodo e eletroforese zimográfica de linfonodo e soro, estabelecendo a relação entre a expressão destas enzimas e os fatores prognósticos como estadiamento, imunofenotipo e grau histopatológico da neoplasia e resposta ao tratamento. Observou-se maior expressão tecidual de MMP-9 nos animais com linfoma, através de técnica imuno-histoquimica, sem correlação exata com prognóstico. Eletroforese zimográfica do linfonodo demonstrou correlação da MMP-9 com imunofenótipo T e animais em doença progressiva, inferindo possível prognóstico negativo quanto à sobrevida. Valores de MMP-2 não apresentaram relação clara com o processo tumoral, assim como os valores séricos das duas enzimas. Desta forma, a MMP-9 demonstrou participação no processo neoplásico, porém sem determinação prognóstica exata / Lymphoma is a lymphoproliferative disease characterized by clonal proliferation of malignant lymphocytes within lymphoid organs, mainly affecting the lymph nodes, or other solid visceral organs, with prognosis depends on several factors, including tissue invasion. Proteolytic enzymes MMP-2 and MMP-9 have been studied as to the importance of tumor progression in this process by propitiate the penetration and cellular infiltration. Considering the current importance of these enzymes and the role not grounded in hematopoietic malignancies, we evaluated the expression of MMP-2 and MMP-9 in dogs affected by multicentric lymphoma and healthy dogs by immunohistochemistry technique of lymph node and zymography electrophoresis of lymph node and serum, establishing the relationship between the expression of these enzymes and prognostic factors such as tumor staging, immunophenotyping, histological grade and response to treatment. We observed increased expression of MMP-9 tissue in animals with lymphoma by immunohistochemistry technique, no exact correlation with prognosis. Zymography electrophoresis of lymph node demonstrated correlation of MMP-9 with T-cell phenotype and progressive disease, inferring possible negative prognosis regarding survival. Values of MMP-2 showed no clear relation with the tumoral process as well as serum levels of the two enzymes. Thus, MMP-9 demonstrated involvement in the neoplastic process, but without accurate prognostic determination

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2018-04-11T14:25:22Z No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2018-04-23T20:27:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T20:27:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Proteases are essential constituents of all living beings, since they are involved in essential biological processes such as blood clotting, cell death, tissue differentiation, protein transport across the membrane etc. They also have important biotechnological applicability, because they can be used in food processing, manufacture of detergents, leather processing, meat softening, drug formulation, in the textile industry etc. These enzymes represents about 60% of the global market for industrial enzymes; so, they are considered an important group of enzymes. This work was divided into two stages and aimed to isolate filamentous fungi collected from coconut trees and soil from a coconut located in Varzeas de Sousa, Paraiba, Brazil and do a screening for the production of proteases and to evaluate, in a bioreactor, the production of proteases by the yeast Rhodotorula mucilaginosa L07. In all, 32 fungi were isolated in Paraiba semiarid. They were grown in rotary shaker and sent to the analysis of proteolytic activity. The specie, originally called Fung1, showed better results in the qualitative stage and was taken to the molecular identification and selected for production in rotary shaker (30°C / 200rpm / 240h). R. mucilaginosa L07, originally from Antarctica, was cultivated in a bioreactor (25°C / 72h), varying agitation and aeration. The maximum enzyme activity by the Fung1, identified as Aspergillus tubingensis, was 29 U.mL^-1, after 144h cultivation. This fungus is not a fumonisin B2 and ochratoxin A producer. The greatest value of proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 was 124.88 U.mL^-1 with agitation of 500rpm and aeration 1,0vvm. The results indicated that A. tubingensis produces proteases, but other studies are needed to optimize production and classify proteases. The supply of oxygen to R. mucilaginosa L07 were positive for proteolytic activity, because it increased from 33.36 to 124.88 U.mL^-1 in rotary shaker and bioreactor, respectively. / Proteases são constituintes essenciais em todos os seres vivos, pois estão envolvidas em processos biológicos essenciais como coagulação sanguínea, morte celular, diferenciação de tecidos, transporte de proteínas através da membrana etc. Também possuem importante aplicabilidade biotecnológica, pois podem ser usadas no processamento de alimentos, formulação de detergentes, processamento de couro, amaciamento de carnes, formulação de medicamentos, na indústria têxtil etc. Por representarem aproximadamente 60% do mercado mundial de enzimas industriais, são consideradas um importante grupo de enzimas. Este trabalho foi dividido em duas etapas e objetivou isolar fungos filamentosos coletados em coqueiros e solo de um coqueiral localizado nas Várzeas de Sousa, Paraíba, Brasil e fazer um screening quanto à produção de proteases, além de avaliar, em biorreator, a produção de proteases pela levedura Rhodotorula mucilaginosa L07. Ao todo, 32 fungos foram isolados no semiárido paraibano, cultivados em agitador rotatório e encaminhados à análise da atividade proteolítica. A espécie inicialmente denominada Fung1 apresentou melhor resultado na etapa qualitativa, foi encaminhada à identificação molecular e selecionada para a produção em agitador rotatório (30°C/ 200rpm/ 240h). A R. mucilaginosa L07, coletadada na Antártida, foi cultivada em biorreator (25°C/ 72h), variando agitação e aeração. A atividade enzimática máxima do Fung1, identificado como Aspergillus tubingensis, foi 29 U.mL , após 144h de cultivo. Este fungo não é produtor de fumonisina B2 e ocratoxina A. O maior valor de atividade proteolítica da R. mucilaginosa L07 foi de 124,88 U.mL^-1 , com agitação de 500rpm e aeração de 1,0vvm. Os resultados indicaram que A. tubingensis produz proteases, porém outros estudos são necessários para otimizar a produção e classificar as proteases. O fornecimento de oxigênio em cultivos da R. mucilaginosa L07 foi positivo para a atividade proteolítica, pois a mesma aumentou de 33,36 para 124,88 U.mL^-1, em agitador rotatório e biorreator, respectivamente.

Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease. / The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease (keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease Q1) was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL 4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C, respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site, which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family (Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca2+ and Mg2+ and inhibited by Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure, but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new metalloprotease.

Foi levado a efeito estudo sobre formas múltiplas de aldolase de músculo de coelho. A enzima foi purificada a pH 7,5 por eluição com substrato a partir de coluna de fosfocelulose. A enzima foi ainda cristalizada por diálise dessas preparações contra solução saturada de sulfato de amônio. Formas múltiplas de aldolase foram obtidas por fracionamento a diferentes pI por eletrofocalização em gradiente de Ampholine na faixa de pH entre 7,0 a 10,0. Nessas condições foram separados cinco híbridos resultantes da associação ao acaso das sub-unidades α e β, os quais foram analisados em estado de dissociação a partir de proteínas carboximetiladas e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de uréia 8M. Foi também estudado o aparecimento de sub-unidade α e β em músculo de coelhos de idades que variavam de 1 a 240 dias, verificando-se que em coelhos de 1 dia existia apenas a proteína α4, surgindo sub-unidades β já em animais de 10 dias. / Not available.

A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease. / The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease (keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease Q1) was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL 4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C, respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site, which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family (Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca2+ and Mg2+ and inhibited by Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure, but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new metalloprotease.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 24640886 bytes, checksum: 4120e048629aa78cd493eb576212d8ca (MD5) Previous issue date: 2008-11-28 / The human immunodeficiency virus (HIV) can be divided into HIV-1 and HIV-2. The former can be divided into groups: M, N and O. Group M, which represents 90% of infections, is divided into several subtypes (A, B, C, D, F, G, H, J and K). It is known today that the most prevalent subtype in the world (and in Africa) is the subtype C, although the most studied is B (prevalent in the U.S. and Western Europe). Several stages the HIV-1 replicating cycle have been identified as a target for pharmacologic intervention. One of the main targets is the enzyme aspartyl protease (PR), which processes the viral polyproteins Gag and Gag-Pol. Its inhibition results in the formation of non-infectious virus particles. Currently 10 PR inhibitors are used in clinic. However, the emergence of resistance to these inhibitors leads to a therapeutic failure. Several mutated amino acid residues that are present in resistant isolates have been identified. One of such resistance mutations is the D30N, which confers primary resistance exclusively to nelfinavir, has been described in patients infected with subtype B. However, clinical and laboratory studies showed that virus of subtype C with the mutation D30N (CD30N) has low incidence in clinical and reduced adaptability in vitro. To try to understand these differences caused by mutation D30N in subtypes B and C, we studied the interaction of these PRs with the peptide KARVLAEAM (analogous to the natural substrate of cleavage between the protein the capsid (CA) and p2 of HIV-1) and with the inhibitor nelfinavir. We have also studied the PR CD30N with the compensatory mutations N83T or N88D, found in vitro and in vivo, respectively, which occur when the subtype C acquires the mutation D30N. This work aimed to study the molecular and atomic mechanisms of mutation D30N in the PR of subtypes B and C. The results showed that the inhibitor