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Modélisation de la reconnaissance et de la catalyse enzymatiques : Développements méthodologiques et détermination du mécanisme des Métionine Sulfoxyde Réductases de classe A / Modeling of enzymatic recognition and catalysis : methodological developments and determination of class A Methionine Sulfoxide Reductases mechanismThiriot, Eddy 04 June 2009 (has links)
La modélisation de la reconnaissance et de la catalyse enzymatiques a été abordée dans ce travail. Dans une première partie, un logiciel de docking (AlgoGen-DivCon), déterminant la structure optimale d'un système protéine-ligand, a été développé en combinant une méthode semi-empirique couplée à un algorithme à croissance linéaire (Divide & Conquer) pour la description du système et un algorithme génétique (AlgoGen) pour la recherche conformationnelle. Des tests sur différents systèmes, dont des complexes enzyme-substrat, ont été effectués pour valider l'approche. La seconde partie concerne l'étude du mécanisme (phase réductase) des méthionine sulfoxyde réductases de classe A (MsrA), catalysant la réduction de résidus méthionine oxydés (MetSO). A l'aide de simulations de dynamique moléculaire pour différents états de protonation du site actif de l'enzyme, nous montrons que l'ancrage du substrat est particulièrement favorable pour un état de protonation Glu94H et Cys51-. L'étude au niveau quantique du mécanisme de réduction, à partir du complexe michaélien, indique la formation d'une espèce "sulfurane" par protonation de la fonction sulfoxyde et création d'une liaison S-S avec Cys51. Le transfert d'un second proton provenant de Tyr134 (ou Tyr82) vers le groupement OH du sulfurane induit la formation d'une molécule d'eau et la dissociation de la liaison S-O. L'ion sulfuranyle résultant est enfin hydrolysé pour former un intermédiaire acide sulfénique et le substrat réduit. D'après le profil d'énergie, ce chemin pourrait être simplement décrit par un mécanisme concerté et asynchrone impliquant deux transferts de proton. / The modeling of enzymatic recognition and catalysis has been examined in this work. In the first part, a docking software (AlgoGen-DivCon) to determine the optimal structure of a protein-ligand system, has been developed. The molecular system has been described using a semiempirical method combined with a linear scaling algorithm (Divide & Conquer), while the conformational search has been performed by a genetic algorithm (AlgoGen). Tests on different systems, including enzyme-substrate complexes, have been conducted to validate the approach. The second part concerns the study of the mechanism (reductase phase) of class A methionine sulfoxide reductases (MsrA), which catalyzes the reduction of oxidized methionine residues (MetSO). By means of molecular dynamics for different protonation states of the enzyme active site, we have shown that the substrate docking is particulary favourable for a Glu94H and Cys51- protonation state. The quantum chemistry study of the reduction mechanism, starting from the Michaelis complex, indicates that the process is initiated by the formation of a "sulfurane" species, after protonation of the sulfoxide and simultaneous formation of a S-S bond with Cys51. A second proton transfer from Tyr134 (or Tyr82) to the sulfurane OH group induces the formation of a water molecule and the dissociation of the S-O bond. The resulting sulfuranyl ion is finally hydrolyzed to form a sulfenic acid intermediate and the reduced substrate. According to the energy profile, this path could be simply described as a concerted and asynchronous mechanism involving two proton transfers.
