Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

A celulose é o polímero mais abundante na natureza, sendo sua biodegradação realizada por enzimas como exoglicanases, endoglicanases e b-glicosidases, denominadas celulases. Entre os microrganismos capazes de secretar estas enzimas, destacam-se os fungos filamentosos, como Trichoderma, Penicillium e Aspergillus. Neste trabalho, em sua primeira etapa foi selecionado o fungo Aspergillus phoenicis entre seis fungos filamentosos para a produção de celulases. Foram testados doze meios de cultivos diferentes, buscando a escolha de um meio de cultivo baseado em resíduos agroindustriais para a produção de enzimas celulásicas. O meio de cultivo composto por resíduo de uva e peptona foi escolhido para efetuar de otimização do meio de cultivo, por meio da metodologia de superfície de resposta, realizando o planejamento fatorial 2². O cultivo submerso do fungo foi realizado em frascos erlenmeyers de 250 mL, com 50 mL de meio de cultivo, na temperatura de 30ºC, durante 120 horas em agitador de plataforma, a 120 rpm. Foram mensuradas as atividades de celulases totais, endoglicanases, e b-glicosidases. A atividade enzimática presente no sobrenandante do meio de cultivo foi então caracterizada quanto a diferentes valores de pH, temperatura, termoestabilidade, presença de sais e reagentes. Os resultados demonstram que as enzimas presentes no sobrenadante bruto da cultura possuem melhores atividade entre os pHs 3,0 e 5,0, temperatura de 60 ºC, mantendo-se estável por duas horas de incubação. A atividade enzimática sofreu perdas quando incubada na presença de Hg2+ , Cu+2, detergentes e ßmercaptoetanol. / Cellulose is the most abundant polymer in the nature, being its degradation carried out by enzymes such as exoglicanases, endoglicanases and b-glicosidases, called cellulases. Among the microorganisms capable to secret this enzymes, the fungi distinguished the filamentous fungi, such as Trichoderma, Penicillium and Aspergillus are the most important microrganisms. In this work, the fungus Aspergillus phoenicis was selected among six others filamentous fungi for the production of cellulases. Twelve culture media based on agroindustrial waste for cellulase production were tested. Culture medium with the composition of waste grape and peptone was chosen for the optimization of process, with the help of the response surface methodology, through factorial planning 2². The fungus was cultivated at a temperature of 30 ºC and 120 rpm on shaker rotatory during 120 hours. The activity of total cellulases, endoglucanases and b-glucosidases were measured. The enzymatic activity was characterized for the different values of pH, temperature, thermostability and presence of ions and others composts. The results demonstrated that the crude enzymes have the optimum activity between pH 3,0 and 5,0, at 60 ºC, temperature that it was remained steady for two hours of incubation. The enzymatic activity suffered losses when incubate in the presence of Hg2+, Cu+2, detergents and ß-mercaptoetanol.

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Sorbitol e ácido glucônico são obtidos equimolarmente em reação catalisada por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. Visto que a demanda comercial do sorbitol é muito superior à do ácido glucônico, este trabalho objetivou aprofundar o conhecimento sobre a capacidade do complexo GFOR/GL de oxidar outras aldoses a seus respectivos ácidos orgânicos. O cultivo de Z. mobilis foi analisado visando a obtenção de biomassa, GFOR/GL e etanol. Em cultivo descontínuo em meio com 7,5 a 10,0 g/L de extrato de levedura bruto, obtiveramse cerca de 24 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g). Em regime descontínuo alimentado, atividade de 27 U/g e rendimento em etanol de 95% foram atingidos. A ação de GFOR/GL sobre diferentes pares frutose/aldoses foi avaliada com células permeabilizadas livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. Com 0,7 mol/L de frutose/glicose, em sistema imobilizado, as mais altas atividades foram medidas entre 47 e 50°C com pH de 7,8 a 8,2, constatando-se que um valor de pH mais alto no meio permite a ocorrência de um pH próximo ao ideal (6,4) no interior das esferas de alginato. Conforme os substratos são consumidos, com conseqüente redução da velocidade reacional, pHs mais baixos no meio externo são exigidos. Entre as aldoses testadas, a maior afinidade enzima / substrato foi observada com maltose e a menor com lactose. Devido às aplicações comerciais do seu produto de oxidação - ácido