Orientador: Edson Arantes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lintomen_Leticia_D.pdf: 1121941 bytes, checksum: 2c92a8ddfce83c01ed6c71e524096e0b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os eosinófilos participam da patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo infecções parasíticas e doenças alérgicas. Dentre as doenças alérgicas, a eosinofilia tem presença marcante na asma. Atualmente, a asma afeta 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada um problema de saúde pública mundial. A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve interações entre fatores externos e genéticos, e tem como características principais a inflamação pulmonar e a hiperresponsividade brônquica. O recrutamento de eosinófilos para as vias aeríferas contribui para o caráter crônico da asma. A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo, que é regulado por numerosos fatores, incluindo citocinas, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e interações de moléculas de adesão. Estudos prévios investigaram as interações funcionais entre NO e CC-quimiocinas. Young e colaboradores (1999) mostraram que o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de macacos desafiados está marcadamente aumentado 24 horas após o desafio, e que este aumento é acompanhado de altos níveis de NO no ar exalado e de eotaxina no LBA. Em pacientes com rinite, a eotaxina aumentou o número de eosinófilos no fluido do lavado nasal e também os níveis de NO nasal (Hanazawa et al., 1999). Em contraste, em modelos murinos de asma a inibição seletiva da NOS induzível resultou na redução da migração eosinofílica para os pulmões (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), que estava associada com o aumento da expressão da CC-quimiocina proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-1) no tecido pulmonar (Trifilieff et al., 2000). Além disso, NO (ou doadores de NO) também são capazes de inibir a produção de RANTES (Frank et al., 2000). O NO via formação de peroxinitrito (ONOO-) também pode reduzir a migração de eosinófilos induzida por eotaxina (Sato et al., 2000). Entretanto, o papel modulatório do NO nas funções do eosinófilo mediadas por CC-quimiocinas ainda permanece contraditório. Portanto, o presente trabalho investigou o efeito modulatório do NO na adesão aumentada, quimiotaxia e desgranulação do eosinófilo induzidas pelas Ccquimiocinas eotaxina e RANTES in vitro, e a expressão de VLA-4 e Mac-1 na superfície do eosinófilo. Nós realizamos ensaios funcionais (adesão e desgranulação), análise da expressão de moléculas de adesão por citometria de fluxo (VLA-4 e Mac-1) e a investigação de resíduos de tirosina nitrada para avaliar interações do NO com CC-quimiocinas em eosinófilos humanos. Os ensaios de MTT mostraram que as incubações de eosinófilos por 2, 3, ou 4 horas com eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não afetam a viabilidade celular e, em determinadas condições, até promovem a ativação das células. Os resultados de adesão à fibronectina mostraram que a eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não aumentam a adesão de eosinófilos em períodos de incubação de 2 e 3 horas. Entretanto, a incubação de eosinófilos por 4 horas com eotaxina ou RANTES aumentou significativamente a adesão à fibronectina. O L-NAME (0.1 mM), individualmente, aumentou significativamente a adesão de eosinófilos à fibronectina; porém a co-incubação de L-NAME com eotaxina (ou RANTES) não afetou a adesão observada com cada agente isoladamente. Além disso, a expressão de VLA-4 e de Mac-1 não foi modificada em nenhuma das condições experimentais testadas. Eotaxina e RANTES também não foram capazes de aumentar os níveis de GMPc nos eosinófilos, em condições onde o SNP (0.1 mM), usado como controle positivo, aumentou significativamente os níveis desse segundo mensageiro. Além disso, eosinófilos tratados com L-NAME, eotaxina e RANTES, individualmente, foram capazes de desgranular estas células, mas a co-incubação de LNAME com eotaxina (ou RANTES), não alterou esta resposta. Os resultados de quimiotaxia mostraram migração significativa de eosinófilos (tratados ou não com LNAME) em resposta à eotaxina ou RANTES. Os resultados obtidos de Western blotting para 3-nitrotirosina mostraram ausência de proteínas nitradas nos eosinófilos de indivíduos sadios ou asmáticos. No conjunto, nossos resultados mostram que, nas condições experimentais estabelecidas, o NO não modula adesão, migração e desgranulação em eosinófilos estimulados com eotaxina ou RANTES / Abstract: Eosinophils participate in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including parasitic infections and allergic diseases. Of the allergic diseases, asthma is characterized by eosinophilia. Currently, asthma affects 300 million people in world, and is an important public health problem. Asthma is an inflammatory chronic disease that involves interactions between external and genetic factors, and has lung inflammation and bronchial hyperresponsiveness as major features. The recruitment of eosinophils into airways contributes to the asthma chronic character. The eosinophil migration to inflamed tissue is a complex process regulated by several factors, including cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and adhesion molecule interactions. Previous studies have investigated the functional interactions between NO and CC-chemokines. Young et al. (1999) showed that the number of eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of challenged monkeys is markedly increased at 24 h post-challenge, accompanied by higher levels of both exhaled NO and eotaxin in BAL fluid. In rhinitis patients, eotaxin increased the number of eosinophils in the nasal lavage fluid, and that was also accompanied by elevated nasal NO levels (Hanazawa et al., 1999). In contrast, in murine models of asthma, selective inhibition of inducible NOS resulted in a reduction in pulmonary eosinophil migration (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), with an increased expression of the CC-chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the lung tissue (Trifilieff et al., 2000). Moreover, NO (or NO donors) have also been shown to inhibit the production of RANTES (Frank et al., 2000). Nitric oxide via peroxynitrite (ONOO-) formation is reported to reduce eotaxin-induced eosinophil migration (Sato et al., 2000). However, the modulatory role of NO in the CC-chemokines-mediated eosinophil functions is still not well understood. Therefore, the present study was designed to investigate the modulatory effect of NO in the enhanced eosinophil adhesion, chemotaxis and degranulation induced by the Ccchemokines eotaxin and RANTES in vitro, and the expression of VLA-4 and Mac-1 on the eosinophil surface. We therefore carried out functional assays (adhesion and degranulation), flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) and investigation of tyrosine nitration to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines in human eosinophils. MTT assays showed that incubation of eosinophils for 2, 3 or 4 hours with eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not affect cellular viability and, in some conditions, even caused cellular activation. The results of adhesion to fibronectin showed that eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not increase eosinophil adhesion at 2 or 3 hours of incubation. Nevertheless, the incubation of eosinophils for 4 hours with