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Développement des stratégies d’identification en mode bottom-up pour l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI / Development of bottom-up identification strategies for MALDI Mass Spectrometric ImagingFranck, Julien 19 October 2009 (has links)
Depuis son introduction en 1997 par le groupe de RM Caprioli, l'analyse directe sur tissus et l'imagerie par spectrométrie de masse sont devenues des méthodes complémentaires des techniques « classiques » de protéomique. L'analyse directe sur tissus permet la détection de plusieurs centaines de molécules, tout en maintenant l'intégrité des tissus. Par l’automatisation de cette approche, des images moléculaires peuvent être ainsi obtenues. Cependant, de nombreux développements restent à faire notamment sur l’amélioration de la détection des différentes classes de biomolécules incluant les lipides, les peptides et les protéines. De plus, si la localisation de molécules d’intérêt est possible, l’information structurale des protéines reste encore un challenge. Si l'identification des protéines peut être délicate par protéomique « classique » cela est encore plus vrai avec l’analyse directe sur tissus. L’approche bottom-up est à l’heure actuelle une méthode permettant la localisation de la répartition des peptides générés par digestion enzymatique in situ et leur structure par analyse en mode MS/MS. Dans la plupart des cas, la MS/MS est utilisée pour vérifier la séquence d'un peptide endogène ou obtenue après digestion mais les spectres générés par les instruments équipés d'une source MALDI sont souvent complexes à analyser en raison des différentes séries d’ions fragment obtenues au cours du processus de fragmentation. Les séries d’ions obtenues sont largement incomplètes et ne donnent accès qu’à de petites séquences. Dans le but d’améliorer l’identification des protéines en mode bottom-up pour l’imagerie par spectrométrie de masse, nous avons étudié des dérivations chimiques N-terminal de peptides. Les peptides dérivés présentent alors des fragmentations vers une série d’ions majoritaire permettant une meilleure interprétation des spectres MS/MS. Cette méthode permet d’améliorer l’identification des protéines et le séquençage de novo directement sur coupes de tissus qui sont des points importants pour l’identification de marqueurs biologiques. / Since its introduction in 1997 by the group of R.M. Caprioli, direct tissue analysis and imaging by Mass Spectrometry have now become good complementary methods of classical proteomics techniques. Direct analysis of tissues gives access to the detection of hundreds of biomolecules while maintaining tissue integrity and by automation of this approach, molecular images of biomolecules distribution can be obtained in one step analysis. However, many developments need to be undertaken especially on the improvement of the detection of different classes of biomolecules including lipids, peptides and proteins. Moreover, if the localization of molecules of interest is possible but no structural information can obtained from proteins. If proteins identification can be delicate under classical proteomics conditions this is even truer by working directly on tissues. A bottom-up strategy will allow the identification and localization of proteins after MS/MS experiments of peptides generated after in situ enzymatic digestion. In most of cases, MS/MS is used to check the sequence of an expected endogenous peptide or obtained after digestion but MS/MS but spectra generated from instruments equipped with a MALDI ion source are often complex to analyze because of the different types of fragment series generated during the fragmentation process. This is especially true on MALDI-TOF systems that frequently for which weak fragmentations (especially in the higher m/z range of the MS/MS spectrum) and to very different series of fragment ions creating largely incomplete set of series only giving access to small sequence tags are often observed. Thus, we have studied on tissue N-terminal chemical derivatization of peptides for proteins identification in Bottom-up Imaging strategies. The derivatives promote efficient charge-site initiated cleavage of backbone amide bonds and they enable the selective detection of only a single series of fragment ions. Optimization of reactions were first performed at the whole tissue section scale and then modified and adapted to allow for the derivatization to be automatically performed using a micro-spotting piezoelectric automatic deposition device. Finally, we report a whole sequence of on tissue bottom up strategy followed by automatic derivatization and show that such strategies improve protein assignment and de novo sequencing directly from tissue sections, which is a key point for on tissue direct identification of markers.