and backbone of models BD30N and CD30N/N83T possessed the greatest variation, with respect to the initial structure. Although the mutants CD30N and CD30N/N88T have not suffered similar variations, they showed, as well as the other two mutants, a reduction in the intensity of the h-bonds that occur between PR and inhibitor which are located near the catalytic and the flaps regions. Also, all mutants had reduced hydrophobic contacts between the receptor and the ligand. Some data indicated that the flap of one of the chains is highly immobile in a model CD30N suggesting the mutation D30N impairs the contact of flap with the substrate in subtype C. Also, the analysis of the PR structure interacting with the substrate, indicated that the CD30N mutant has one of its α-helix regions unstructured, which can be directly associated with substrate cleavage. Our work provides important insights in to the effect of D30N mutation in the PR structure of the subtype C, and on its interaction with the substrate and the inhibitor. These data confirm and explain, at least in part, the smaller incidence of the studied mutation in that genetic subtype of HIV-1. / O HIV pode ser dividido em HIV-1 e HIV-2. Aquele, por sua vez, pode ser divido nos grupos: M, N e O. O grupo M, que representa 90% das infecções, foi dividido em vários subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K). Sabe-se hoje que o subtipo mais circulante no mundo (a maior parte na África) é o C, entretanto o mais estudado é o B (prevalente nos EUA e Europa). Diversas etapas do ciclo replicativo do HIV-1 têm sido identificadas como alvos para intervenção farmacológica. Um dos principais alvos é a enzima aspartil protease (PR); é ela que processa as poliproteínas virais Gag e Gag-Pol e sua inibição resulta na formação de partículas virais não infecciosas, sendo atualmente 10 inibidores utilizados em clínica. No entanto, o aparecimento de resistência a esses inibidores leva à falha terapêutica, tendo sido identificados e estudados vários resíduos que se apresentam mutados em isolados resistentes. Uma dessas mutações de resistência é a D30N, que consiste numa mutação primária de resistência exclusiva ao nelfinavir descrita em pacientes soropositivos infectados pelo subtipo B. Entretanto, observações clínicas e laboratoriais mostraram que vírus do subtipo C com a mutação D30N (CD30N) têm baixíssima ocorrência clínica e adaptabilidade reduzida in vitro. Para tentar entender as diferenças causadas pela mutação D30N nos subtipos B e C, foi estudada a interação da PR destes vírus com o peptídeo KARVLAEAM (análogo ao substrato natural de clivagem entre a proteína do capsídeo (CA) e a proteína p2 do HIV-1) e com o inibidor nelfinavir. Também foi estudada a PR CD30N com as mutações compensatórias N83T e N88D, encontradas in vitro e in vivo respectivamente, que se manifestam quando o subtipo C sofre a mutação D30N. Este trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares e atômicos dos efeitos da mutação D30N na PR dos subtipos B e C. Os resultados mostram que o inibidor e o esqueleto peptídico dos modelos BD30N e CD30N/N83T sofreram as maiores variações, em relação à estrutura inicial. Embora os mutantes CD30N e CD30N/N88D não tenham sofrido variação semelhante, eles apresentaram, assim como os outros dois mutantes, uma redução na intensidade das ligações de hidrogênio que ocorrem entre a PR e o inibidor que estão localizadas próximas à região catalítica e aos flaps. Além disso, todos os mutantes apresentaram redução em seus contatos hidrofóbicos ocorridos na interação receptor/ligante. Alguns dados obtidos indicam que a alça de uma das cadeias é altamente imóvel no modelo CD30N sugerindo que a mutação D30N prejudica o contato do flap com o substrato no subtipo C. Além disso, a análise da estrutura das PRs, interagindo com o substrato, indicou que o mutante CD30N tem uma de suas regiões de α-hélice desestruturada, o que pode estar diretamente associado a não clivagem do substrato. O nosso trabalho provê importantes insights sobre o efeito da mutação D30N na estrutura da PR do subtipo C, bem como na sua interação com o substrato e com o inibidor. Tais dados corroboram e explicam, ao menos em parte, a menor ocorrência da mutação estudada naquele variante genético do HIV-1.