eotaxin or RANTES significantly increased adhesion to fibronectin. L-NAME (0.1 mM), alone, significantly increased eosinophil adhesion to fibronectin; however the co-incubation of L-NAME with eotaxin (or RANTES) did not affect the adhesion of each agent. Moreover, expression of VLA-4 and Mac-1 were not modified by any of the experimental conditions. Eotaxin and RANTES did not increase eosinophil cGMP levels under the same conditions in which SNP (0.1mM), used as a positive control, significantly increased the levels of this second messenger. Furthermore, eosinophils treated with L-NAME, eotaxin and RANTES, alone, demonstrated degranulation, however the co-incubation of eosinophils with L-NAME and eotaxin (or RANTES) did not alter this response. Chemotaxis assays showed a significant eosinophil (treated or not with L-NAME) migration in response to eotaxin or RANTES. Western blotting for 3-nitrotyrosine-3 showed a lack of nitrated proteins in eosinophils from healthy or asthmatic donors. Taken together, results show that, under the experimental conditions established, NO does not modulate adhesion, migration and degranulation in eotaxin or RANTES-stimulated eosinophils / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Introdução: A doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) refratária pode estar relacionada à maior sensibilização a alimentos pelo dano ácido-péptico às junções intercelulares e/ou pelo aumento do pH gástrico pelos inibidores de bomba de prótons (IBPs). A falha na resposta ao tratamento da DRGE tem sido atribuída, entre outras causas, à esofagite eosinofílica (EE). Objetivo: O objetivo principal do estudo foi avaliar a sensibilização a alimentos nos pacientes com DRGE refratária. Como objetivos secundários, comparamos as características dos pacientes sensibilizados com os não sensibilizados e verificamos a resposta clínica da DRGE à dieta de restrição aos alimentos aos quais o paciente estava sensibilizado. Métodos: Os pacientes com DRGE refratária realizaram dieta de restrição baseada no resultado de teste cutâneo de leitura imediata (TCLI) e teste cutâneo de contato (TCC) com alimentos. As características dos pacientes sensibilizados foram comparadas com os não sensibilizados com relação à atopia e número de eosinófilos na mucosa esofágica. Resultados: A prevalência de sensibilização a alimentos nos pacientes com DRGE refratária foi de 27,7%, sendo 15,3% pelo TCLI e 12,3% pelo TCC. Os asmáticos apresentaram maior sensibilização a alimentos (p=0,008). Foi identificada a presença de eosinófilos na mucosa esofágica em 15,8% dos pacientes e esta correlacionou-se com maior sensibilização a alimentos (p=0,011). Foi confirmado um caso de EE. A dieta de exclusão aos alimentos identificados promoveu melhora clínica dos sintomas da DRGE (p=0,004). Conclusão: A presença de eosinófilos na mucosa esofágica associada à maior sensibilização a alimentos e a resposta à dieta de exclusão em pacientes com testes positivos sugere que a DRGE refratária pode representar um estágio inicial da EE. / Abstract: Refractory gastroesophageal reflux disease (GERD) can be related to greater sensitization to foods due to peptic acid damage to intercellular junctions and/or due to the increase in gastric pH by proton pump inhibitors (PPIs). The lack of response to treatment of GERD has been attributed to, among other causes, eosinophilic esophagitis (EE). Objective: The principal objective of the study was to evaluate the sensitization to foods in patients with refractory GERD. As secondary objectives, we compared the characteristics of sensitized patients with those non-sensitized and found a clinical response of GERD to a diet restricting foods to which the patient was sensitized. Methods: Patients with refractory GERD were put on a restriction diet based on the results of skin prick test (SPT) and atopy patch test (APT) with foods. The characteristics of the sensitized patients were compared to those non-sensitized in relation to atopia and number of eosinophils in the esophageal mucosa. Results: The prevalence of sensitization to foods in patients with refractory GERD was 27.7%, where 15.3% were determined by SPT and 12.3% by APT. Asthmatics showed higher sensitization to foods (p=0.008). The presence of eosinophils in the esophageal mucosa was determined in 15.8% of patients, and this correlated with greater sensitization to foods (p=0.011). One case of EE was confirmed. A diet excluding identified sensitizing foods led to clinical improvement with regard to GERD symptoms (p=0,004). Conclusion: The presence of eosinophils in esophageal mucosa associated with greater sensitization to foods and the response to restriction diet in patients with positive tests suggest that refractory GERD can represent an initial stage of EE.

O diabetes mellitus (DM) e a asma são doenças de elevada incidência mundial. Embora ambas as doenças sejam comuns, há uma correlação negativa entre elas, uma vez que o aparecimento de DM, em pacientes previamente asmáticos, determina uma melhora do quadro asmático, em contrapartida, a insulina agrava a asma. O presente estudo avaliou o papel da insulina na vigência da inflamação alérgica crônica pulmonar em camundongos diabéticos e sadios. Para tanto, foram utilizados camundongos machos, da linhagem BALB/C, tornados diabéticos (aloxana, 50 mg/kg, i.v., 10 dias). Os animais foram sensibilizados com ovalbumina (OVA - 20 µg, e Al(OH)3 -2 mg) 10 dias após a injeção de aloxana e receberam a mesma dose após 12 dias, após 6 dias da última sensibilização os animais foram expostos a nebulização durante 7 dias, com solução de OVA (5 mg/mL), ou salina (SAL). Os animais diabéticos e asmáticos foram separados em dois diferentes grupos, para receberem dois tratamentos distintos de insulina, um tratamento com uma única dose de insulina e outro tratamento com doses consecutivas de insulina, sempre antes dos desafios. Após 24h do último desafio foram feitas as seguintes análises: a) o número de células no fluído de lavado broncoalveolar (LBA), leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) quantificação das concentrações de citocinas (IL1 β, TNF-α, IL-6, IL-4, IL-10, VEGF, TGF-ß) no sobrenadante do fluído de LBA pela técnica de ELISA; c) análise morfológica do tecido pulmonar através de cortes histológicos e coloração em hematoxilina e eosina (H/E) e d) deposição e quantificação de colágeno e muco no tecido pulmonar através de análise morfométrica em cortes histológicos corados com Tricômico de Massom e ácido periódico de Schiff (PAS), respectivamente. Comparados aos controles, camundongos diabéticos apresentaram redução de infiltrado inflamatório (34%) no fluído de LBA e de IL-1β (87%). Ambos os grupos apresentaram leve marcação de colágeno e ausência de muco. Os animais não diabéticos desafiados com OVA, apresentaram um aumento de infiltrado inflamatório (44%) no fluído de LBA com presença de eosinófilos (25%), presença de eosinófilos (34%) no sangue periférico, aumento das concentrações de IL-4 (70%) , deposição de colágeno (72%), e presença de muco, quando comparado ao animal controle. Os animais diabéticos desafiados com OVA apresentaram parâmetros similares aos animais diabéticos que receberam nebulização com SAL. O tratamento dos animais diabéticos com dose única de insulina corrigiu completamente os níveis de celularidade no fluído de LBA, a presença de eosinófilos no sangue periférico, e os níveis de concentrações de IL-4 e IL-1β, mas não corrigiu