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Contribution à l'intensification de procédés appliqués à la protéolyse enzymatique : Étude microcinétique en réacteur microfluidique et conception assistée par plasma froid d'un microréacteur à enzyme immobilisé / Contribution to process intensification applied to enzymatic proteolysis : Microkinetic study in microfluidic reactor and cold plasma-assisted design of an immobilized enzyme microreactorElagli, Adil 02 April 2015 (has links)
Des préoccupations d’ordre économique et environnemental ont introduit depuis quelques années déjà le concept d’intensification de procédés. En traitant de la maîtrise et de l’intensification de procédés enzymatiques, cette thèse s’est partagée en deux parties. La première s’est focalisée sur la mise en œuvre et l’étude microcinétique de réactions enzymatiques en microréacteur. Elle visait à optimiser la préparation d’un peptide opioïde à partir d’une réaction protéolytique, l’hydrolyse de l’hémoglobine bovine par la pepsine porcine. Tout d’abord, une modulation de la sélectivité cinétique de la réaction a été mise en évidence. Puis, en adoptant une démarche d’intensification, un couplage du microprocédé de protéolyse enzymatique à un microprocédé séparatif a été mis au point. Il a permis la récupération sélective et continue de l’hémorphine LVV-h7 par un enchaînement de deux extractions liquide-liquide consécutives. Au travers de l’ensemble de ces résultats, la première partie de ce travail de thèse tente de mettre en évidence quelques bénéfices attrayant que peut procurer l’utilisation de technologies microfluidiques en génie des procédés. Enfin, la deuxième partie de cette thèse s’est étendue à la conception d’un réacteur microstructuré à enzyme immobilisé en proposant l’utilisation exclusive d’un matériau organosilicié, le TétraMéthylDiSiloxane. La technologie des plasmas froids employée a d’abord permis la mise au point d’une méthodologie originale d’immobilisation enzymatique par piégeage stérique. Le protocole développé a ensuite permis d’imaginer la conception « bio-intégrante » d’un microréacteur à enzyme immobilisé, par polymérisation assistée par plasma. / New economic and environmental issues previously introduced the concept of process intensification since some years ago. Dealing with the control and the intensification of enzyme processes, this thesis was divided into two parts. The first part focused on the study of enzyme reactions in microreactor from a microkinetic perspective. It was intended to optimize the preparation of an opioid peptide from a proteolytic reaction, the hydrolysis of bovine hemoglobin by porcine pepsin. Firstly, a modulation of the reaction kinetic selectivity was highlighted. Then, on the basis of a sustainable approach, the enzymatic process was coupled to a separative process. It allowed the selective and continuous recovery of the hemorphin LVV-h7 by a sequence of two consecutive liquid-liquid extractions. Through all of the results, the first part of this thesis attempts to highlight some attractive benefits derived of the use of microfluidics in process engineering. Finally, the second part of this thesis has been extended to the design of a microstructured reactor with immobilized enzyme by exclusively using an organosilicon material, TetraMethylDiSiloxane. First, cold plasma technology allowed the development of an original methodology for enzyme immobilization by steric entrapment. Then, by using plasma-assisted polymerization, this protocol was used to design an immobilized enzyme microreactor according to a “bio-integrating” methodology.
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Caractérisation fonctionnelle d'une beta-xylosidase de lin (Linum usitatissimum L.) : rôle(s) potentiel(s) dans le métabolisme pariétal / Functional characterization of a flax (Linum usitatissimum L.) beta-xylosidase : potential role(s) in cell wall metabolismAddi, Mohamed 18 December 2008 (has links)