The human immunodeficiency virus (HIV) can be divided into HIV-1 and HIV-2. The former can be divided into groups: M, N and O. Group M, which represents 90% of infections, is divided into several subtypes (A, B, C, D, F, G, H, J and K). It is known today that the most prevalent subtype in the world (and in Africa) is the subtype C, although the most studied is B (prevalent in the U.S. and Western Europe). Several stages the HIV-1 replicating cycle have been identified as a target for pharmacologic intervention. One of the main targets is the enzyme aspartyl protease (PR), which processes the viral polyproteins Gag and Gag-Pol. Its inhibition results in the formation of non-infectious virus particles. Currently 10 PR inhibitors are used in clinic. However, the emergence of resistance to these inhibitors leads to a therapeutic failure. Several mutated amino acid residues that are present in resistant isolates have been identified. One of such resistance mutations is the D30N, which confers primary resistance exclusively to nelfinavir, has been described in patients infected with subtype B. However, clinical and laboratory studies showed that virus of subtype C with the mutation D30N (CD30N) has low incidence in clinical and reduced adaptability in vitro. To try to understand these differences caused by mutation D30N in subtypes B and C, we studied the interaction of these PRs with the peptide KARVLAEAM (analogous to the natural substrate of cleavage between the protein the capsid (CA) and p2 of HIV-1) and with the inhibitor nelfinavir. We have also studied the PR CD30N with the compensatory mutations N83T or N88D, found in vitro and in vivo, respectively, which occur when the subtype C acquires the mutation D30N. This work aimed to study the molecular and atomic mechanisms of mutation D30N in the PR of subtypes B and C. The results showed that the inhibitor and backbone of models BD30N and CD30N/N83T possessed the greatest variation, with respect to the initial structure. Although the mutants CD30N and CD30N/N88T have not suffered similar variations, they showed, as well as the other two mutants, a reduction in the intensity of the h-bonds that occur between PR and inhibitor which are located near the catalytic and the flaps regions. Also, all mutants had reduced hydrophobic contacts between the receptor and the ligand. Some data indicated that the flap of one of the chains is highly immobile in a model CD30N suggesting the mutation D30N impairs the contact of flap with the substrate in subtype C. Also, the analysis of the PR structure interacting with the substrate, indicated that the CD30N mutant has one of its α-helix regions unstructured, which can be directly associated with substrate cleavage. Our work provides important insights in to the effect of D30N mutation in the PR structure of the subtype C, and on its interaction with the substrate and the inhibitor. These data confirm and explain, at least in part, the smaller incidence of the studied mutation in that genetic subtype of HIV-1. / O HIV pode ser dividido em HIV-1 e HIV-2. Aquele, por sua vez, pode ser divido nos grupos: M, N e O. O grupo M, que representa 90% das infecções, foi dividido em vários subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K). Sabe-se hoje que o subtipo mais circulante no mundo (a maior parte na África) é o C, entretanto o mais estudado é o B (prevalente nos EUA e Europa). Diversas etapas do ciclo replicativo do HIV-1 têm sido identificadas como alvos para intervenção farmacológica. Um dos principais alvos é a enzima aspartil protease (PR); é ela que processa as poliproteínas virais Gag e Gag-Pol e sua inibição resulta na formação de partículas virais não infecciosas, sendo atualmente 10 inibidores utilizados em clínica. No entanto, o aparecimento de resistência a esses inibidores leva à falha terapêutica, tendo sido identificados e estudados vários resíduos que se apresentam mutados em isolados resistentes. Uma dessas mutações de resistência é a D30N, que consiste numa mutação primária de resistência exclusiva ao nelfinavir descrita em pacientes soropositivos infectados pelo subtipo B. Entretanto, observações clínicas e laboratoriais mostraram que vírus do subtipo C com a mutação D30N (CD30N) têm baixíssima ocorrência clínica e adaptabilidade reduzida in vitro. Para tentar entender as diferenças causadas pela mutação D30N nos subtipos B e C, foi estudada a interação da PR destes vírus com o peptídeo KARVLAEAM (análogo ao substrato natural de clivagem entre a proteína do capsídeo (CA) e a proteína p2 do HIV-1) e com o inibidor nelfinavir. Também foi estudada a PR CD30N com as mutações compensatórias N83T e N88D, encontradas in vitro e in vivo respectivamente, que se manifestam quando o subtipo C sofre a mutação D30N. Este trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares e atômicos dos efeitos da mutação D30N na PR dos subtipos B e C. Os resultados mostram que o inibidor e o esqueleto peptídico dos modelos BD30N e CD30N/N83T sofreram as maiores variações, em relação à estrutura inicial. Embora os mutantes CD30N e CD30N/N88D não tenham sofrido variação semelhante, eles apresentaram, assim como os outros dois mutantes, uma redução na intensidade das ligações de