a deposição de colágeno ao redor das vias aéreas e secreção de muco. Já o tratamento com doses consecutivas corrigiu completamente os níveis de infiltrado inflamatório do LBA, presença de eosinófilos tanto no fluído de LBA como no sangue periférico, os níveis de concentrações de IL-1β, deposição de colágeno e secreção de muco. A concentração de IL-10 não diferiu entre os grupos e as demais citocinas analisadas não foram detectadas no ensaio de enzima-imunoensaio utilizado. Em conjunto estes dados sugerem que a insulina deva regular o remodelamento das vias aéreas em modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar em camundongos diabéticos controlando o infiltrado inflamatório, a produção de IL-1β, e consequentemente, a deposição de colágeno e secreção de muco. / Diabetes mellitus (DM) and asthma are diseases of high incidence worldwide. Although both diseases are common, there is a negative correlation between them, since the appearance of DM in asthmatic patients previously determines an improvement in asthma profile, however, insulin exacerbates asthma. This study evaluated the role of insulin in the presence of chronic pulmonary allergic inflammation in diabetic mice and healthy. To this end, male mice were used in BALB / C strain, made diabetic (alloxan, 50 mg / kg, i.v., 10 days). Animals were sensitized with ovalbumin (OVA - 20 mcg, and Al (OH) 3 -2 mg) 10 days after the injection of alloxan and received the same dose at 12 days after 6 days after the last sensitization animals were exposed to nebulized for 7 days with OVA solution (5 mg / ml) or saline (SAL). Diabetics and asthmatic animals were divided in two different groups to receive two different insulin treatment, a treatment with a single dose of treatment with insulin and other insulin consecutive doses of ever before challenge. 24 hours after the last challenge the following analysis: a) the number of cells in the bronchoalveolar lavage (BAL), white blood cell count and blood sugar (glucose monitor); b) quantifying the concentrations of cytokines (IL-1 β, TNF-α, IL-6, IL-4, IL-10, VEGF, TGF-ß) in the BAL supernatant by ELISA; c) morphological analysis of lung tissue by histological sections and stained with hematoxylin and eosin (H / E) and d) deposition and quantification of collagen and mucus in the lung tissue by morphometric analysis of histological sections stained with trichrome of Massom and periodic acid Schiff (PAS), respectively. Compared to controls, diabetic mice showed a reduction of inflammatory infiltrate (34%) in the BAL, IL-4 concentrations (54%) and IL-1β (87%). Both groups showed slight marking of collagen and no mucus. Non-diabetic mice challenged with OVA had an increased inflammatory inflammatory infiltration (44%) in the presence of BAL eosinophils (25%), eosinophils (34%) in peripheral blood, increase in IL-1β (44%), collagen deposition (72%) and presence of mucus compared to control animals. Diabetic animals challenged with OVA showed similar patterns to those diabetic animals given nebulization with SAL. Treatment of diabetic rats with a single dose of insulin completely corrected the cellularity levels in BAL eosinophils in peripheral blood and the levels of IL-1β concentrations, but did not correct deposition of collagen around airways and mucus secretion. Since treatment with consecutive doses completely corrected levels of the inflammatory infiltrate of the BAL eosinophils in both the peripheral blood and BAL, the levels IL-1β concentrations, deposition of collagen and mucus secretion. The IL-10 concentration did not differ between groups and other cytokines analyzed were not detected in the test enzyme-immunoassay used. Together these data suggest that insulin is to regulate airway remodeling in an experimental model of allergic lung inflammation in diabetic mice controlling the inflammatory infiltration, IL-1β, and therefore, deposition of collagen and secretion mucus.

O parênquima pulmonar periférico tem sido estudado como um componente da resposta inflamatória na asma. Durante uma constrição induzida, a resistência do tecido aumenta em diferentes modelos de asma. Aproximadamente 60% dos pacientes asmáticos possuem respostas imediata e tardia. A resposta tardia é caracterizada por obstrução mais grave de vias aéreas. No presente estudo, foi avaliada a mecânica de fatias de parênquima pulmonar em cobaias sensibilizadas com ovoalbumina (OVA), tentando reproduzir ambas as repostas imediata e tardia. A mecânica oscilatória de fatias pulmonares foi realizada em um grupo controle (C), em um grupo de resposta imediata (IM) e em dois grupos de resposta tardia: 17 (T1) e 72 (T2) horas após o último desafio com ovoalbumina. Medidas de resistência (R) e elastância (E) foram obtidas antes e depois do desafio com OVA nos grupos C e IM e antes e depois do desafio com Acetilcolina (ACh) em todos os grupos. Com o uso de morfometria, foram avaliadas as densidades de eosinófilos e de células musculares lisas, assim como o conteúdo de colágeno e elastina nas fatias pulmonares. Os valores de R e E basais e pós-agonista estão aumentados nos grupos IM, T1 e T2 quando comparados com o grupo C (p = 0.001). A análise morfométrica mostrou um aumento na densidade de eosinófilos nas fatias de tecido periférico dos grupos IM e T2 quando comparados com o grupo C (p < 0.05). Houve uma correlação positiva significante entre a densidade de eosinófilos nas fatias de parênquima dos grupos C, T1 e T2 e os valores de R e E pós-ACh (r = 0,71, p = 0.001 e r = 0,74, p < 0.001, respectivamente). Os resultados mostram que o parênquima pulmonar está envolvido na resposta tardia deste modelo de inflamação alérgica crônica e que a resposta constritora nesta fase está relacionada à inflamação eosinofílica. / The peripheral lung parenchyma has been studied as a component of the asthmatic inflammatory response. During induced constriction, tissue resistance increases in different asthma models. Approximately 60% of the asthmatic patients show early and late responses. The late response is characterized by more severe airway obstruction. In the present study, we evaluated lung parenchymal strips mechanics in ovalbumin-sensitized guinea pigs, trying to reproduce both early and late inflammatory responses. Oscillatory mechanics of lung strips were performed in a control group (C), in an early response group (ER), and in two late response groups: 17 (L1) and 72 (L2) hours after the last ovalbumin challenge. Measurements of resistance and elastance were obtained before and after ovalbumin challenge in C and ER groups and before and after Acetylcholine challenge in all groups. Using morphometry, we assessed the density of eosinophils and smooth muscle cells, as well as collagen and elastin content in lung strips. The baseline and post-agonist values of resistance and elastance were increased in ER, L1 and L2 groups compared with C (p = 0.001). The morphometric analysis showed an increase in alveolar eosinophil density in ER and L2 groups compared with C group (p < 0.05). There was a significant correlation between eosinophil density in parenchymal strips of C, L1 and L2 groups and values of resistance and elastance post-Acetylcholine (r = 0.71, p = 0.001 and r=0.74, p < 0.001, respectively). The results show that the lung parenchyma is involved in the late response of this guinea pig model of chronic allergic inflammation and the constriction response in this phase is related to the eosinophilic inflammation.

