Els carcinomes són tumors d'origen epitelial que constitueixen aproximadament el 90% dels tumors humans. La progressió tumoral implica diferents etapes: creixement del tumor primari, invasió local, intravasació, extravasació i proliferació de les cèl·lules tumorals en un nou òrgan on formen un tumor secundari o metàstasi. Són, precisament, les metàstasis la principal causa de mort dels malalts de càncer.La invasió local dels carcinomes requereix la pèrdua de l'expressió o de la funció de la molècula d'adhesió cadherina E, la qual és un supressor d'invasió. A més, el procés d'invasió també va acompanyat de la pèrdua d'altres marcadors epitelials, de l'adquisició de marcadors mesenquimals i de l'augment de les propietats migratòries i invasives. Aquests canvis tenen un gran paral·lelisme amb la conversió fenotípica que té lloc durant el desenvolupament embrionari i que s'anomena transició epiteli-mesènquima (TEM). El principal mecanisme que regula el silenciament de la cadherina E és la repressió transcripcional, i recentment s'han caracteritzat diversos factors de transcripció que a través de la seva interacció amb les caixes E (de seqüència CANNTG) del promotor de la cadherina E reprimeixen la seva expressió: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 i ZEB-2. L'expressió estable de Snail o E47 en les cèl·lules epitelials Madin Darby Canine Kidney (MDCK) indueix un procés de TEM complet, però no es coneix el mecanisme. Moltes de les alteracions que es donen en la TEM poden ser explicades com a conseqüència de la repressió de la cadherina E, però altres events cel·lulars, independents de la dissociació cel·lular, contribuirien també a la iniciació i completació del procés. Per aquest motiu, en aquesta Tesi s'ha realitzat l'anàlisi de l'expressió gènica diferencial mitjançant RAP-PCR i microarrays de cDNA per identificar gens implicats en el procés de TEM induït per Snail o E47. Així, s'han trobat gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb diverses funcions cel·lulars com cicle cel·lular, apoptosi, metabolisme o senyalització, però el grup majoritari és el de gens implicats en migració i invasió (adhesió cel·lular, citoesquelet, matriu extracel·lular -MEC- i proteases de MEC). Aquest estudi mostra a més que l'expressió estable de Snail o E47 en les cèl·lules MDCK indueix programes genètics en part comuns i en part específics, suggerint el paper diferencial d'aquests dos factors de transcripció en la progressió tumoral. Per altra banda, s'ha estudiat el mecanisme que regula la sobreexpressió de la metal·loproteasa MMP-9 i del factor de transcripció Id-1 que es dóna en la TEM induïda tant per Snail com per E47. L'activació transcripcional de MMP-9 és induïda per Snail i E47 de forma indirecta i mediada per altres factors de transcripció tals com Ets-1 i Sp1 que s'uneixen a la regió proximal del promotor formant un multicomplexe, i NFkB/p65 que interacciona amb una regió més distal. En canvi, l'activació transcripcional d'Id-1 és regulada principalment a través de la segona caixa E del promotor humà que interacciona amb E47. Pel que fa a Snail, no hem pogut confirmar si s'uneix directament a aquest element o indueix l'expressió d'un altre factor de transcripció capaç d'unir-s'hi. També és important la caixa GC adjacent a la caixa E que recluta Sp1. Tant l'activació de MMP-9 com d'Id-1 és regulada per la via Erk/MAPK (activada per Snail i E47) que fosforila almenys Sp1. Aquests resultats juntament amb l'expressió coneguda de Snail i E47 en línies cel·lulars de carcinoma podrien explicar la sobreexpressió de MMP-9 i Id-1 en molts tumors. / Carcinomas are tumors of epithelial origin that comprise approximately 90% of human tumors. Tumor progression is a multistep process: growth of primary tumor, local invasion, intravasation, extravasation and proliferation of malignant cells in a new organ where they form a secondary tumor or metastasis. Metastasis are the main cause of death of cancer patients.Local invasion of carcinomas requires loss of E-cadherin expression or function, which is an adhesion molecule and a well established invasion supressor. In addition, invasion process is accompanied by loss of other epithelial molecules, acquisition of mesenquimal markers and gain of migratory and invasive properties. These changes have many parallels with the phenotypic conversion that takes place during embryonic development known as epithelial-mesenquimal transition (EMT). The main mechanism that regulates E-cahderin silence is transcripcional repression, and recently several transcription factors have been characterized as E-cadherin repressors through their interaction with the E-boxes (of sequence CANNTG) of the promoter: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 and ZEB-2.Stable expression of Snail or E47 in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells induce a complete EMT, but the mechanism that govern it is not known yet. Some of the alterations that occur during EMT can be explained as a consequence of E-cadherin repression, but other cellular events, independent from cellular dissociation, may contribute to the initiation and completion of the process. For this reason, in this Thesis we made a differential expression analysis by RAP-PCR and cDNA microarrays to identify genes implicated in Snail and E47 induced EMT. Thus we found genes related to different cellular functions such as cellular cycle, apoptosis, metabolism and signaling, but the great group was composed by genes implicated in migration and invasion (cellular adhesion, cytoskeleton, extracellular matrix -EMC- and EMC proteases). This study shows that Snail or E47 expression in MDCK cells induce common and specific genetic programs, suggesting a differential role for these transcription factors in tumor progression.On the other hand, we studied the mechanism that regulates metalloprotease MMP-9 and transcription factor Id-1 upregulation in Snail and E47 induced EMT. Snail and E47 induced activation of MMP-9 is indirect and mediated by other transcription factors such as Ets-1 and Sp1 that bind to the proximal region of promoter forming a multicomplex, and NFkB/p65 that interacts with a more distal region. On the contrary, Id-1 transcriptional activation is regulated mainly through the second E-box of human promoter that recruits E47. At the moment, we have not been able to confirm whether Snail binds directly to this element or it induces the expression of another factor that interacts with the E-box. It is also important the GC-box adjacent to this E-box that binds Sp1. Either MMP-9 or Id-1 activation are regulated by Erk/MAPK pathway(activated by Snail and E47) that phosphorilates at least Sp1. These results together with known expression of Snail and E47 in carcinoma cell lines may explain MMP-9 and Id-1 upregulation in tumors.