lactobiônico - lactose foi estudada em detalhes. Com 0,7 mol/L de lactose/frutose, a máxima velocidade específica de formação de ácido lactobiônico foi, em média, de 4,0 mmol/g/h, com células livres, a 39°C e pH 6,4, e de 2,0 mmol/g/h, com o sistema imobilizado, a 47ºC e pH 6,4. Os resultados indicam a viabilidade da produção de ácido lactobiônico por este processo, já que conversões superiores a 85 % são obtidas. / Sorbitol and gluconic acid can be obtained, in equimolar basis, by reaction catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL) of Zymomonas mobilis. Since the commercial demand for sorbitol is much larger than that for gluconic acid, the aim of this work was to achieve a deeper knowledge on the capacity of GFOR/GL complex in oxidising other aldoses to their respective organic acids. Z. mobilis cultivation was analysed with respect to growth and GFOR/GL and ethanol production. In batch cultivation in medium with 7.5 and 10.0 g/L of non-purified yeast extract, ca. of 24 GFOR/GL units per gram of dry cells (U/g) were obtained. In fed-batch mode, an activity of 27 U/g and an ethanol yield over 95% were achieved. The action of GFOR/GL on different fructose/aldose pairs was assessed with permeabilised cells, either free or immobilised in calcium alginate. With 0.7 mol/L of fructose/aldose, in immobilised system, the highest activities were measured between 47 and 50°C at pH 7.8-8.2, observing that higher pH values in the reaction medium led to the occurrence of pH values close to the optimum (6.4) in the inner space of alginate beads. As substrates were consumed, and as a consequence the reaction rate decreased, lower pH values in the external medium were needed. Among the aldoses tested, the highest enzyme - substrate affinity was observed for maltose and the lowest for lactose. Due to the commercial uses of its oxidation product - lactobionic acid - lactose was studied in details. With 0.7 mol/L of lactose/fructose, the maximum lactobionic acid specific production rate was in average 4.0 mmol/g/h with free cells, at 39ºC and pH 6.4, and 2.0 mmol/g/h with immobilised system, at 47ºC and pH 6.4. The results indicate the feasibility of producing lactobionic acid by this process, since conversion over 85% are obtained.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-26T21:11:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Valdir Gomes Neto.pdf: 3567159 bytes, checksum: e8a9174173b3c79e2959bd302c46de7a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T21:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Valdir Gomes Neto.pdf: 3567159 bytes, checksum: e8a9174173b3c79e2959bd302c46de7a (MD5) / FAPESB;CNPq;CAPES/PNPD;PETROBRÁS / O óleo obtido através das sementes de mamona possui diversas aplicações industriais, produzido na sua maior parte por pequenos agricultores na região do semiárido nordestino. A mamona possui boa adaptação a condições abióticas distintas sendo cultivada em todo território nacional, porém, em regiões com pouca disponibilidade de água sua produtividade é reduzida. Possui grande variabilidade genética, fisiológica e morfológica, que podem ser exploradas para melhoramento genético. O estresse por déficit hídrico tem sido apontado como principal causa da perda de produtividade, onde a melhor capacidade adaptativa a esse estresse tem sido associado com a melhor resposta de enzimas antioxidantes. A superóxido dismutase (SOD), primeira linha de defesa enzimática antioxidante, tem sido apontada como uma enzima chave na melhor tolerância de plantas a estresses. O objetivo desse trabalho foi caracterizar genótipos de mamona através da morfologia e fisiologia de suas sementes, a partir disso, definir dois genótipos contrastantes em vigor de sementes e avaliar o efeito do osmocondicionamento no vigor de sementes e atividade de superóxido dismutase. A partir da caracterização morfométrica das sementes foi possível categoriza-las em três grupos pelo volume (pequenas, médias e grandes). O genótipo IAC226, (semente pequena), e os genótipos NORDESTINA, ‘MPA34’ e ‘MPA11’ (semente média) apresentaram-se como melhores genótipos nos parâmetros fisiológicos, houve uma prevalência de genótipos com sementes de tamanho médio que obtiveram melhores resultados. Os genótipos ‘MPA34’ (maior vigor) e ‘BRS PARAGUAÇU’ (menor vigor) foram escolhidos para os teste de osmocondicionamento por apresentarem diferença no vigor de sementes, após o teste, mostraram resposta diferente ao osmocondicionamento, o genótipo ‘MPA34’ não apresentou melhoria na sua qualidade fisiológica enquanto que o genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ aumentou a porcentagem de plântulas normais (PPN) e massa seca (MS) alcançando o efeito de priming após este tratamento. As sementes de mamona mostraram padrão trifásico de embebição, porêm, sementes do genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ demonstraram embeber mais água durante a germinação. O genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ demonstrou maior atividade de SOD em sementes secas e menor variação da atividade de SOD tanto em radícula quanto em cotilédones, do que no genótipo ‘MPA34’, entre os potenciais osmóticos e tempos de embebição analisados. Isso parece estar relacionado ao melhor desempenho fisiológico do genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ sob as condições de estresse abiótico testadas.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-05-24T11:56:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Valdir Gomes Neto_PMBqBM-UFBA.pdf: 2810867 bytes, checksum: 03cf6e78c9d53eca8f187a213ab76936 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T14:38:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Valdir Gomes Neto_PMBqBM-UFBA.pdf: 2810867 bytes, checksum: 03cf6e78c9d53eca8f187a213ab76936 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T14:38:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Valdir Gomes Neto_PMBqBM-UFBA.pdf: 2810867 bytes, checksum: 03cf6e78c9d53eca8f187a213ab76936 (MD5) / FAPESB / O óleo obtido através das sementes de mamona possui diversas aplicações industriais, produzido na sua maior parte por pequenos agricultores na região do semiárido nordestino. A mamona possui boa adaptação a condições abióticas distintas sendo cultivada em todo território nacional, porém, em regiões com pouca disponibilidade de água sua produtividade é reduzida. Possui grande variabilidade genética, fisiológica e morfológica, que podem ser melhor exploradas para melhoramento genético. O estresse por déficit hídrico tem sido apontado como principal causa da perda de produtividade, onde a melhor capacidade adaptativa a esse estresse tem sido associado com a melhor resposta de enzimas antioxidantes. A superóxido dismutase (SOD) primeira linha de defesa enzimática antioxidante tem sido apontada como uma enzima chave na melhor tolerância de plantas a estresses. O objetivo desse trabalho foi caracterizar genótipos de mamona através da morfologia e fisiologia de suas sementes, a partir disso, escolher dois genótipos contrastantes em vigor de sementes e avaliar o efeito do osmocondicionamento no vigor através do vigor de sementes e da atividade de superóxido dismutase. A partir da caracterização morfométrica das sementes foi possível categoriza-las em três grupos pelo seu volume (pequenas, médias e grandes). O genótipo IAC226, (semente pequena), e os genótipos NORDESTINA, ‘MPA34’ e ‘MPA11’ (semente média) apresentaram-se como melhores genótipos nos parâmetros fisiológicos, houve uma prevalência de genòtipos com sementes de tamanho médio que obtiveram melhores resultados. Os genótipos ‘MPA34’ (maior vigor) e ‘BRS PARAGUAÇU’ (menor vigor) foram escolhidos para os teste de osmocondicionamento por por apresentarem diferença no vigor de sementes, após o osmocondicionamento mostraram resposta diferente ao osmocondicionamento, o genótipo ‘MPA34’ não apresentou melhoria na sua qualidade fisiológica enquanto que o genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ melhorou a porcentagem de plântulas normais (PPN) e massa seca (MS) alcançando o efeito de priming após o osmocondicionamento. As sementes de mamona mostraram padrão trifásico de embebição, porêm, sementes do genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ demonstraram embeber mais água durante a germinação. O genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ obteve menor variação da atividade de SOD tanto em radícula quanto em cotilédone que o genótipo ‘MPA34’ entre os potenciais osmóticos e tempo de embebição. A menor variação da atividade de SOD em radícula e cotilédone nos diferentes tempos de embebição e potenciais osmóticos e o efeito de priming alcançado pelo genótipo ‘BRS PARAGUAÇU’ pode indicar uma melhor tolerância a estresse hídrico em relação ao genótipo ‘MPA34’. / The oil obtained from the castor bean has multiple industrial applications, and is produced mostly by small farmers in the northeastern semiarid region of Brazil. Castor has good adaptation to different abiotic conditions being cultivated throughout the country, but in areas with limited availability of water the productivity is