I NTRODUÇÃO: A refratariedade aos inibidores da bomba de prótons (IBP) tem sido o grande desafio dos gastroenterologistas. Este trabalho visa caracterizar os pacientes que persistem com sintomas típicos de doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), em uso de inibidores de bomba de prótons em doses de, pelo menos 40mg/dia, quanto aos aspectos demográficos, clínicos e laboratoriais, determinando-se a freqüência da persistência de refluxo ácido pela pH-metria esofágica de 24h. Secundariamente procurouse determinar a freqüência da esofagite eosinofílica nessa população. MÉTODO: Foram entrevistados 110 pacientes que apresentavam persistência de sintomas de pirose e/ou regurgitação em uso de pelo menos 40 mg de IBP por pelo menos 6 semanas. Os mesmos foram submetidos à endoscopia digestiva alta (EDA) com biópsia esofágica, manometria, pHmetria esofágica de duplo canal e exames laboratoriais. RESULTADOS: Dos pacientes avaliados, 77,3% eram do sexo feminino, com média de 46 anos e predomínio de baixa escolaridade. Apenas 10,9% eram tabagistas, 55% apresentavam índice de massa corpórea (IMC) acima de 25Kg/m2, sendo o IMC médio de 27Kg/m2. Entre as comorbidades, as mais freqüentes foram: alergias (72,7%); hipertensão arterial (34,5%), asma (18,2%), depressão (29,1%) e fibromialgia (8,2%), sendo estas duas últimas maiores que a encontrada na população geral. Observou-se freqüência elevada de sintomas dispépticos (70% dos pacientes relataram epigastralgia e 70% plenitude pós-prandial), disfagia (60,9%); globus (37,3%), tosse (37,3%) e dor torácia não cardíaca (30,9%). Apenas 16,4% evidenciavam à endoscopia, lesão em corpo esofágico e 23,6% hérnia de hiato. A maioria dos pacientes (61,8%) apresentava alguma alteração à manometria esofágica. Encontrou-se, entre os pacientes estudados, 24,6% com pHmetria positiva (8,1% no canal distal e 16,45% no proximal) e 75,4% com pH-metria normal. Comparando-se os resultados desses dois grupos de pacientes (pH-metria positiva e normal), segundo as variáveis estudadas, apenas a presença de lesão no corpo esofágico à endoscopia e a elevada escolaridade evidenciaram associação com persistência de pH-metria positiva (p: 0,0061 OR: 4,11 IC: 1,43:11,84 e p: 0,0237 OR: 2,74 IC: 1,13: 6,67 respectivamente). Ao se comparar presença de sintomas atípicos com a presença de refluxo ácido (no esôfago proximal versus distal), apenas globus apresentou associação com pH-metria positiva no canal proximal. Foi diagnosticado um único caso de esofagite eosinofílica entre os pacientes com sintomas típicos de DRGE refratários ao IBP. CONCLUSÃO: DRGE refratária predomina em mulheres de meia idade, associada à alta freqüência de história de alergia, depressão, fibromialgia e sintomas dispépticos. Segundo os resultados da pH-metria, a presença de esofagite erosiva em uso do IBP ou elevada escolaridade foram os únicos fatores de risco para a persistência de refluxo ácido nos dois canais, e globus no canal proximal. Não se observou diferença entre os pacientes com pH-metria positiva ou normal quanto às demais variáveis, até mesmo sintomas dispépticos. É baixa a freqüência de esofagite eosinofílica entre pacientes com pirose e/ou regurgitação refratários ao inibidor da bomba de próton / BACKGROUND: Proton pump inhibitor (PPI) refractory patients have been a big challenge to gastroenterologists. The aim of this study was to characterize the patients that had gastroesophageal reflux disease (GERD) persistent typical symptoms, undergoing PPI medication, administered at a dose of at least 40 mg/day, according to demographic, clinical and laboratory aspects. The primary outcome was to determine the frequency of acid reflux persistence based on the 24-hour esophageal pH-metry result. The secondary outcome was to determine, the frequency of eosinophilic esophagitis in the same population. METHODS: We interviewed 110 patients that presented persistence of heartburn and/or regurgitation symptoms and were undergoing treatment with PPI at a minimum dose of 40 mg/day for at least six weeks. They underwent upper gastrointestinal endoscopy with esophageal mucosa biopsy, esophageal manometry and double probe 24- hour esophageal pH-metry, as well as laboratory tests. RESULTS: 77.3% of the evaluated patients were female, with mean age of 46 years old, and most of them with low educational level. Only 10.9% were tobacco smokers and 55% had body mass index (BMI) greater than 25Kg/m2, showing mean BMI of 27Kg/m2. The most frequent comorbidities were allergy (72.7%), arterial systemic hypertension (34.5%), asthma (18.2%), depression (29.1%) and fibromyalgia (8.2%). Comparing the general population and the group of patients, a higher frequency of depression and fibromyalgia was observed. Some symptoms were found in high frequency: dyspeptic symptoms (70% associated with epigastric pain and 70% with postprandial fullness), dysphagia (60.9%), globus and cough (37.3% each) and no-cardiac chest pain (30.9%). By endoscopy, only 16.4% showed esophageal body lesion and 23.6% hiatal hernia. Most patients (61.8%) presented some alteration in esophageal manometry. Among studied patients, 24.6% had abnormal pHmetry (8.1% in distal probe and 16.45% in the upper probe) and 75.4%, a normal result. When comparing normal to abnormal pH-metry patients according to studied variables only the presence of esophageal body lesion, observed by endoscopy, and high educational level were associated to the persistence of abnormal pH-metry (p: 0.0061; OR: 4.11; IC: 1.43:11.84; and p: 0.0237; OR: 2.74; IC: 1.13: 6.67; respectively). When comparing atypical symptoms with the presence of acid reflux (proximal versus distal esophagus) only globus was associated with abnormal upper probe pHmetry. Only one patient was diagnosed with eosinophilic esophagitis among the total sample with typical gastroesophageal reflux symptoms refractory to PPI treatment. CONCLUSION: Refractory GERD was predominant in middleaged females, associated with high frequency of previous allergy, depression, fibromyalgia and dyspeptics symptoms. The risk factors to the persistence of acid reflux in the two pH-metry probes and to the symptom of globus in the upper pH-metry probe were the persistence of erosive esophagitis in patients undergoing treatment with PPI an a higher educational level. No differences between abnormal or normal pH-metry results patients were found regarding the other variables, such as dyspeptic symptoms. The frequency of eosinophilic esophagitis was low in heartburn and/or regurgitation in PPI refractory patients

Orientador : Edson Antunes / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:23:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SquebolaCola_DalizeMaria_D.pdf: 2153841 bytes, checksum: 6875f2a61e54f0142d388da72f0f97be (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Staphylococcus aureus é um tipo de bactéria gram-positiva que produz e secreta uma série de enterotoxinas com propriedade imunomoduladoras. Estudos epidemiológicos mostraram que S. aureus exacerba doenças respiratórias alérgicas, aumentando também o risco de manifestação das mesmas. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos na exacerbação do influxo celular observado em indivíduos asmáticos expostos a enterotoxinas estafilocócicas. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos responsáveis pela exacerbação da resposta inflamatória pulmonar alérgica em camundongos pré-expostos à enterotoxinas estafilocócicas dos tipos A e B (SEA e SEB) respectivamente. Foram também investigados os efeitos da SEA e SEB na função eosinofílica in vitro (adesão e quimiotaxia). Utilizamos animais pré- expostos à SEA (4 a 48 h) ou SEB (4 a 24 h) antes do desafio com OVA. A pré-exposição à SEA (12 h, 24 h e 48 h) aumentou significativamente o número de eosinófilos no tecido pulmonar em animais desafiados com OVA, o qual foi acompanhado por aumento dos níveis de eotaxina no tecido pulmonar. Na medula óssea, observamos aumento do número de eosinófilos em (24 h e 48 h) acompanhado de aumento dos níveis de IL-5 e eotaxina, e uma redução da expressão de CCR3 e VLA-4 e redução da adesão de eosinófilos a ICAM-1 e VCAM-1. No sangue periférico observamos eosinofilia em 4 h, 12 h e 24 h, retornando aos níveis basais em 48 h. Em relação à SEB observamos um aumento de eosinófilos no tecido pulmonar de animais pré-expostos a esta enterotoxina (4 h, 12 h e 24 h) e desafiados com OVA. O infiltrado eosinofílico pulmonar foi acompanhado de aumento dos níveis de eotaxina e IL-8 e diminuição de IL-4 e IL-6. Na medula óssea observamos um aumento do número de eosinófilos, o qual não foi acompanhado dos níveis de IL-5 e eotaxina. Concluímos que exposição das vias aéreas a SEA potencializa o influxo eosinofílico pulmonar em animais desafiados com OVA, por mecanismos dependentes de IL-5 e eotaxina. Na medula óssea, observamos ainda diminuição da expressão de CCR3 e VLA-4 e prejuízo da adesão celular para VCAM-1. A pré-exposição à SEB também aumenta o influxo eosinofílico pulmonar alérgico provavelmente por mecanismos envolvendo a eotaxina. Na medula óssea, se observou elevação do número de eosinófilos por mecanismos independentes de IL-5 e eotaxina. Para se estudar o efeito direto das enterotoxinas estafilocócicas (EEs) em eosinófilos humanos, realizou ensaios funcionais (quimiotaxia e adesão), análise da fosforilação da p38 MAPK e mobilização