Le lin (Linum usitatissimum) fait partie des premières plantes cultivées dans le monde. Depuis toujours il est une source de fibres (périphloèmiennes) de très grande qualité pour l'industrie textile et connait actuellement un nouvel intérêt dans l'industrie des matériaux composites. Les fibres périphloèmiennes de lin possèdent des propriétés mécaniques remarquables grâce à la structure et la composition chimique de leurs parois cellulaires. Afin d'approfondir nos connaissances concernant la mise en place de la paroi cellulaire des fibres de lin, nous avons généré des ESTs à partir de tissus externes riches en fibres. La classification fonctionnelle des ESTs a permis l'identification de séquences codant une beta xylosidase potentielle (LuBXL1). La caractérisation fonctionnelle de plantes sous-exprimant (stratégie IR-PTGS) LuBXL1 n'as pas pu permettre la mise en évidence d'un phénotype macroscopique. En revanche, des analyses microscopiques ont suggéré des modifications éventuelles de la paroi des cellules xylèmiennes. La technique d'empreinte enzymatique a démontré une augmentation relative de l'oligoxyloglucanes XXXG dans les tissus internes de lignées sousexprimant LuBX1, associée une diminution dans la quantité relative de certains oligoxylanes. Ces observations suggèrent que chez le lin la sous-expression de LuBXL1 est associée à des modifications des hémicelluloses pariétales. / Flax (Linum usitatissimum) has been a source of high quality fibers (bast fibers) for several thousand years. The fibers are currently used in the textile industry but also increasingly in the fabrication of composites. The interesting mechanical properties of these bast fibers depend upon the structure and chemical composition of their cell walls. ln order to improve our knowledge about the mechanisms underlying cell wall formation in flax fibers we produced ESTs from outer tissues, rich in fibers. Functional classification of ESTs allowed the identification of sequences coding a potential beta-xylosidase (LuBXL1). LuBXL1 down-regulated (IR-PTGS) plants did not show any visible phenotype. However, microscopie analysis suggested that down-regulation could have affected xylem cell wall structure. Enzymatic Fingerprinting indicated a relative increase in the relative quantity of the XXXG oligoxyloglucans in stem inner tissues of down-regulated lines, together with a relative decrease in the quantity of certain oligoxylans. These observations suggest that the down-regulation of LuBXL1 in flax is associated with modifications in cell wall hemicelluloses.
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Layered double hydroxides and their composites : design, synthesis and specific applications / Hydroxydes doubles lamellaires et dérivés : conception, synthèse et applications spécifiquesGrosu, Elena-Florentina 05 April 2019 (has links)
Explorer les caractéristiques à l'échelle nanométrique de la matière et la combiner avec d’autres matériaux, permettent la fabrication de nouveaux objets avec des fonctionnalités améliorées, pour une utilisation potentielle dans le domaine biomédical, la catalyse, l'ingénierie, l'électronique, la biotechnologie, etc… Les argiles anioniques, également appelées des Hydroxydes Doubles Lamellaires (HDL), constituent une catégorie de matériaux hydrotalcite qui possèdent une grande variété de compositions et une capacité d'auto-assemblage. Lorsque ces HDL sont utilisés en présence de systèmes biologiques, ils agissent comme des matériaux soft, sans effet significatif sur les biomolécules constitutives. Dans ce contexte, le sujet de thèse porte sur la conception de matériaux HDL nanostructurés, leur caractérisation physico-chimique et leur utilisation en photocatalyse, biomédecine et biochimie. La première partie de ce travail aborde la fabrication de nanoparticules auto-assemblées (NP) sous forme de matériaux Au, In, Ag et Ga sur ZnHDLs en utilisant la co-précipitation suivie par une étape de reconstruction/imprégnation. Les techniques de caractérisation utilisées ont montré que les nouveaux matériaux avaient une structure hydrotalcite, qu'ils étaient cristallins et que, après reconstruction, la structure initiale était récupérée. Les nanomatériaux NP/HDL ont montré une activité de photodéposition élevée lorsqu'ils étaient irradiés sous une lumière solaire simulée et étaient capables de photodégrader des polluants organiques tels que le phénol, le p-nitrophénol, l'acétophénone et le diclofénac. L'amélioration des performances des matériaux hybrides néoformés, par rapport à leurs matériaux d'origine, est une conséquence de la formation d'une séparation superficielle entre les NP dispersés et la surface d'argile, ce qui conduit à une diminution du taux de recombinaison. La seconde partie de cette thèse étudie les interactions entre les matériaux ayant pour base HDL ou Au/HDL et l'enzyme Peroxydase de raifort (HRP). Les résultats ont montré que les produits HDL résultant de la calcination de l’argile à 550° C sont capables d’immobiliser l’enzyme par adsorption, avec reformage de la structure en couches. Les données cinétiques ont montré que seuls les matériaux sans AuNPs conservent l'activité de l'enzyme, alors que ceux contenant les AuNPs dans leur structure sont « enzymatiquement » inactifs. Le concept de dégradation photo-enzymatique du phénol sous irradiation solaire et en présence de biohybride HRP/HDL a également été confirmé. Le résultat a montré un effet synergique de la dégradation enzymatique et photocatalytique. De plus, il a été démontré que HRP peut influencer la libération de particules d’Au de la surface des Au/HDL lors de la formation de complexes HRP-AuNPs. Dans une seconde étude, le cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) a été régénéré à partir de NAD+ en présence de Au/HDL, de lumière solaire et en utilisant de la flavine mononucléotide (FMN) comme médiateur électronique. À une valeur de pH égale à 8, la régénération du NADH était totale dans un intervalle de temps de deux heures. Dans la dernière partie de ce travail de thèse, les interactions entre les matériaux Au/HDL et le virus de l'hépatite B (VHB) ont été étudiées. Les données de cytotoxicité ont montré que les matériaux HDL n’avaient pas d’influence significative sur la viabilité des cellules. De manière remarquable, les formulations Au/HDL ont montré qu’elles peuvent inhiber la prolifération du VHB. Les HDL bruts manifestent une activité antivirale modeste. / Exploring the nano scale features of the matter and combining together different materials, novel composites with enhanced features can be fabricated, for their further utilization in biomedicine, catalysis, engineering, electronics, biotechnology and others. The anionic clays, also called layered double hydroxides (LDHs) are a category of hydrotalcite composites which possess high compositional variety, able to self-assembly. When used in presence of biological systems, they act as soft materials, with no significant effect over the constituent biomolecules. In this context, the thesis subject deals with the design of nanostructured composites LDHs type, for their further physicochemical characterization and utilization in photocatalysis, biomedicine and biochemistry. The first part of this work approaches the fabrication of self-assembled nanoparticles (NPs) as Au, In, Ag, and Ga on ZnLDHs materials by using co-precipitation, followed by reconstruction or impregnation synthesis methods. The applied characterization techniques proved that the novel materials have a hydrotalcite structure, they are crystalline and after reconstruction, the initial structure is recovered. The nanomaterials NPs/LDHs showed high photo-response activity when irradiated under simulated solar light and they were able to photodegrade organic pollutants as phenol, p-nitorphenol, acetophenone and diclofenac. The enhancement of hybrids performance, compared with their parent materials, is a consequence of the formation of surface separation between dispersed NPs and clay surface, which leads to recombination rate decrease. The second part of this thesis investigates the interactions between the LDHs or Au/LDHs based materials and Horseradish Peroxidase (HRP) enzyme. The results proved that the LDHs products resulted after clay calcination at 550 °C are capable to immobilize the enzyme via adsorption, with layered structure reformation. The kinetic data showed that only the materials without AuNPs retain the enzyme activity, while those with AuNPs in their structure are enzymatically inactive. The concept of photo-enzymatic degradation of phenol under solar irradiation and in presence of HRP/LDH biohybrid was also confirmed. The result was expressed as the synergetic effect between the enzymatic and the photocatalytic degradation. Furthermore, it was demonstrated that HRP can mediate the gold release from Au/LDH surface through HRP-AuNPs complex formation. In a separate study the nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) cofactor was regenerated from NAD+ in presence of Au/LDH, solar light and using flavin mononucleotide (FMN) as an electron mediator. At a pH value of 8, the NADH regeneration was total in a time interval of two hours. In the last section of this work, the interactions between Au/LDHs materials and hepatitis B virus (HBV) were investigated. The cytotoxicity data have been demonstrated that the LDHs materials had no significant influence over cells viability. Remarkably, the Au/LDHs formulations have shown that they can inhibit the HBV proliferation. The parent LDHs materials manifest a modest antiviral activity.