El mal pronòstic en una neoplàsia epitelial està associada a l'adquisició de característiques mòbils o invasives per part de les cèl·lules canceroses. Aquesta transformació morfològica es denomina transició epiteli-mesènquima (TEM). Snail és un factor de transcripció implicat en aquest procés, responsable de reprimir l'expressió de l'E-cadherina. Aquest treball demostra que Snail té la capacitat de reprimir l'expressió de MUC1 i VDR a través de la seva unió directa a caixes de reconeixement situades en els diferents promotors proximals. A més, la sobreexpressió d'Snail en diverses línies cel·lulars provoca un augment dels nivells d'ARNm de ZEB1 i un increment de l'activitat del seu promotor. L'activitat del promotor mínim d'Snail i els seus nivells d'ARNm depenen de la senyalització d'ERK. Finalment, hem demostrat que Snail i WT1, un regulador positiu de l'expressió de l'E-cadherina, competeixen per unir-se al promotor de l'E-cadherina i regular la seva transcripció. / The poor prognosis in epithelial neoplasia is associated with the acquisition of motile or invasive properties by the cancerous cells. This morphological transformation is often referred to as epithelial to mesenchymal transition (EMT). The Snail transcription factor is involved in this process by repressing the expression of E-cadherin. In this study we demonstrate the capacity of Snail to repress both MUC1 and VDR transcription by direct binding to specific sequences within their proximal promoter. Moreover, Snail overexpression in several cell lines induces ZEB1 mRNA and increases its promoter activity. The activity of the Snail minimal promoter is dependent on the ERK signaling pathway. Finally, we have demonstrated that Snail and WT1, a positive regulator of E-cadherin expression, compete for the binding to the E-cadherin promoter in order to regulate its transcription.

La Transició Epiteli-Mesènquima és el mecanisme pel qual les cèl·lules epitelials generades en regions particulars, poden dissociar-se de l'epiteli i migrar cap a nous destins, gràcies a uns canvis morfològics que transformen les cèl·lules epitelials en cèl·lules mesenquimals. Aquest procés fonamental durant el desenvolupament, també és rellevant en la progressió de tumors epitelials malignes i en tots dos casos les cèl·lules perden cohesió i adhesió i guanyen mobilitat. Aquests processos morfogènics impliquen una reorganització important del citoesquelet que serà incompatible amb un estat proliferatiu actiu, fins que les cèl·lules necessitin colonitzar un nou territori.Snail és un factor clau en la regulació dels processos EMT, tant en el desenvolupament com en la progressió tumoral gràcies a la seva capacitat de reprimir directament la transcripció de gens epitelials i promoure l'expressió de gens mesenquimals. Uns clons estables de dues línies cel·lulars epitelials, generats en el nostre grup proliferaven més lentament a l'expressar Snail de manera que ens vam proposar descriure el mecanisme utilitzat per Snail per fer disminuir la taxa de proliferació cel.lular al ser expressat ectòpicament en cèl.lules en cultiu que havien patit una EMT.Els resultats d'aquesta tesi indiquen que Snail bloqueja el cicle cel·lular al ser expressat en cèl·lules epitelials fent que disminueixin els nivells de proteïna CDC25A, fosfatasa que pot activar els complexes CDK-ciclina implicats en la progressió per diverses etapes del cicle. Els nostre estudi suggereix que Snail reté el mRNA de CDC25A al nucli, impedint que sigui exportat i traduit.

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.