de cálcio intracelular. A incubação de eosinófilos com SEA (3 ng/ml) diminuiu a quimiotaxia de eosinófilos em resposta à eotaxina (300 ng/ml), PAF (10-5 M) e RANTES (100 ng/ml) em todos os tempos (0,5 h, 2 h e 4 horas), e as concentrações estudadas (0,5; 1 e 3 ng/ml). Em relação à SEB (30 ng/ml), não notamos diferenças na resposta quimiotática, exceto para a concentração de 1 ng/ml, que foi capaz de inibir a quimiotaxia em resposta à eotaxina. A incubação com SEA e SEB diminuiu a adesão de eosinófilos ativados com eotaxina em placas recobertas com ICAM-1 e VCAM-1. A incubação com SEA e SEB diminuiu a fosforilação da p38 MAPK e a mobilização de cálcio em resposta à eotaxina. Sendo assim, nós concluímos que SEA e a SEB modula negativamente a resposta de eosinófilos humanos in vitro / Abstract: Gram-positive Staphylococcus aureus releases classical enterotoxin which aggravates allergic airway diseases. However, little is known about the mechanisms underlying the cell influx exacerbation in asthmatic individuals under exposure to Staphylococcal enterotoxins. Recent study in our group showed that SEA pre-exposure in OVA challenge mice increase the eosinophils influx for lung tissues and broncoalveolar lavage (BAL) and also increase the eosinophils number in bone marrow. These eosinophils increases in BAL were accompanied for increase of the TNF? and eotaxin. Therefore, the objective of the study, was deepen the know about the responsible mechanisms of the SEA and SEB exacerbation in allergy pulmonary inflammation mice. Were investigated also, the effects of SEA and SEB in eosinophils functions (chemotaxis and adhesion). Mice were exposed to SEA at 4 h, 12 h, 24 h, 48 h and SEB 4 h, 12 h and 24 h prior to OVA challenge or prior PBS instillation. The SEA pre-exposed 12 h, 24 h and 48 h increase the eosinophils number in the lung tissues and in 48 h of the BAL. This increased was preceded of the high eotaxin levels. In the bone marrow we observed a increased of eosinophils number in 24 h and 48 h of SEA pre-exposed, accompanied of the IL-5 and eotaxin increase and the CCR3 and VLA-4 dowregulation and decrease of the eosinophils adhesion function. In blood, we observed an increase of eosinophils number in 4 h, 12 h and 24 h of the SEA pre-exposed returned in the basal levels in 48 h. In relation of SEB, we observed of the pre-exposed of SEB in OVA challenge mice increased of eosinophils number in lung tissues in all the study time (4 h, 12, and 24 h). In the BAL, we observed of the SEB pre-exposed increased the eosinophils number only in 4 h in OVA challenge mice. Also in pulmonary ambit, we observed a high eotaxin (4 h, 12 h) and IL-8 (4 h) levels and a decreased of the IL-4 and IL-6 in all the study time. In bone marrow, the SEB pre-exposed of the 4 h and 12 h, increase the eosinophils number in OVA challenge mice, not accompanied of the high IL-5 and eotaxin levels. In the first part, airways exposure to SEA produces a marked eosinophil recruitment to the lung tissue of allergic mice that is clearly detected at prolonged times of this enterotoxin exposure (24 and 48 h before OVA challenge). Eosinophils accumulate in BM at these same time-periods of SEA exposure through IL-5- and CCR3-dependent mechanisms, along with down-regulation of CCR3 / VL4 and impaired cell adhesion to VCAM-1. On the other hand, eosinophils time-dependently disappear from circulating blood after SEA exposure. Already the airways exposure to SEB produces a marked eosinophil recruitment to the lung tissue of allergic mice that is clearly detected at early times of this enterotoxin exposure and increase of eosinophils number in BM at these same time-periods of SEB exposure through IL-5 and eotaxin-independent mechanisms. It is likely that alterations of BM function are an early step for the progression of asthmatic disease and exacerbation by Staphylococcal enterotoxin. Understanding the mechanisms that regulates bone marrow eosinophil mobilization and its trafficking to the peripheral circulation and airways in allergic animals may be important for the development of effective asthma therapies in conditions of Staphylococcal superantigen exposure. To study the direct effects of the SEs in eosinophils performed the functional assays (chemotaxis and adhesion), p38 MAPK phosphorylation and calcium mobilization. The number of migrated eosinophils was significantly decrease in eosinophils incubated with SEA in the times (30 min, 2 h and 4 h) and SEA concentration (0,5, 1 and 3 ng/ml) to chemotaxis agent, eotaxin, and RANTES, compared with control eosinophils. In relation of the SEB (30 ng /ml), not differences in chemotaxis was found. Only in the SEB concentration of the 1 ng/ml observed decrease of chemotaxis in eotaxin response. In the adhesion, we observed a decreased in eosinophils incubated with SEA and SEB in response of ICAM-1 and VCAM-1. The p38 MAPK phosphorylation and calcium mobilization was decrease in eosinophils incubated with SEA and SEB in eotaxin response. Therefore, we conclude that SEA and SEB was capable of the dowregular of the human eosinophils response / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the rodent model of multiple sclerosis (MS), a chronic autoimmune neuroinflammatory disease that has a devastating impact on various neurological functions of the patients. The hallmarks of both, MS and EAE, are neuroinflammation, demyelination and neuroaxonal degeneration. Various types of lymphoid and myeloid cells were shown to infiltrate the central nervous system and to participate in disease pathology. However, the role of eosinophil granulocytes has been less explored thus far. An early study showed that eosinophils infiltrate into the spinal cord of EAE mice and suggested their role in the disease progression. Recently, it was reported that eosinophils can play a protective role against EAE when mice are treated with an extract from helminths. Furthermore, it was shown that EAE development is not altered in mice deficient for interleukin-5, an important eosinophil pro-survival factor. Taken together, the role of eosinophils in EAE is currently unclear and needs to be investigated in detail. In the present study, we use the active model of EAE, whereby we immunized the C57BL/6 mouse strain with MOG35-55 peptide emulsified in the complete Freund’s adjuvant, in order to study a possible contribution of eosinophils to the disease pathology. Using the flow cytometry and RT-qPCR analysis of the spinal cord, we show that eosinophils infiltrate into the tissue in the course of EAE. The infiltration is likely driven by eosinophil chemoattractants, such as eotaxin-1, as the concentration of the latter was increased in the spinal cord during EAE, as shown on mRNA and protein level. Moreover, detailed flow cytometry analysis of spinal cord eosinophils revealed that they show signs of activation, namely an increase in CD11b and decrease in CCR-3 surface expression. Furthermore, we observed signs of degranulation of spinal cord eosinophils in EAE which was measured as a decrease of the side scatter parameter and an upregulation of CD63 surface expression. These data suggest a potential role of eosinophils in the pathology of EAE. In order to elucidate whether eosinophils are important for the disease development, eosinophil-deficient mice were subjected to EAE and the clinical development of the disease was observed. For this purpose, we used two independent models of eosinophil deficiency - ΔdblGATA1 and interleukin-5-depleted mice. ΔdblGATA1 mice are a genetically manipulated mouse strain bearing a deletion in GATA1 promoter that causes a specific depletion of eosinophils. Interestingly, clinical development of EAE was not affected in these mice when compared to their wild-type controls. As a next step, we depleted eosinophils by injecting wild-type mice with an antibody against the eosinophil pro-survival factor interleukin-5 in order to reduce eosinophil numbers in the effector phase of EAE. In accordance with the result from the experiment with ΔdblGATA1 mice, EAE progression was not altered in the eosinophil-depleted mice when compared to mice that were injected with an isotype control antibody. Further, we analyzed the neuroinflammation and demyelination in the spinal cord of 4ΔdblGATA1 mice subjected to EAE. Specifically, the infiltration of inflammatory cell populations, including CD4 and CD8 T cells, neutrophils and macrophages, was assessed by flow cytometry. In agreement with the unchanged clinical EAE development, inflammatory cell infiltration was not affected in ΔdblGATA1 mice. Furthermore, we analyzed expression of pro-inflammatory cytokines in the spinal cord of ΔdblGATA1 mice subjected to EAE in order to better characterize the inflammatory status. No significant changes were detected further confirming that eosinophils do not contribute to neuroinflammation in EAE. Finally, we assessed the demyelination in the spinal cord of ΔdblGATA1 EAE mice using luxol fast blue staining to detect myelin. In accordance with the unaffected clinical development and inflammatory status, we did not observe any difference in the spinal cord demyelination in ΔdblGATA1 mice when compared to their wild-type littermates. Taken together, although eosinophils infiltrate into the spinal cord of EAE mice and are activated and degranulate therein, they are dispensable for EAE development.