reduced. It has great genetic, physiological and morphological variability, which can be better exploited for breeding. The drought stress has been appointed as a major cause of productivity loss, where the best adaptive capacity to this stress has been associated with the best response of antioxidant enzymes. Superoxide dismutase (SOD) is the first line of antioxidant defense enzymes and has been identified as a key enzyme in better tolerance of plants to abiotic stresses. The objective of this study was to characterize the seed morphophysiology of castor bean genotypes, choose two contrasting genotypes in seed vigor and evaluate the effect of priming by means of seed vigor and activity of superoxide dismutase. From the morphometric characterization of the seeds was possible categorize them into three groups by their size (small, medium and large). The IAC226 (small seeds), and NORDESTINA, ‘MPA34’ and ‘MPA11’ genotypes (medium seeds) were presented as best genotypes in physiological parameters, where the prevalence of genotypes with medium-sized seeds have shown best germinability profiles. Genotypes ‘MPA34’ (best vigor) and ‘BRS PARAGUAÇU’ (lowest vigor) were chosen for the priming test for because of their contrasting differences in seed vigor, but which showed opposite physiological responses after priming, i.e. the ‘MPA34’ genotype did not present improvement in their physiological quality, while ‘BRS PARAGUAÇU’ genotype improved the percentage of normal seedlings (PPN) and dry matter (DM) as positive priming effects. Castor seeds showed the standard three-phase germination profile, however, seeds of ‘BRS PARAGUAÇU’ imbibed more water during germination. ‘BRS PARAGUAÇU’ had lower variation of SOD activity in both radicle as in cotyledons. The smallest variation of SOD activity in radicle and cotyledon in different times of imbibition and osmotic potential and the effect of priming reached by ‘BRS PARAGUAÇU’ may indicate a better tolerance to drought stress in relation to ‘MPA34’.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-05-24T11:42:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Thamires Soares Ricardos Jesus _ PMBqBM-UFBA.pdf: 1979322 bytes, checksum: 4e08f6205ef84e383e15af2cbc5bed3b (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-28T14:30:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Thamires Soares Ricardos Jesus _ PMBqBM-UFBA.pdf: 1979322 bytes, checksum: 4e08f6205ef84e383e15af2cbc5bed3b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T14:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Thamires Soares Ricardos Jesus _ PMBqBM-UFBA.pdf: 1979322 bytes, checksum: 4e08f6205ef84e383e15af2cbc5bed3b (MD5) / FAPESB / A mamona (Ricinus communis L.) apresenta um grande destaque na agricultura brasileira, devido a suas diversas aplicabilidades na indústria, sendo uma alternativa na geração de emprego e renda para o agricultor familiar da região semiárida do nordeste brasileiro. No armazenamento, a qualidade inicial das sementes e condições do ambiente influencia no processo de deterioração. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de diferentes condições de temperatura (T) e umidade relativa (UR) durante doze meses de armazenamento nas características fisiológicas e bioquímicas de sementes de Ricinus communis L.. Foram utilizadas sementes dos cultivares Nordestina e Paraguaçu, armazenadas em quatro condições diferentes: (1) com a umidade relativa e a temperatura controlada – URTC; (2) com o controle da umidade relativa – URC; (3) com o controle da temperatura – TC; (4) com umidade relativa e temperatura do ambiente de laboratório – URTAL. Os ensaios fisiológicos (germinação e teor de umidade) foram realizados mensalmente e para avaliar a viabilidade das sementes foi realizado o teste de tetrazólio a cada três meses. A atividade de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase - SOD, catalase - CAT e ascorbato peroxidase - APX) foram determinadas nas amostras a cada três meses. A umidade das sementes de Nordestina e Paraguaçu se mantiveram entre 3 a 7%, entretanto, o cultivar Nordestina apresentou melhores características fisiológicas, tendo germinação final máxima – GFM (86 - 100%), menor tempo para alcançar 50% de germinação - T50 (31 - 40 horas), melhor uniformidade durante a germinação - U8416 (3 – 16 horas), maior área abaixo da curva – AAC (51 - 69). A maior porcentagem de plântulas normais (56 - 96%), que apresentaram comprimento variando entre 42 a 80 mm, e massa seca entre 0,42 a 0,82g também foi do cultivar Nordestina. As sementes de