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Purification de la RuBisCO à partir de la Luzerne, hydrolyse enzymatique, identification, structure-fonction des peptides bioactifs et leur valorisation dans des produits alimentaires / Purification of RuBisCO from Alfalfa, enzymatic hydrolysis, identification, structure-function of bioactive peptides and their valorisation in food productsKobbi, Sabrine 14 December 2017 (has links)
La luzerne est la plante la plus cultivée dans le monde et est une excellente source de protéines. Cependant, la RuBisCO a montré le plus d'intérêt. Cette protéine a été étiquetée comme la protéine la plus abondante sur terre, elle constitue environ 65% (p/p) des protéines solubles de la luzerne. Dans ce travail une nouvelle méthode a été mise en place pour la purification de la RuBisCO à partir de la poudre de luzerne 10% (p/v) en utilisant deux solvants différents et l’effet du pH. Premièrement, des méthodes d’analyse qualitative et quantitative ont été utilisées pour confirmer l’efficacité de la méthode de purification qui pourrait remplacer certains procédés industriels classiques. Puis, une hydrolyse pepsique a été réalisée sur la RuBisCO purifiée qui aboutit à une forte population peptidique bioactive. Les peptides finaux de 24h d’hydrolyse ont montré une meilleure activité antibactérienne ou antioxydante par rapport aux autres hydrolysats. 9 nouveaux peptides antibactériens ont été identifiés et caractérisés par SM et qui ont un CMI entre 2-6mM contre quatre espèces de bactéries: B subtilis, E coli, L innocua et M luteus. En plus, des fractions peptidiques antioxydantes ont également été identifiées dans ce travail. Et leur activité antioxydante a été évaluée par différents tests in vitro et in vivo sur l’huile de Colza. Enfin, l’addition du peptide RDRFL issu de l’hydrolyse pepsique de la RuBisCO a montré un effet positif sur la prolongation de la durée de conservation de la viande hachée et de la purée de tomate. / Alfalfa is an excellent source of protein. However, RuBisCO proteins showed most interest. Indeed, this protein has been labelled the most abundant on earth; it constitutes about 65% (w/w) of soluble leaf protein of Alfalfa. In this work, a new method was introduced for the purification of RuBisCO from alfalfa powder 10% (w /v), using two different solvents and pH effect. In a first step, the performance of the proposed RuBisCO recovery method was evaluated through qualitative and quantitative analysis and the results obtained showed that this new method could replace some conventional industrial processes. In a second step, enzymatic hydrolysis was carried out on the purified RuBisCO, which resulted in a large bioactive peptide population. The final peptides after 24h of hydrolysis showed better antibacterial or antioxidant activity compared to the other peptide hydrolysates. Nine new antibacterial peptides have been identified and characterized by MS and have a MIC of 2-6 mM against four species of bacteria: B subtilis, E coli, L innocua and M luteus. In addition, antioxidants peptide fractions were identified in this work, their antioxidant activity was evaluated by various in vitro and in vivo tests on oil of Colza. Finally, the addition of peptide RDRFL derived from the peptic hydrolysis of RuBisCO has a positive effect on the prolongation of the shelf life of minced meat and of tomato puree.
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Clonage et caractérisation de NL1, une nouvelle enzyme de la famille de l'endopeptidase neutreGhaddar, Galia January 1999 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Étude de l'extraction enzymatique des huiles d'argousier (Hippophaë rhamnoides)Quesada Romero, Sandra Viviana. January 1900 (has links) (PDF)
Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Titre de l'écran-titre (visionné le 25 mars 2009). Bibliogr.
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Cinétique et modélisation de réacteurs à glucoamylase soluble et immobilisée.Marc, Annie. January 1900 (has links)
Th.--Chim.--Nancy--I.N.P.L., 1985.
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Cinétique enzymatique d'une réaction exothermique en phase hétérogène et sous pression : réacteur utilisant la catalase immobilisée pour la décomposition de l'eau oxygénée.Bilhou-Bougnol, Viviane, January 1900 (has links)
Th. doct.-ing.--Chim. minérale phys.--Saint-Étienne--École nationale supérieure des mines, 1976. N°: 6 C.I.
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