Les polynucléaires éosinophiles sont des leucocytes multifonctionnels qui participent aux réponses innées et adaptatives par l’expression et la sécrétion de nombreux récepteurs et médiateurs. De plus en plus d’études, épidémiologiques, in vivo ou in vitro, suggèrent la participation des éosinophiles dans l’immunité anti-tumorale, et notamment dans le contexte du cancer du côlon. En effet, la présence d’une TATE (Tumor-Associated Tissue Eosinophilia) chez les sujets atteints de cancers est, en général, associée à un pronostic favorable. De même, notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que les éosinophiles humains expriment des récepteurs et médiateurs, communs aux lymphocytes et connus pour être impliqués dans l’immunité anti-tumorale, tels que le 2B4, le complexe CD3/TCR&#947;&#948; ou le granzyme A. La stimulation des éosinophiles in vitro, via ces récepteurs, conduit à la mort de cellules cancéreuses. Cet effet nécessitant un contact entre les cellules impliquant LFA-1 sur les éosinophiles. L’interleukine-18 est un membre de la famille des cytokines de l’IL-1. Elle fut initialement identifiée comme un facteur induisant la production d’IFN&#947;, basé sur sa capacité à promouvoir une réponse de type Th1 chez les lymphocytes et les cellules NK. Aujourd’hui, l’IL-18 est considérée comme une cytokine immuno-régulatrice capable de stimuler de nombreux types cellulaires. Son implication dans la réponse anti-tumorale est de plus en plus reconnue, notamment en favorisant la cytotoxicité de cellules NK. Nous avons donc étudié si cette cytokine pouvait également être impliquée dans la cytotoxicité des éosinophiles. Dans ce travail, nous avons démontré que les éosinophiles humains exercent une cytotoxicité vis-à-vis de plusieurs lignées cellulaires tumorales avec cependant une certaine hétérogénéité. L’IL-18 est non seulement capable d’activer in vitro les éosinophiles mais elle participe également à leur activité anti-tumorale vis-à-vis d’une lignée de carcinome du côlon, en favorisant notamment le contact entre les deux types cellulaires. Nos résultats proposent l’IL-18 comme un nouveau médiateur dans l'activité anti-tumorale des éosinophiles et apportent également un nouvel argument en faveur du rôle bénéfique que les éosinophiles peuvent exercer, notamment dans le contexte du cancer du colon. / Eosinophils are multifunctional leukocytes which participate in innate and adaptive immune response though the expression and secretion of various receptors and mediators. Numerous epidemiological, as well as in vivo and in vitro studies suggest the involvement of eosinophils in antitumor immunity, notably in context of colon cancer. In fact, a TATE (Tumor-associated tissue eosinophilia) is associated with a good prognostic value. Recently, we and others have shown that human eosinophils expressed receptors and mediators shared with lymphocytes and involved in anti-tumor defense, such as 2B4, TCR&#947;&#948;/CD3 complex, and granzyme A (8–10). Eosinophil stimulation through these receptors induced tumor cell death in vitro. This activity required cell-cell contact involving LFA-1 on eosinophils. IL-18 is a member of the IL-1 family of cytokines. IL-18 was first identified as an IFN&#947;-inducing factor, based on its ability to enhance the Th1-type immune response by stimulating NK cells and T cells. IL-18 is actually considered as an immunoregulatory cytokine able to stimulate various cell types. IL-18 participates in antitumor responses notably by enhancing NK cell-mediated cytotoxicity. In this context, we have studied whether this cytokine may be also involved in eosinophil-mediated cytotoxicity. In this study, we show that human eosinophils exert cytotoxicity against tumor cells in vitro, with heterogeneity according to the type of target cells. IL-18 increases eosinophil-mediated cytotoxicity towards a carcinoma cell line in vitro by promoting cell-cell contact between these two cell types. Our results propose IL-18 as a new mediator in antitumor properties of human eosinophils and support further evidence that eosinophils could exert a beneficial role, notably in the context of colon cancer.