Paraguaçu obtiveram GFM entre 27 a 83%, T50 entre 48 a 64 horas, foram mais desuniformes (17,8 – 36 horas), com menor AAC (9,62 – 39). As plântulas de Paraguaçu apresentaram maior variação no tamanho, na massa seca de plântulas normais que variou de 0,12 a 0,52g. As sementes de ambos os cultivares apresentaram diferença significativa quanto atividade da SOD ao comparar as diferentes condições em que foram mantidas, com exceção das sementes do cultivar Nordestina mantidas na condição TC. Houve diferença significativa na atividade da CAT das sementes mantidas na condição URC do cultivar Nordestina e nas condições TC e URTAL das sementes de Paraguaçu. A atividade da APX diferiu significativamente entre as sementes de Nordestina armazenadas em todas as condições e nas condições TC e URTAL para o cultivar Paraguaçu. Conclui-se que a UR e a T são fatores determinantes para o armazenamento adequado e que as sementes mantidas nas condições sem controle de UR apresentam redução significativa na qualidade, sofrendo grandes influências do ambiente de armazenamento. Estes resultados poderão ser utilizados para o desenvolvimento de protocolo de armazenamento de baixo custo e útil para agricultura familiar que mantêm a tradição no cultivo desta oleaginosa no semiárido brasileiro. / Castor bean (Ricinus communis L.) presents a major highlight in Brazilian agriculture because of its diverse applicability in the industry as an alternative to generate employment and income for family farmers in the semiarid region of Northeastern Brazil. The initial seed quality and environmental conditions influence the deterioration process during storage. In this context, the aim of this study was to investigate the effect of different relative humidity (RH) and temperature (T) conditions applied over twelve months of storage storage on the physiological and biochemical characteristics of R. communis seeds. Seeds of two cultivars (Nordestina and Paraguaçu) were stored in four different conditions: (1) controlled relative humidity and temperature – CRHT; (2) controlled relative humidity – CRH; (3) controlled temperature – CT; (4) relative humidity and temperature laboratory environment – RHTLE. Physiological tests (evaluation of germination and moisture content) were performed every month. Seed viability (tetrazolium test) and antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase - SOD, catalase - CAT and ascorbate peroxidase - APX) were determined in the samples collected every three months. The humidity of Nordestina and Paraguaçu seeds remained between 5-7% throughout the period of storage, however, Nordestina seeds showed better physiological characteristics, with maximum percentage of germination (Gmax) varying from 86 to 100%, time to reach 50% germination (T50) varying from 31 to 40 hours, uniformity of germination (U8416) varying from 3 to 16 hours and area under the curve –(AUC) varying from 51 to 69). Seeds of the cultivate Nordestina showed the highest percentage of normal seedlings (56-96%), which had length between 42 and 80 mm and dry weight between 0.42 to 0.82g. The seeds of the cultivate Paraguaçu obtained Gmax between 27 and 83%, T50 between 48 and 64 hours, uniformity varying from 17,8 to 36 hours, and lower AUC values varying from 9.62 to 39. Seedlings of cultivate Paraguaçu showed greater variation in size and, the dry weight of normal seedlings ranged from 0.12 to 0.52g. The seeds of both cultivars showed significant differences in SOD activity, except for the CT condition in the cultivar Nodestina. CAT activity of Nordestina seeds showed significant differences only for the CRH condition. CAT activity of Paraguaçu seeds, however, showed significant differences in CT and RHTLE. APX activity in Nordestina seeds showed significant difference in all storage conditions and activity in Paraguaçu seeds was only significant for CT and RHTLE conditions. It is concluded that RH and T are determining factors for the proper storage and that the seeds kept in conditions without controlled humidity showed a significant reduction in the quality. From these results, we intend to develop a low-cost storage protocol for proper storage conditions for family farming and its tradition in the cultivation of this oilseed in the Brazilian semiarid.