hidrogênio que ocorrem entre a PR e o inibidor que estão localizadas próximas à região catalítica e aos flaps. Além disso, todos os mutantes apresentaram redução em seus contatos hidrofóbicos ocorridos na interação receptor/ligante. Alguns dados obtidos indicam que a alça de uma das cadeias é altamente imóvel no modelo CD30N sugerindo que a mutação D30N prejudica o contato do flap com o substrato no subtipo C. Além disso, a análise da estrutura das PRs, interagindo com o substrato, indicou que o mutante CD30N tem uma de suas regiões de α-hélice desestruturada, o que pode estar diretamente associado a não clivagem do substrato. O nosso trabalho provê importantes insights sobre o efeito da mutação D30N na estrutura da PR do subtipo C, bem como na sua interação com o substrato e com o inibidor. Tais dados corroboram e explicam, ao menos em parte, a menor ocorrência da mutação estudada naquele variante genético do HIV-1.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-06T13:04:06Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1188137 bytes, checksum: 010a2962d49aa738285e5f27b77c15b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T13:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1188137 bytes, checksum: 010a2962d49aa738285e5f27b77c15b3 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The microbial communities play a fundamental role in the health of coral and their changes can lead to the onset of disease. Many diseases affect coral reefs in several parts of the world, however, little is known about the pathogenic agents and the factors that trigger the pathological process. In coastal reefs of Carapibus Beach of Conde (Paraiba state, Brazil), a tissue necrosis affects the zoanthid Palythoa caribaeorum. This study aimed to compare the diversity of culturable bacteria in the samples of healthy and necrotic tissue from the P. caribaeorum colony collected from the Carapibus reefs. The present work aimed also to analyze the production of proteolytic enzymes by isolated bacteria. The density of total heterotrophic bacteria in the necrotic tissue was higher than in healthy tissue of P. caribaeorum. Phylogenetic analysis of isolated bacteria based on the partial 16S rRNA gene sequences revealed that the majority of bacterial strains belonged to the Bacilli class of Firmicutes phylum (65.2%), followed by the Gamma Proteobacteria class (34.7%) of Proteobacteria phylum. The genus Bacillus was dominant among the strains of healthy tissue of P. caribaeroum, while among the bacteria of necrotic tissue the Bacillus and Vibrio were the most abundant. The higher number of strains belonged to the Vibrio genus were found in necrotic tissue (42.1%) in comparison with healthy tissue (9.6%). Among bacteria from healthy tissue were found also Staphylococcus sp. isolate and from necrotic tissue Marinobacter spp. and Alteromonas spp. isolates. Among the isolates from healthy tissue only Bacillus spp. showed proteolytic activity, while proteolytic isolates from necrotic tissue belonged to the genera: Bacillus, Vibrio, Alteromonas and Marinobacter. The data suggest that bacteria of the genus Vibrio and proteolytic bacteria may play a role in the development of tissue necrosis of zoanthid studied. / As comunidades microbianas desempenham um papel fundamental na saúde do coral, e suas alterações podem levar ao aparecimento de doenças. Muitas doenças afetam os corais dos recifes em várias partes do mundo, entretanto pouco se sabe sobre os agentes patogênicos e os fatores que desencadeiam o processo patológico. Nos recifes costeiros da praia de Carapibus, Conde (Paraiba, Brasil), uma doença necrosante afeta o zoantideo Palythoa caribaeorum. Em virtude disso, neste trabalho objetivou-se comparar a diversidade de bactérias cultiváveis nas amostras do tecido sadio e necrosado coletadas da colônia de P. caribaeorum dos recifes de Carapibus. Objetivou-se também analisar a produção de enzimas proteolíticas por bactérias isoladas. A densidade de bactérias heterotróficas totais no tecido necrosado foi maior que no tecido sadio. A análise filogenética dos isolados bacterianos realizada na base das sequencias parciais do gene RNAr 16S revelou que o maior número de isolados de bactérias pertenceram a classe Bacilli do filo Firmicutes (65,2%), seguida pela classe Gama-Proteobacteria (34,7%) do filo Proteobacteria. O gênero Bacillus foi predominante entre os isolados do tecido sadio de P. caribaeroum, enquanto entre as bactérias do tecido necrosado os gêneros Bacillus e Vibrio foram dominantes. Um número maior de isolados pertencentes ao gênero Vibrio foi encontrado no tecido necrosado (42,1%) em relação ao tecido sadio (9,6%) de P. caribaeorum. Foram encontradas também as bactérias Staphylococcus sp. no tecido sadio, Marinobacter spp. e Alteromonas spp. no tecido necrosado. Dentre os isolados do tecido sadio de P. caribaeorum, apenas o gênero Bacillus apresentou a atividade proteolítica, enquanto os isolados proteolíticos do tecido necrosado pertenceram aos gêneros: Bacillus, Vibrio, Alteromonas e Marinobacter. Os dados obtidos sugerem que as bactérias do gênero Vibrio e as bactérias proteolíticas podem desempenhar um papel no desenvolvimento da doença necrosante do zoantídeo estudado.