Orientador: Edson Antunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T14:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BaldisseraJunior_Lineu_D.pdf: 1965195 bytes, checksum: 107b841684637a6a66bcdb7b9e929cef (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O recrutamento de eosinófilos para o pulmão inflamado é uma característica central da asma alérgica. Há relatos de que a ativação da guanilil ciclase solúvel (GCs) exerce atividade anti-inflamatória por inibir o recrutamento de leucócitos, e que o aumento de GMPc intracelular inibe a migração in vitro de eosinófilos humanos. A GCs é estimulada pelo NO, seu agonista fisiológico. Outros compostos são capazes de estimular a GCs de forma independente do NO, como as moléculas da família dos estimuladores NO-independentes e heme-dependentes, e, mais recentemente, por compostos estimuladores NO- e heme-independentes, chamados de ativadores da GCs. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do BAY 60-2770 (ativador NO- e heme-independente da GCs) em modelo murino de asma alérgica e na quimiotaxia in vitro de eosinófilos humanos induzida pela eotaxina. Para tanto, camundongos machos C57Bl6 (25 g, 6 semanas de idade) foram sensibilizados (2 injeções s.c. de 100 ?g de ovalbumina, nos dias 0 e 7) e submetidos ao desafio intranasal com OVA (10 ?g; duas vezes por dia, com intervalos de 6 horas entre cada desafio) nos dia 14 e 15, na presença e/ou ausência (veículo) do tratamento crônico com BAY 60-2770 (1mg/Kg/gavage; 14 dias). Os animais foram anestesiados e sacrificados 48 horas após o primeiro desafio, e as amostras biológicas colhidas para análise. O perfil inflamatório alérgico foi avaliado através da contagem total e diferencial de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA), sangue periférico, perfusato de medula óssea (MO) e em corte histológico. Foram dosados os níveis de IgE sérica específica a OVA, citocinas Th1 (IFN-?), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), TNF-? e eotaxina no LBA. A expressão proteica da GCs (subunidades ?2 e ?1) e da iNOS foi quantificada no parênquima pulmonar. O desenho experimental foi dividido em quatro grupos, a saber: grupo tratado com Veículo e instilado com Salina (VS); grupo tratado com Veículo e desafiado com OVA (VO); grupo tratado com BAY 60-2770 e instilado com Salina (BS); grupo tratado com o BAY 60-2770 e desafiado com OVA (BO). Nossos resultados mostraram níveis elevados (p<0,05) de IgE em soro de animais sensibilizados comparados com animais naive, confirmando a eficácia da sensibilização, que não foi alterada pelo tratamento com BAY 60-2770. O desafio alérgico à OVA (grupo VO), como esperado, gerou uma resposta inflamatória alérgica pulmonar, caracterizada pela presença marcante de eosinófilos no pulmão e de níveis elevados de IL-4 no LBA, assim como eosinofilia sanguínea e eosinofilopoese na medula óssea. Esta resposta foi significativamente acompanhada da redução da expressão da GCs (subunidades ?1 e ?1) e aumento da expressão protéica da iNOS no parênquima pulmonar, comparada a animais não desafiados (grupo VS). Não foram observadas diferenças nos níveis de TNF-? e eotaxina no LBA entre os grupos. As citocinas IFN-? e IL-10 não foram detectadas no LBA em nenhum grupo experimental. O tratamento crônico com BAY 60-2770 (grupo BO) reduziu significativamente os níveis de IL-4 e IL-5 no LBA, inibiu a eosinofilia pulmonar (LBA), sanguínea e peri-bronquiolar, e suprimiu a eosinofilopoiese na medula óssea, os quais foram acompanhados da restauração da expressão da GCs (?1 e ?1) e da iNOS no parênquima pulmonar, comparado com o grupo desafiado tratado com veículo (grupo VO). Em experimentos separados, eosinófilos humanos de indivíduos saudáveis foram submetidos aos ensaios de quimiotaxia induzida por eotaxina (300 ng/mL) na presença do BAY 60-2770 individualmente e/ou co-incubado com inibidor da GCs, ODQ (10 ?M). Nas mesmas condições, foram determinados os níveis de GMPc intracelular, e realizado o teste de viabilidade celular por redução do MTT. A resposta quimiotática induzida por eotaxina foi significativamente inibida pelo BAY 60-2770 (10 ?M), de modo dependente de GMPc. O efeito inibitório do BAY 60-2770 foi potencializado pela prévia co-incubação com ODQ, que elevou marcantemente os níveis de GMPc intracelulares e inibiu significativamente a migração de eosinófilos frente à eotaxina nas concentrações de 1, 3 e 5 ?M de BAY 60-2770. A viabilidade celular não foi afetada pelo BAY 60-2770. Em conjunto, nossos resultados mostram que o BAY 60-2770 é capaz de reduzir a inflamação alérgica pulmonar murina, e de inibir de forma dependente de GMPc a migração de eosinófilos humanos induzida por eotaxina. Concluímos que o BAY 60-2770 apresenta potencial valor terapêutico na asma alérgica / Abstract: Eosinophil recruitment to inflamed lung is a hallmark of allergic asthma. The literature has shown that soluble guanylyl cyclase (sGC) plays a key antiinflammatory role by inhibiting leukocyte recruitment, and that increased cGMP intracellular levels inhibit human eosinophil chemotaxis in vitro. The soluble guanylyl cyclase is stimulated by NO, its physiological agonist. Other compounds are able to NO-independently stimulate sGC, such as the family of NO-independent and heme-dependent stimulators, and the NO- and heme-independent stimulators, known as sGC activators. Therefore, this study aimed to investigate the effects of BAY 60-2770 (NO- and haem-independent sGC activator) in pulmonary allergic inflammation in mice and human eosinophil chemotaxis in vitro induced by eotaxin. Part I: Male C57BL6 mice were sensitized (100 ?g of ovalbumin, s.c.; day 0 and 7) and intranasally challenged with OVA (10 ?g; twice a day, 6 h between challenges) at days 14 and 15, with BAY 60-2770 (1 mg/Kg/gavage; 14 days) and/or its vehicle. Mice were anaesthetized and exsanguinated at 48 hours post first-OVA challenge, and biological samples were collected. The inflammatory profile was evaluated by total and differential cell counts in bronchoalveolar lavage (BAL) fluids, peripheral blood, bone marrow perfusate and histological slides. Serum OVA-specific IgE levels were measured and Th1 (IFN-?), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) cytokines, TNF-? and eotaxin levels were quantified in BAL fluids. Soluble guanylyl cyclase subunits (?1 and ?1) and iNOS protein expression were determined in lung parenchyma. The experimental design was divided in four groups, namely: Vehicle treated-instilled with Saline (VS group); Vehicle treated-challenged with OVA (VO group); BAY 60-2770 treated-instilled with Saline (BS group) and BAY 60-2770 treated-challenged with OVA (BO group). Our results showed seric elevated IgE levels (p<0.05) in OVA-sensitized mice compared with naive animals, confirming the efficiency of sensitization procedure, which was not affected under BAY 60-2770 treatment. As expected, the OVA-challenge in VO group triggered a pulmonary allergic inflammatory response, characterized by markedly eosinophil migration to lung, elevated IL-4 levels in BAL fluid, as well as blood eosinophilia and marrow eosinophilopoiesis in bone marrow. This response was significantly accompanied by reduced GCs (subunits ?1 and ?1) and increased iNOS expression in lung parenchyma, compared with non-challenged animals (VS group). No differences on TNF-? and eotaxin levels in BAL fluids were observed among studied groups. Levels of IFN-? and IL-10 were not detected in BAL fluids of any groups. Chronic oral treatment with BAY 60-2770 (BO group) significantly reduced IL-4 and IL-5 levels in BAL fluids, inhibited pulmonary (BAL), blood and peri-bronchiolar eosinophilia, and supressed bone marrow eosinophilopoiesis, which was accompanied by restoration of sGC and iNOS expression in lung parenchyma, compared with vehicle treated group (VO). In separate experiments, isolated human eosinophils from healthy volunteers were individually incubated with BAY 60-2770 and/or previously co-incubated with the sGC inhibitor, ODQ (10 ?M), and allowed to migrate toward eotaxin (300 ng/ml; 1 h, 37°C) in chemotaxis chamber. In the same conditions, intracellular cGMP levels were determinated and cell viability test were performed by MTT reduction. Our data showed that human eosinophil migration to eotaxin was significantly inhibited by BAY 60-2770 (10 ?M) in a cGMP-dependent manner. Inhibitory effect of BAY 60-2770 was potentiated by previous co-incubation with ODQ, which markedly elevated cGMP intracellular levels and inhibited eosinophils migration induced by eotaxin at 1, 3 and 5 ?M BAY 60-2770 concentrations. The cell viability was not affected by BAY 60-2770. Together, our results show that BAY 60-2770 is able to reduce murine pulmonary allergic inflammation, and to inhibit human eosinophil migration toward eotaxin in cGMP-dependent manner. In conclusion, the compound BAY 60-2770 presents potential therapeutic value in allergic asthma / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientadores: Carla Fernanda Franco Penteado, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pallis_FlaviaRubia_D.pdf: 2236341 bytes, checksum: 3d0b519ba21fcfbc645749dccc82a06a (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A vaso-oclusão compreende um processo complexo e multicelular iniciado pela adesão de hemácias e leucócitos ao endotélio ativado, causando a obstrução vascular, ativação de células endoteliais vasculares e lesões que podem induzir uma resposta inflamatória contínua na anemia falciforme (AF). Estudos preliminares mostraram que os eosinófilos de pacientes com AF encontram-se ativados no sangue periférico, porém o envolvimento dessa célula no processo de vaso-oclusão ainda não está bem caracterizado. Pouco se sabe sobre o papel das proteínas da via das Rho GTPases na adesão dos eosinófilos ao endotélio vascular, bem como nas complicações pulmonares da doença. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o papel dos eosinófilos e das proteínas pertencentes à família das Rho GTPases na fisiopatologia da AF, e avaliar in vivo o papel dessa via na resposta inflamatória pulmonar induzida pela OVA em camundongos com AF. Sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles) e pacientes com AF, em terapia com hidroxiureia (SSHU) ou não (SS), foi coletado para avaliar a adesão estática e em fluxo. A adesão dos eosinófilos de pacientes com AF à HUVEC estimulada com TNF-'alfa' foi significativamente maior quando comparado a adesão dos eosinófilos á HUVEC de indivíduos controle, em condições de fluxo e estática. No entanto, a adesão dessas células à HUVEC estimulada com TNF-? foi menor nos pacientes SSHU, quando comparada com o com aos SS. O pré-tratamento das HUVEC com o inibidor de Rac1, reduziu a adesão dos eosinófilos de pacientes SS ou SSHU. Em condições de fluxo, o número de eosinófilos aderidos à HUVEC reduziu significativamente quando estas foram tratadas com Y-27632 ou NSC23766 nos três grupos avaliados, porém essa inibição foi maior no grupo SS. In vivo a OVA induziu inflamação pulmonar caracterizada pelo aumento na contagem de leucócitos, principalmente eosinófilos, no lavado broncoalveolar dos camundongos. Essa inflamação foi potencializada nos camundongos com AF (Berkeley e Transplantados) quando comparados aos controles (C57BL6). Os camundongos Transplantados apresentaram níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios, tais como, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxina, MCP-1, MMP-9 e TIMP-1 quando comparados aos camundongos do grupo não sensibilizado (NS). Nenhuma diferença foi observada nos níves de RNAm pulmonar das metaloproteinases e seus inibidores quando comparados os camundongos Transplantados do grupo OVA com os NS, porém a expressão de IL-6 é significativamente maior no pulmão dos animais falciformes desafiados com OVA. Na avaliação funcional dos brônquios, os dados mostraram que a potência para metacolina foi maior nos camundongos Berkeley, quando comparados aos Transplantados e ainda maior quando comparados com os C57BL6. Os animais que foram tratados com os inibidores da via RhoA/ROCK, Y-27632 ou Fasudil, apresentaram menor contagem total e diferencial das células que migraram para os pulmões e níveis reduzidos dos mediadores pró-inflamatórios avaliados. O pré-tratamento com o Fasudil reduziu a potência e a resposta máxima para metacolina dos brônquios da linhagem Berkeley. Não foi observada diferença na avaliação funcional da reatividade da traqueia no modelo de asma experimental nos grupos avaliados. Tomados em conjunto, os resultados indicam que a via RhoA/ROCK tem papel importante na adesão dos eosinófilos ao endotélio e que a inibição dessa via pode atenuar a asma associada a doença falciforme. Deste modo, sugerimos que os inibidores dessa via podem ser novos agentes terapêuticos para o tratamento das manifestações clínicas da AF / Abstract: Vaso-occlusion, comprising a complex and multicellular process, initiated by the adhesion of erythrocytes and leukocytes to the activated endothelium, leading to vascular obstruction, activation of vascular endothelial cells and continuous lesions in patients with sickle cell anemia (SCA). Preliminary results demonstrated that eosinophils from SCA patients exist in an activated state, however the participation of this cell in the vasooclusive process in not well establish. The role of proteins via the Rho GTPases in the adhesion of eosinophils to the vascular endothelium and in the pulmonary complications of SCA disease it is unknown. The aim of this study was to evaluate in vitro the role of the eosinophils and proteins belonging to the Rho GTPases family in SCA pathophysiology, and evaluate in vivo the role of this pathway in pulmonary inflammatory responses induced by OVA in SCA mice. Peripheral blood of healthy individuals (controls) and SCA patients in therapy or not with hydroxyurea (SCAHU) was collected for static and flow adhesion experiments. For static adhesion assays, eosinophils were isolated from control subjects or SCA patients on or off HU therapy. Adhesion of SCA eosinophils to HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) under TNF-'alfa'-stimulated conditions was higher when compared with control eosinophils, in flow conditions and static assay. Furthermore, SCAHU eosinophils demonstrated significantly lower adhesive properties, compared to SCA eosinophils. The adhesion of eosinophils from SCA or SCAHU patients were reduced when HUVEC were pretreated with NSC23766 inhibitor, compared to non-treated HUVEC. Under flow conditions, the number of eosinophils adhered to HUVEC cells was reduced when they were treated with Y-27632 or NSC23766 in the three groups investigated, however this inhibition was higher in the SCA patients. In vivo OVA induced lung inflammation, characterized by increased leukocyte particularly eosinophils, counts in the mice bronchoalveolar fuid (BALF). This inflammation was enhanced in SCA mice (Berkeley and Transplanted) when compared to controls (C57BL6). Transplanted mice showed high levels of pro-inflammatory mediators such as IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxin, MCP-1, MMP-9 and TIMP-1 as compared to the control mice group (NS). Furthermore, the SCA mice induced with OVA showed higher lung gene expression of IL-6; however, there was no difference in the expression of MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12, TIMP-1 and TIMP-2, compared to NS. In the functional assessment of the bronchi reactivy, data showed that the potency to methacholine in asthmatic model was was greater in the SCA mice (Berkeley), compared to the Transplanted SCA mice, and even greater when compared to C57BL6. The animals treated with the inhibitors of the RhoA/ROCK pathway, Y-27632 or Fasudil, showed lower total and differential cells counts due to migration to the lungs. Pretreatment with the RhoA/ROCK pathway inhibitor significantly reduced the proinflammatory mediator levels evaluated. Treatment with Fasudil reduced maximal response for methacholine in bronchi from Berkeley model. No significant difference was observed in the tracheal reactivity after OVA challenge in all groups investigated. Taken together, our data indicated that RhoA/ROCK pathway play an important role in the eosinophil adhesion to the endothelium and, the inhibition of this pathway could alleviates asthma in SCA patients. Thus, we suggest that RhoA/ROCK inhibitors represents novel therapeutic agents for the treatment of SCA clinical manifestations / Doutorado