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T09:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225836.pdf: 1172201 bytes, checksum: 6cef987593cfe31ef17852d62cb933d5 (MD5) / Os efluentes das indústrias papeleiras são constituídos de vários compostos fenólicos tóxicos. Dentre esses compostos, alguns de elevadas massas molares (MM) são biotransformados apenas por alguns organismos como fungos da classe Basidiomycota. Diversos estudos demonstram que a biotransformação da madeira por estes fungos depende principalmente de sua capacidade de produzir enzimas lignolíticas extracelulares como as lacases. As lacases catalisam oxidação de uma série de compostos aromáticos, especialmente compostos fenólicos. Várias aplicações vêm sendo sugeridas para essas enzimas, dentre elas, o seu uso na biorremediação de compostos fenólicos e, conseqüentemente, efluentes que possuam tais compostos. No entanto, a aplicação destas, como de quaisquer enzimas na forma livre, torna-se inviável devido a peculiaridades das mesmas, como o fato de perderem atividade em condições e meios densnaturantes. Dessa forma, para aumentar a estabilidade operacional das enzimas, as mesmas podem ser imobilizadas em suportes sólidos, que lhes conferem maior resistência à perda de atividade. Considerando isso, o presente trabalho teve como principal objetivo imobilizar a enzima lacase em esferas de quitosana e avaliar seu potencial para biotransformação de amostras do efluente de uma indústria de papel e celulose. Inicialmente foi possível observar que, apesar da enzima ter adquirido valores baixos de estabilidade operacional, tornou-se mais resistente a diversas condições e meios desnaturantes tais como: pH e temperatura elevados, presença de inibidores e solventes. Em um segundo momento, foram realizados ensaios de biotransformação das amostras de efluente com a enzima imobilizada. O processo de biotransformação foi acompanhado em diversos períodos de tempo pelos seguintes parâmetros: fenóis totais, fenóis de baixa MM, cor e DQO. Com base nos resultados obtidos foi possível observar que, após 24 horas de incubação da enzima imobilizada com o efluente, houve remoção de aproximadamente 65% de fenóis totais, 65% de fenóis de baixa MM e 60% de cor. Embora não se tenha observado modificações estatisticamente significativas nos níveis de DQO após tratamento enzimático, foi possível concluir que a enzima imobilizada em esferas de quitosana possui grande potencial de biotransformação dos compostos fenólicos que, por sua vez, são os que detêm os agentes químicos responsáveis pela elevada toxicidade desse tipo de efluente.

BASTOS, A. K. P. Estudo da seletividade de lipases para a obtenção de ésteres de ácidos graxos. 2013. 106 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2013-04-16T19:05:43Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_akpbastos.pdf: 2375431 bytes, checksum: 19e1d93fee5e4b1f8010c343b6af72d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2013-04-17T17:51:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_akpbastos.pdf: 2375431 bytes, checksum: 19e1d93fee5e4b1f8010c343b6af72d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-17T17:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_akpbastos.pdf: 2375431 bytes, checksum: 19e1d93fee5e4b1f8010c343b6af72d4 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Esters of fatty acids represent one of the most important classes of organic compounds due to ther variety of applications, such as flavoring, biopesticide, biodiesel and antimicrobials. Oils and fats industry as well as scientific researches have developed many different processes to manipulate composition of triglycerides mixtures. The aim is synthesis of esters from fatty acids by chemical or enzymatic routes. In this context, lipase is the most widely used enzyme due to several advantages related its specificity. The aim of this study was to evaluate the selectivity of immobilized lipases of Candida antarctica type B and Rhizopus oryzae compared to saturated (SFA) and unsaturated (UFA) fatty acids as well as their yield into ethyl esters. Selectivity was assessed with respect to oleic acid (unsaturated) and eicosanoic acid (saturated), obtained from chemical hydrolysis of fish oil Tilapia (Oreochromis niloticus), through 24 central composite design using agitation rate (rpm), temperature (°C), molar ratio (ethanol:fatty acid) and amount of enzyme (%wt) as independ variables (design factors). The amount of molecular sieve – zeolite 5 Å – (5 %wt) and reaction time (24 h) were fixed. Likewise, the behavior of both enzymes to the SFA was evaluated according to 23 central composite design where temperature (°C), molar ratio (ethanol:fatty acid) and amount of enzyme (%wt) were independ variables. The amount of molecular sieve – zeolite 5 Å – (5 %wt), stirring (180 rpm) and reaction time (24 h) were fixed and a mixture of palmitic and stearic acids was used as substrate. A confidence interval of 85% was considered for all statistical analyses. Regarding the esterification of fatty acids from hydrolyzed fish oil, both catalysts were selective for saturated eicosanoic acid rather than for the unsaturated acid. The design factors did not present significant effect on response variable when lipase from C. antarctica was used like catalyst. However all design factors presented an influence on the selectivity when lipase from R. oryzae was used like catalyst. In this way, lipase of C. antarctica lead to higher conversions of oleic acid into ethyl oleate and more significant variables have been found for the model when lipase of R. oryzae was uesd in assays. In the reaction medium containing the mixture of SFA, both lipases showed higher affinity for palmitic acid. The values range selected to evaluate the selectivity did not present significant effect on responses when lipase from C. antarctica was used, however that value range was significant for all assays performed using lipase from R. oryzae. The higher stearic acid conversions were obtained when lipase from C. antarctica was used like catalyst and all design factors were significant for both enzymes. / Os ésteres de ácidos graxos representam uma das mais importantes classes de compostos orgânicos devido à diversidade de aplicações, tais como aromas, biopesticida, biodiesel e antimicrobianos. O setor industrial de óleos e gorduras, bem como as pesquisas científicas, tem desenvolvido diversos processos para manipular a composição das misturas de triglicerídeos para a síntese de ésteres a partir dos ácidos graxos, por rota química ou enzimática. Nesse contexto, a lipase é a enzima mais amplamente utilizada por apresentar diversas vantagens relacionadas à sua especificidade. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a seletividade das lipases imobilizadas de Candida antarctica tipo B e de Rhizopus oryzae em relação aos ácidos graxos saturados (AGS) e insaturados (AGI), bem como a conversão destes em ésteres etílicos. A seletividade foi avaliada em relação ao ácido oleico (insaturado) e o ácido eicosanóico (saturado), obtidos na hidrólise química do óleo do peixe tilápia (Oreochromis niloticus). Para análise da seletividade foi realizado um planejamento experimental composto central 24, variando a velocidade de agitação (rpm), temperatura (ºC), razão molar (etanol:ácido graxo) e quantidade de enzima (%m), mantendo-se fixa a quantidade de peneira molecular – zeólita 5 Å – (5 %m) e o tempo reacional (24 h). Da mesma forma, o comportamento das enzimas em relação aos AGS foi avaliado segundo planejamento experimental composto central 23, variando temperatura (ºC), razão molar (etanol:ácido graxo) e quantidade de enzima (%m), mantendo-se fixa a quantidade de peneira – zeólita 5 Å – molecular (5 %m), agitação (180 rpm) e tempo reacional (24 h), utilizando como substrato uma mistura de ácidos palmítico e esteárico. Em todas as análises estatísticas foram considerados 85% de intervalo de confiança. Em relação à esterificação dos ácidos graxos do óleo de peixe hidrolisado, ambos os catalisadores foram seletivos para o ácido saturado eicosanóico. Quase todas as variáveis estudadas influenciaram na seletividade da lipase de R. oryzae, enquanto quase nenhuma foi significativa para a seletividade da lipase de C. antarctica. Quando a resposta estudada foi a conversão, a lipase de C. antarctica foi responsável pelas maiores conversões de ácido oleico em oleato de etila. Quando os ensaios foram realizados utilizando lipase de R. oryzae, mais variáveis significativas foram encontradas para o modelo de conversão. No meio reacional contendo a mistura de AGS, ambas as lipases apresentaram maior afinidade pelo ácido palmítico. A faixa de valores selecionada para avaliar a influência na seletividade não afetou significativamente a resposta da lipase de C. antarctica, mas foram todas significativas para a de R. oryzae. Quanto à conversão, a lipase de C. antarctica foi responsável pelas maiores conversões de ácidos esteárico e praticamente todas as variáveis selecionadas foram significativas para o modelo da conversão quando ambas as enzimas foram utilizadas.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-07T16:46:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T16:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. / A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. / Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo