A contaminação por micoplasma em culturas celulares pode causar consideráveis interferências no metabolismo celular, acarretando em um sério problema para os laboratórios de cultura de células. Com o objetivo de avaliar o efeito da contaminação por micoplasma e do tratamento com o antibiótico removedor de micoplasma (MRA), sobre a medida da atividade de hidrolases lisossômicas, foram cultivadas culturas de fibroblastos de indivíduos normais para realização destas medidas. Para tanto, foram selecionadas enzimas de referência do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do Serviço de Genética Médica do HCPA sendo elas: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ß-glicuronidase e hexosaminidase (Total e A). Mediu-se a atividade em fibroblastos contaminados com micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados foram comparados com a atividade enzimática em fibroblastos controles (sem contaminação) e fibroblastos controles tratados com MRA. Somente a enzima ß-glicosidade não alterou significativamente sua atividade na presença do micoplasma e nem do MRA. A hexosaminidase Total e a ß-galactosidase sofreram interferência significativa na presença do micoplasma e do MRA. A hexosaminidase A e a arilsulfatase A sofreram interferência significativa somente na presença do MRA. A ß-glicuronidase sofreu alteração de sua atividade somente na presença do micoplasma. Estes resultados mostraram que as enzimas testadas comportaramse de maneira diferente frente à pre sença do MRA e/ou do micoplasma, levandonos a avaliar, em um segundo momento, se estes agentes (micoplasma e antibiótico), poderiam alterar a medida da atividade enzimática em cultura de fibroblastos de pacientes com doenças lisossômicas (DL). Para tanto foi realizada a medida da atividade das enzimas: ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A e a-glicosidase. A atividade destas foram medidas em culturas de fibroblastos contaminadas por micoplasma, antes e após adição do MRA. Os resultados destas atividades foram comparados com as atividades enzimáticas em culturas cultivadas na ausência de contaminação. Somente a ASB alterou significativamente sua atividade tanto na presença do micoplasma quanto do MRA. As demais enzimas não sofreram interferência significativa na presença de ambos. Os resultados obtidos nos permitem concluir que em cultura de fibroblastos, tanto a contaminação por micoplasma quanto o uso de um tipo de antibiótico (MRA), podem ser fator de interferência para medida da atividade de algumas hidrolases lisossômicas. Sendo assim, sugerimos que haja a prevenção da contaminação através da detecção do micoplasma bem como o uso de técnicas assépticas e, para aquelas culturas que não podem ser descartadas, faça-se o uso criterioso de antibióticos capazes de remover o micoplasma, como o analisado neste estudo. Dessa maneira, trabalharíamos com um grau de confiabilidade maior nos resultados laboratoriais. / Contamination of cellular cultures by mycoplasma can cause considerable interference with the cellular metabolism and result in serious problems for cell culture laboratories. To evaluate the effects of mycoplasma contamination and treatment with the mycoplasma removal antibiotic agent (MRA) on the measurement of the activity of lysosomal hydrolyses; fibroblast cultures from normal individuals were cultivated specifically to realize these measurements. To do this, we selected reference enzymes from the Laboratory of Inborn Errors of Metabolism maintained by the Service of Genetic Medicine at the HCPA in Porto Alegre, Brazil as follows: ß-galactosidase, ß-glicosidase, arilsulfatase A, ßglicuronidase and hexosaminidase (Total and A). The activity of the fibroblasts contaminated by mycoplasma was measured before and after the addition of the MRA. The results were compared with the enzymatic activity in controls both of non-contaminated fibroblasts and others treated with MRA. The ß-glycosidase enzyme was the only enzyme that demonstrated no significant activity alterations in the presence of either the mycoplasma or the MRA. All the others showed significant changes - the total hexosaminidase and the ß-galactosidase from the presence of the both the mycoplasma and the MRA ; the hexosaminidase A and the arilsulfatase A from the presence of the MRA only; while the presence of the mycoplasma on its own significantly altered the ß-glicuronidase activity. These results prove that the enzymes we tested behave differently when exposed to MRA and/or the mycoplasma. This raises the question as to whether these agents (mycoplasma and antibiotic) could alter the measurement of enzymatic activity in fibroblast cultures from patients with lysosomatic diseases (DL). To resolve this question, the activities of the ß-galactosidase, arilsulfatase B (ASB), hexosaminidase A and a-glicosidase enzymes were measured in cultures of fibroblasts contaminated with mycoplasma, before and after the addition of MRA. The results obtained were compared with the enzymatic activities of uncontaminated cultures. Significant alteration of activity in the presence of MRA and the mycoplasma was observed only in the ABS. The other enzymes demonstrated no significant alteration in the presence of either. The results obtained permit us to conclude that, in a fibroblast culture, both contamination by mycoplasma and the effects of the use of a type of antibiotic (MRA) can interfere in the results of the measurement of the activity of some lysosomatic hydrolyses. Therefore, we suggest that measures be taken to prevent contamination by the detection of the mycoplasma and the employment of aseptic techniques, and, in those cases where the cultures cannot be disposed of, antibiotics capable of removing the mycoplasma should be utilized as analyzed in this study. In this way, greater confidence in the respective laboratory results can be assured.

A acidemia isovalérica é uma doença hereditária neurometabólica causada pela deficiência da atividade da enzima isovaleril-CoA desidrogenase da rota de degradação da leucina. É caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo nos tecidos e fluidos biológicos dos pacientes afetados principalmente dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como isovalerilglicina (IVG). Os achados clínicos caracterizam-se fundamentalmente por sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma e letargia. O presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do IVA e IVG sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida, tendo em vista que os mecanismos envolvidos no dano cerebral dessa doença até o momento são pouco conhecidos e que recentemente foi demonstrado que o 3-OHIVA, também acumulado nas acidúrias 3-metilglutacônica e 3-hidroxi-3-metilglutárica, induz peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o a IVG, mas não o IVA, aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e quimiluminiscência, indicando que este metabólito induz lipoperoxidação in vitro. Com a finalidade de investigar se este efeito foi devido à glicina que faz parte da molécula de IVG, testamos o efeito da glicina sobre estes mesmos parâmetros e verificamos que este aminoácido também induziu dano oxidativo lipídico nesta estrutura cerebral de mesma ordem de magnitude que a IVG. Verificamos também que os antioxidantes trolox (vitamina E solúvel), L-NAME, GSH, melatonina, creatina e uma combinação de CAT+SOD nas doses usualmente suplementadas em estudos in vitro não foram capazes de impedir o aumento dos níveis de TBA-RS induzido pela IVG. Já a presença de N-acetilcisteína, precursora de GSH, em concentrações usuais preveniu esta peroxidação lipídica in vitro induzida por IVG, indicando que o IVG provavelmente provoca um decréscimo das concentrações cerebrais de glutationa reduzida (GSH) provavelmente secundário à elevada produção de espécies ativas induzida pelo metabólito. Por outro lado, a adição ao meio de incubação de doses altas desses antioxidantes, com exceção da combinação SOD e CAT, preveniu totalmente o aumento do TBA-RS induzido por IVG, indicando uma alta produção de espécies reativas com conseqüente dano oxidativo lipídico. O próximo passo de nossa investigação foi determinar a influência do IVA e IVG sobre a oxidação do DCFH e dos níveis de glutationa reduzida (GSH). Tanto o IVA, quanto o IVG não alteraram os níveis de DCFH. Por outro lado, o IVA não modificou, enquanto a IVG provocou uma diminuição significativa dos níveis do GSH. Tal efeito não se deveu a uma ação pró-oxidante direta do IVG ou à interferência desse composto na medida dos níveis de GSH. Tais resultados estão de acordo com o fato de que a N-acetilcisteína, substrato para a formação de GSH, foi capaz de prevenir o aumento da lipoperoxidação lipídica induzida pelo IVG.Verificamos também que o IVA e o IVG não afetaram o TRAP e o TAR que representam o potencial antioxidante total e a reatividade antioxidante total, respectivamente. Por outro lado, a IVG não induziu dano oxidativo protéico medido pela oxidação de sulfidrilas e pela formação de carbonilas, enquanto o IVA causou um aumento significativo na formação de carbonilas, sem alterar os níveis de tióis. Concluindo, nossos resultados indicam que a IVG é o metabólito acumulado na acidemia isovalérica que induz em maior grau estresse oxidativo em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens, enquanto o IVA é capaz de provocar dano oxidativo protéico. Um aumento do estado pró-oxidante e uma menor capacidade antioxidante, representada pelo decréscimo do GSH cerebral, indica que o estresse oxidativo possa representar um mecanismo na fisiopatologia do dano neurológico característico da acidemia isovalérica. / Isovaleric acidemia is an inherited neurometabolic disorder caused by isovaleryl-CoA dehydrogenase deficiency. It is biochemically characterized by accumulation of isovaleric acid (IVA) and 3-hydroxyisovaleric acid (3-OHIVA), as well as isovalerylglycine (IVG) in tissues and biological fluids of affected patients. Clinical features are mainly severe neurological symptoms, such as convulsions, coma, lethargy and ataxia. The present work aimed to investigate the in vitro effects of IVA and IVG on various parameters of oxidative stress in cerebral cortex of 30-day-old rats since the mechanisms of brain damage are poorly known in this disease and that recently it was demonstrated that 3-OHIVA, also accumulating in 3-methylglutaconic aciduria and 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria, induces lipid peroxidation in cerebral cortex of young rats. Our results showed that IVG, but not IVA, significantly increased TBA-RS and quimiluminescence, indicating that this metabolite induces lipid peroxidation in vitro. Aiming to evaluate whether this effect was due to glycine that is a component of IVG molecule, we tested the effect of glycine on the same parameters and verified that this amino acid also induced lipid oxidative damage of the same order of magnitude than IVG. We also observed that the antioxidants trolox (soluble vitamin E), L-NAME, GSH. Melatonine, creatine and the combination CAT + SOD at doses usually supplememented in vitro studies were not able to prevent the increase of TBA-RS levels induced by IVG. In contrast, the presence of N-acethylcisteine, precursor of GSH, at usual concentrations, totally prevented IVG-induced increase of TBA-RS levels, indicating that IVG probably provoked a decrease of brain GSH concentrations probably secondary to elevated formation of free radicals by this metabolite. On the other hand, the presence of higher amounts of these antioxidants, except the combination SOD + CAT, totally prevented the increase of TBA-RS elicited by IVG, indicating that a high production of reactive species with consequent lipid oxidative damage. The next step of our investigation was to determine the influence of IVA and IVG on DCFH-DA oxidation and on GSH levels. Both IVA and IVG did not alter DCFH-DA levels, whereas IVG caused a significant decrease of GSH levels. This effect was not due to a direct pro-oxidant action of IVG or due to IVG interference in the reaction used to measure GSH. Such effects are in line with those showing that N-acethylcystein, the substrate of GSH formation, was able to prevent the increase of lipid peroxidation elicited by IVG. We also found that IVA and IVG did not affect TRAP and TAR that represent total tissue antioxidant potential and total antioxidant reactivity, respectively. On the other hand, IVG did not provoke protein oxidative damage measured by sulfhydryl oxidation and carbonyl formation, whereas IVA causes a significant increase of carbonyl formation, without altering thiol concentration. Concluding, our findings indicate that IVG is the accumulating metabolite in isovaleric acidemia that induces in higher degree oxidative stress in cortical homogenates from young rats, while IVA is able to provoke protein oxidative damage. An increase of pro-oxidant status and a lower antioxidant capacity, represented by a decrease of cerebral GSH, indicate that oxidative stress may represent a mechanism in the pathophysiology of the brain damage characteristic of isovaleric acidemia.

A hiperprolinemia é uma doença metabólica que pode ser causada por dois distintos erros inatos do metabolismo da prolina. A hiperprolinemia tipo I ocorre por uma deficiência na enzima prolina oxidase, enquanto que a hiperprolinemia tipo II é causada pela ausência da atividade da enzima Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. Os pacientes afetados por essa doença geralmente apresentam manifestações neurológicas, tais como convulsões, déficit cognitivo e retardo mental. Além disso, tem sido descrita uma associação entre a hiperprolinemia moderada e doenças psiquiátricas. Entretanto, os mecanismos neuroquímicos relacionados a esses sintomas neurológicos ainda são pouco compreendidos. Portanto, no presente estudo, investigamos o efeito da exposição aguda e crônica à prolina sobre parâmetros comportamentais em peixe-zebra, tais como: atividade locomotora, ansiedade e interação social. Além disso, avaliamos o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE), bem como sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases em cérebro de peixe-zebra. Para os estudos in vivo, os animais foram expostos a duas concentrações de prolina (1,5 e 3,0 mM) durante 1 hora ou 7 dias (tratamento agudo e crônico, respectivamente). Para os ensaios in vitro, diferentes concentrações de prolina foram testadas (variando de 3,0 a 1000 μM). A exposição aguda à prolina não promoveu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e comportamentais analisados. Entretanto, a exposição crônica à prolina na concentração de 1,5 mM provocou um aumento na atividade locomotora do peixe-zebra, caracterizada pelo aumento no número de linhas cruzadas (47%), na distância total percorrida (29%) e na velocidade média (33%). Um aumento significativo no tempo gasto na parte superior do aquário (91%) também foi observado após esse mesmo tratamento, o que pode ser interpretado como um comportamento ansiolítico. A prolina na concentração de 1,5 mM também induziu o déficit de interação social (78%), quando comparado ao grupo controle. Além disso, exposição crônica aumentou significativamente a atividade da AChE em ambos os grupos tratados (34% e 39%). Esse mesmo tratamento também aumentou a hidrólise de ATP em ambas as concentrações testadas (14% e 22%, respectivamente), enquanto que a hidrólise de ADP e AMP aumentou apenas na concentração de 3,0 mM (21% e 17%, respectivamente). A expressão gênica da E-NTPDase3 aumentou em ambos os grupos tratados após a exposição crônica à prolina, enquanto que a E-NTPDase1 teve seus níveis de transcritos aumentados apenas na concentração de 3,0 mM. A prolina, quando avaliada in vitro, não promoveu alterações significativas nas atividades das ectonucleotidase e da AChE. Por fim, demonstramos, ainda, que as alterações comportamentais e o aumento da atividade da AChE induzidos pela prolina foram completamente revertidos pela administração aguda de um antipsicótico atípico (sulpirida), mas não por um típico (haloperidol). Em conjunto, estes dados demonstram que a exposição crônica à prolina induz alterações comportamentais, bem como aumenta a atividade da AChE e catabolismo de nucleotídeos em cérebro de peixe-zebra. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados às manifestações neurológicas verificadas em pacientes hiperprolinêmicos, como os transtornos psicóticos e cognitivos. Além disso, este estudo pode facilitar o uso do peixe-zebra como modelo experimental para o estudo de erros inatos do metabolismo que afetam o sistema nervoso central. / Hyperprolinemia is a metabolic disease that may be caused by two distinct inborn errors of proline metabolism. Hyperprolinemia type I occurs by a deficiency in proline oxidase, while the hyperprolinemia type II is caused by an absence of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid dehydrogenase. Patients affected by this disease usually present neurological manifestations, such as seizures, cognitive impairment, and mental retardation. Moreover, an association between psychiatry disorders and moderate hyperprolinemia has been reported. However, the mechanisms related to these neurological symptoms still remain poorly understood. Therefore, in the present study, we investigated the effect of short- and long-term proline exposure on behavioral parameters in zebrafish, such as locomotor activity, anxiety, and social interaction. In addition, we evaluated the in vivo and in vitro effects of proline on acetylcholinesterase (AChE) activity, as well as on ectonucleotidase activities and gene expression in zebrafish brain. For the in vivo studies, animals were exposed at two proline concentrations (1.5 and 3.0 mM) during 1 hour or 7 days (short- or long-term treatments, respectively). For the in vitro assays, different proline concentrations (ranging from 3.0 μM to 1000 μM) were tested. Short-term proline exposure did not promote significant changes on the behavioral and biochemical parameters analyzed. Long-term exposure at 1.5 mM proline caused an increase in locomotor activity in zebrafish, characterized by an increase in the number of line crossings (47%), in the total distance traveled (29%), and in the mean speed (33%). A significant increase in the time spent in the upper portion of the test tank was also observed after the same treatment (91%), which may be interpreted as an indicator of anxiolytic behavior. Proline at 1.5 mM also induced social interaction impairment (78%), when compared to the untreated group. Moreover, long-term proline exposure significantly increased AChE activity for both treated groups (34% and 39%). This treatment also increased ATP catabolism in both concentrations tested (14% and 22%, respectively), whereas ADP and AMP hydrolysis were increased only at 3.0 mM proline (21% and 17%, respectively). The gene expression of E-NTPDase3 increased in both treated groups after long-term proline, whereas E-NTPDase1 transcript levels increased only at concentration of 3.0 mM. Proline, when assessed in vitro, did not promote significant changes on AChE and ectonucleotidase activities. At last, we demonstrated the proline-induced behavioral changes and increase in AChE activity were completely reversed by acute administration of an atypical antipsychotic drug (sulpiride), but not by a typical (haloperidol). Altogether, these data demonstrate that long-term proline exposure induces behavioral changes as well as increases AChE activity and nucleotide catabolism in zebrafish brain. These findings may contribute, at least in part, to better understand the mechanisms related to the neurological manifestations observed in hyperprolinemic patients, such as the psychotic and cognitive dysfunctions. Moreover, this study might facilitate the use of the zebrafish as experimental model for studying inborn errors of amino acid metabolism that affect the central nervous system.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

A deficiência da desidrogenase das acilas-CoA de cadeia curta / ramificada (SBCAD), também conhecida como deficiência da 2-metilbutiril-CoA desidrogenase, é uma doença de herança autossômica recessiva que afeta o catabolismo da isoleucina. Este distúrbio é bioquimicamente caracterizado pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária do ácido 2-metilbutírico (2MB) e da 2-metilbutirilglicina (2MBG), além da 2-metilbutirilcarnitina. Apesar de a doença apresentar predominantemente sintomas neurológicos, tais como retardo mental, convulsões e letargia, e imagens de ressonância magnética evidenciarem dano cortical, a fisiopatologia desse distúrbio ainda não foi estudada. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 2MB e da 2MBG sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para tanto, foram preparados sobrenadantes de córtex cerebral, os quais foram incubados na ausência ou na presença dos metabólitos em concentrações que variaram de 0,1 a 5 mM por 1 h a 37° C. Após a incubação, alíquotas foram retiradas para a avaliação dos parâmetros bioquímicos. Nossos resultados mostram que a 2MBG, mas não o 2MB, aumentou as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), sugerindo indução de peroxidação lipídica. A 2MBG também causou oxidação de grupamentos sulfidrilas e reduziu as concentrações de glutationa (GSH), refletindo uma diminuição das defesas antioxidantes, enquanto o 2MB não alterou esses parâmetros. Por outro lado, o 2MB e a 2MBG não alteraram a formação de carbonilas. Além disso, foi verificado que o aumento nos níveis de TBA-RS e a redução nas concentrações de GSH causados por 2MBG foram prevenidos por antioxidantes, indicando que espécies reativas estavam envolvidas nesses efeitos. Ainda foi demonstrado que a redução dos níveis de GSH provocada pela 2MBG não foi devido a uma ação oxidativa direta do metabólito, pois este não alterou o conteúdo de grupamentos tióis de uma solução comercial de GSH na ausência de tecido cerebral. Finalmente, visto que a produção de óxido nítrico não foi alterada por estes metabólitos, presume-se que espécies reativas de oxigênio estejam principalmente envolvidas nos efeitos mediados pela 2MBG. Os resultados sugerem que a 2MBG induz dano oxidativo lipídico e reduz as defesas antioxidantes não-enzimáticas em cérebro de ratos pelo aumento na geração de espécies reativas de oxigênio. Portanto, o estresse oxidativo induzido pela 2MBG pode estar envolvido, pelo menos em parte, na fisiopatologia da disfunção neurológica encontrada nos pacientes afetados pela deficiência da SBCAD. / Short/branched-chain acyl-CoA dehydrogenase (SBCAD) deficiency, also known as 2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency, is an autosomal recessive disorder of isoleucine metabolism. This disorder is biochemically characterized by high tissue accumulation and urinary excretion of 2-methylbutyrylglycine (2MBG) and 2-methylbutyric acid (2MB), as well as 2-methylbutyrylcarnitine. Although patients present predominantly neurological symptoms, such as mental retardation, seizures and lethargy, and magnetic resonance imaging reveals cortical damage, the pathophysiology of this disorder has not been studied. Therefore, this study aimed to investigate the in vitro effects of 2MB and 2MBG on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex of young rats. Cortical supernatants were incubated in the absence or in the presence of the metabolites at concentrations ranging from 0.1 to 5 mM for 1 h at 37° C. Our results show that 2MBG, but not 2MB, increased thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), suggesting induction of lipid peroxidation. 2MBG also induced oxidation of sulfhydryl groups and reduced the concentrations of glutathione (GSH), reflecting a decrease of non enzymatic antioxidant defenses, whereas 2MB did not alter these parameters. In contrast, 2MB and 2MBG did not alter carbonyl formation. In addition, increased levels of TBA-RS and reduction of GSH levels induced by 2MBG were prevented by antioxidants, indicating that reactive species were involved in these effects. Furthermore, the reduction of GSH levels induced by 2MBG were not due to a direct oxidative action, since this metabolite did not alter the sulfhydryl content from a commercial solution of GSH in the absence of cerebral tissue. Finally, since nitric oxide production was not altered by these metabolites, it is presumed that reactive oxygen species possibly underlay 2MBG effects. The results suggest that 2MBG induces lipid oxidative damage and reduces non enzymatic antioxidant defenses in rat brain mediated by generation of reactive oxygen species. We can therefore assume that oxidative stress induced by 2MBG is involved, at least in part, in the pathophysiology of neurological dysfunction found in patients affected by SBCAD deficiency.

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima D1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes afetados por essa doença apresentam epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais essas ocorrem são pouco compreendidos. Considerando que pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no cérebro, os objetivos do nosso estudo foram investigar os efeitos in vivo (agudo e crônico) e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros bioquímicos (atividades da acetilcolinesterase e butirilcolinesterase em córtex cerebral e soro de ratos, respectivamente, citocromo c oxidase e Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos; captação do glutamato em fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos e hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas obtido de córtex cerebral e em soro de ratos).Também investigamos o efeito do pré-tratamento com as vitaminas E e C ou da administração concomitante desses antioxidantes durante a administração crônica de prolina sobre as alterações causadas pela prolina nos parâmetros de estresse oxidativo, nas atividades da acetilcolinesterase, citocromo c oxidase e Na+,K+- ATPase, na captação do glutamato e no déficit de memória espacial. Em adição, também investigamos o efeito da administração aguda de vitamina E, vitamina C, LNAME e melatonina sobre a alteração causada pela prolina na atividade daacetilcolinesterase, a fim de verificar se esses antioxidantes e o L-NAME seriam capazes de prevenir tal efeito. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da acetilcolinesterase e aumentou a atividade da butirilcolinesterase em homogeneizado e soro de ratos, respectivamente. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina reduziu a atividade da citocromo c oxidase em córtex cerebral de ratos e que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos. Além disso, também observamos que a prolina in vitro reduziu a captação do glutamato em córtex cerebral e hipocampo e que a prolina in vivo reduziu a captação do glutamato somente em córtex cerebral. Os efeitos relatados possivelmente ocorreram pela geração de radicais livres, visto que antioxidantes importantes como as vitaminas E e C preveniram esses efeitos, exceto a redução da captação do glutamato. Tais antioxidantes também preveniram o déficit de memória e as alterações de vários parâmetros de estresse oxidativo causados pela prolina, como o aumento da quimiluminescência, a redução do potencial antioxidante total não-enzimático (TRAP) e as alterações nas atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Cabe ressaltar que a administração aguda de vitamina E, vitamina C, L-NAME e melatonina também preveniu a ação da prolina causada sobre a acetilcolinesterase. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina alterou a hidrólise de nucleotídeos adenínicos em sinaptossomas de córtex cerebral e em soro de ratos. Nossos resultados, em conjunto, mostram que a hiperprolinemia tipo II causa uma série de alterações neuroquímicas, as quais podemcontribuir para as disfunções neurológicas características da doença. Além disso, se esses resultados também ocorrerem em humanos, nossos dados referentes à utilização de antioxidantes (vitaminas E e C) poderão ser usados como uma estratégia para o tratamento de alguns sintomas associados com a hiperprolinemia tipo II. / Hyperprolinemia type II is an autosomal recessive disorder caused by the severe deficiency of D1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase activity, resulting mainly in tissue accumulation of proline. Most patients detected so far show epilepsy and mental retardation. Although neurological dysfunction is commonly found in a considerable number of hyperprolinemic patients, the mechanisms by which this occurs are poorly understood. Considering that very little is known about the role of high sustained levels of proline in brain, the geral objective of the present study was to investigate the in vivo (acute and chronic) and in vitro effects of proline on some biochemicals parameters (activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in cerebral cortex and serum of rats, respectively, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats; glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats). We also investigated the effect of pretreatment with antioxidants (vitamins E and C) or concomitant administration of these antioxidants during chronic proline treatment on the effects elicited by proline on some parameters of oxidative stress, on the activities of acetylcholinesterase, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase, on glutamate uptake and on the deficit of spatial memory. In addition, we also evaluated the influence of acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin on the effects elicited by proline on acetylcholinesterase activity, with the propose to verify if these antioxidants and L-NAME will be able to prevent such effect. The results showed that acute administration of proline reduced acetylcholinesterase activity and increased butyrylcolinesterase activity in homogenate of cerebral cortex and serum of rats, respectively. We also verified that acute and chronic administration of proline reduced the activity of cytochrome c oxidase in cerebral cortex of rats and that acute administration of proline reduced the activity of Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats. In addition, proline in vitro reduced glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and proline in vivo reduced glutamate uptake just in cerebral cortex. The effects related here possibly occured by the generation of free radicals, since important antioxidants such as vitamins E and C prevented these effects, except the reduction on glutamate uptake. The memory deficit and the alterations on various parameters of oxidative stress caused by proline [increase of chemiluminescence, reduction of total radical-trapping parameter (TRAP) and alterations on the activities of antioxidants enzymes catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px)] were also prevented by these antioxidants. Acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin also prevented the reduction caused by proline on acetylcholinesterase activity. Besides, we also showed that acute and chronic administration of proline altered the adenine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats. Our group´s results show that hyperprolinemia type II causes various neurochemical alterations, which may contribute to the neurological dysfunction characteristic of this disease. Furthermore, if these findings also occur in humans, we can suggest that the supplementation with antioxidants should be used as a strategy to the treatment of hyperprolinemia typo II.

A cisteamina (CSH) é um aminotiol redutor formado a partir da via catabólica da coenzima A e é precursora da taurina, um aminoácido abundante no encéfalo e que possui propriedades antioxidantes. A CSH é uma droga depletora de cistina e, quando utilizada precocemente no tratamento da cistinose, retarda a evolução da doença. A cistinose é uma doença metabólica causada pela deficiência do transportador lisossomal de cistina levando à formação de cristais de cistina em diversos órgãos e tecidos, incluindo o sistema nervoso central. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com cistina dimetil éster (CDME), um análogo da cistina utilizado para estudar a patogênese da cistinose, sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. Considerando que o estresse oxidativo é um conhecido indutor de apoptose, o objetivo inicial deste estudo foi investigar um possível efeito antioxidante da CSH sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para os experimentos in vitro, foram utilizados ratos Wistar de 22 dias não tratados e a CSH foi testada nas concentrações finais de 0,25 a 1,0 mM. Os resultados mostraram que a CSH reduziu a lipoperoxidação (LPO), a oxidação do 2′,7′-dihidrodiclorofluoresceina (DCFH), a carbonilação protéica e a atividade da catalase (CAT); e aumentou a atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px). No tratamento agudo, ratos de 22 dias de vida receberam três injeções subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal), com intervalo de 3 h entre elas e foram mortos 1 h após a última injeção. Os ratos do grupo controle receberam o mesmo volume de solução salina. A CSH reduziu a LPO e a atividade da GSH-Px; e aumentou a carbonilação protéica e a atividade da CAT. A próxima etapa da investigação foi verificar os efeitos da co-administração de CSH sobre os mesmos parâmetros de estresse oxidativo estudados anteriormente em córtex cerebral de ratos submetidos a um modelo experimental de cistinose por administração crônica de CDME. Os animais receberam duas injeções diárias intraperitoneais de CDME (1,6 μmol/g de peso corporal) e/ou subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal) do 16º ao 20º dia de vida. Os ratos foram mortos no 21º dia de vida, metade 1 h depois da última injeção e os outros 12 h após a última injeção. O CDME induziu a LPO, a carbonilação protéica e estimulou a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), GSH-Px e CAT. O CDME diminuiu a relação tióis/dissulfetos. Por sua vez, a co-administração de CSH restabeleceu o equilíbrio redox e preveniu o estresse oxidativo induzido pela administração de CDME. Quando analisados em conjunto, os resultados sugerem que a CSH, além de ser uma droga depletora de cistina intralisossomal, pode ser um seqüestrador de radicais livres, reduzindo a lesão celular por apoptose. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, a CSH também pode retardar a evolução da cistinose pelo seu efeito antioxidante. / Cysteamine (CSH) is a reducing aminothiol generated from the coenzyme A catabolic pathway and is the main source of taurine, an abundant amino acid in the brain with antioxidant properties. CSH is a cystine-depleting drug and when used earlier in the treatment of cystinosis, extends life of affected patients. Cystinosis is a metabolic disease caused by deficiency of the lysosomal cystine carrier leading to the formation of cystine cristals in many organs and tissues, including central nervous system. Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester, a cystine analog used for studying the pathogenesis of cystinosis, suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Considering that oxidative stress is a known apoptosis inducer, the first objective of this study was to investigate a possible antioxidant effect of CSH on several parameters of oxidative stress in the brain of young rats. For the in vitro experiments, non-treated 22-dayold rats were used and CSH was added to the assay at 0.25 to 1.0 mM final concentrations. Results showed that CSH reduced lipoperoxidation (LPO), 2′,7′-dihydrodichlorofluorescein oxidation (DCFH), carbonyl content of proteins and catalase (CAT) activity, and increased glutathione peroxidase activity (GSH-Px). In the acute treatment, 22-day-old rats received three subcutaneous injections of CSH (0.26 μmol/g body weight) at 3 h intervals and were sacrificed 1 h after the last injection. In the control group, rats received the same volumes of 0.85% NaCl. Cysteamine decreased LPO and GSH-Px activity, and increased the carbonyl content of proteins and CAT activity. The next step of this investigation was to verify the effects of CSH co-administration in the same oxidative stress parameters studied before, in cerebral cortex of rats submitted to an experimental model of cystinosis. The animals were injected intraperitoneously twice a day with 1.6 mol/g body weight cystine dimethylester and/or subcutaneously 0.26 mol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day. Rats were sacrificed in the 21st day, half 1 h after the last injections, and the others 12 h after the last injection. CDME induced LPO, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase (SOD), GSH-Px and CAT activities. CDME significantly decreased thiol/disulfide ratio. CSH co-administration restored the redox status and prevented the oxidative stress induced by CDME administration. Taken together, the results suggest that CSH act not only as an intralysosomal cystine-depleting drug but also as a scavenger of free radicals, reducing cell damage by apoptosis. If these effects also occur on cystinotic patients, the antioxidant effect of CSH may contribute to retard the evolution of the disease.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α- cetoácidos de cadeia ramificada. Como conseqüência deste bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina, bem como de seus respectivos α-cetoácidos e α-hidroxiácidos de cadeia ramificada. A manifestação clínica da DXB varia da forma clássica severa a formas variantes moderadas. Os principais sinais clínicos laboratoriais apresentados pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose, hipoglicemia, recusa alimentar, opistótono, apnéia, ataxia, convulsões, coma, atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. No entanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. O tratamento para DXB consiste na restrição da ingestão de proteínas, bem como dos aminoácidos leucina isoleucina e valina, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais, minerais e vitaminas. Estudos in vitro têm demonstrado que os aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos α- cetoácidos acumulados na DXB estimulam a lipoperoxidação e reduzem as defesas antioxidantes em córtex cerebral de ratos. O objetivo deste estudo foi investigar se o estresse oxidativo ocorre em pacientes com DXB em tratamento ou ainda não tratados. Inicialmente, foram analisados parâmetros de estresse oxidativo em amostras de plasma de pacientes com DXB obtidas antes do início do tratamento (no diagnóstico). Foi observado um aumento significativo das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e uma diminuição significativa da reatividade antioxidante total (TAR). Em seguida foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo em plasma de dois grupos de pacientes com DXB em tratamento dietético com níveis plasmáticos baixos e altos de leucina. Verificou-se um marcado aumento do TBARS e uma diminuição significativa do TAR em ambos os grupos de pacientes tratados, porém a redução do TAR foi mais pronunciada nos pacientes com baixos níveis sanguíneos de leucina. Além disso, não foi observada correlação entre os níveis de leucina, isoleucina ou valina com os parâmetros de estresse oxidativo. Em continuidade ao trabalho, foram estudados os níveis de selênio no plasma de pacientes com DXB antes e durante o tratamento dietético, bem como a atividade de enzimas antioxidantes em eritrócitos de pacientes em tratamento. Foi verificado que os pacientes com DXB apresentam uma deficiência moderada de selênio no momento do diagnóstico (antes do tratamento) da doença e que essa deficiência se agrava com o tratamento dietético. Ainda, verificou-se que a atividade da enzima glutationa peroxidase está diminuída em eritrócitos de pacientes em tratamento. Posteriormente, foram medidos vários parâmetros bioquímicos em plasma de pacientes com DXB tratados, com o objetivo de verificar se havia correlação destes com parâmetros de estresse oxidativo. Foi demonstrado que os pacientes com DXB em tratamento apresentam redução nos níveis séricos de glicose, colesterol total, creatinina sérica e albumina e aumento na atividade enzimática da aspartato aminotransferase e da lactato desidrogenase. (Continua). Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos, alanina aminotransferase, creatina quinase, uréia e ácido úrico. Foi ainda verificado um aumento significativo de TBARS e uma diminuição significativa de TAR, bem como uma correlação positiva entre a medida de 3 TBARS e os níveis de triglicerídeos. Concluindo, nossos resultados indicam que existe um desequilíbrio entre a produção de radicais livres (aumento) e as defesas antioxidantes (diminuição) gerando estresse oxidativo em pacientes com DXB não tratados e em tratamento e que esse processo não está correlacionado com os níveis plasmáticos dos aminoácidos leucina, isoleucina e valina acumulados nesta doença. Além disso, verificamos que a deficiência de selênio e a concomitante diminuição da atividade da glutationa peroxidase podem estar associados ao desenvolvimento do estresse oxidativo nesta doença. É, portanto, possível inferir que o dano oxidativo contribua, pelo menos em parte, para a fisiopatologia desta doença, explicando o dano neurológico que ocorre nos pacientes afetados. Portanto, é possível que a administração de antioxidantes possa ser útil na DXB. / Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency of the branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity. This blockage leads to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine, as well as their corresponding α- keto acids and α-hydroxy acids. Clinical manifestations are variable, pending on the variants classical severe form to milder variants. The major clinical features presented by MSUD patients include ketoacidosis, hypoglycemia, poor feeding, opisthotonos, apnea, ataxia, convulsions, coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the mechanisms of the neurological symptoms presented by MSUD patients are still poorly understood. MSUD treatment consists of a low protein diet and a semi-synthetic formula poor in leucine, isoleucine, and valina and supplemented by essential amino acids minerals and vitamins. Studies have been showed that the branched-chain amino acids and their corresponding brached-chain α-keto acids accumulating in MSUD stimulate in vitro lipid peroxidation and reduce antioxidant defences in cerebral cortex of rats. The objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in MSUD patients treated and non-treated. First, it was analyzed parameters of oxidative stress in plasma from non-treated MSUD patients. It was observed a significant increase of thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and a marked reduction in total antioxidant reactivity (TAR). Parameters of oxidative stress in plasma from two groups of MSUD patients under dietetic treatment with low and high blood leucine levels were also evaluated. It was verified an increase of TBARS and a significant decrease of TAR in both groups of MSUD patients. However, TAR reduction was higher in the group presenting low leucine levels. On the other hand, it was not found a correlation between leucine, valine and isoleucine levels and oxidative stress parameters. Selenium levels in plasma from MSUD patients at diagnosis (nontreated) and under treatment, as well as the activities of antioxidant enzymes in erythrocytes from treated patients were also determined. MSUD patients presented a significant selenium deficiency at diagnosis which becomes more pronounced during treatment and a decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity during treatment. Subsequently, it was evaluated various biochemical parameters in plasma from MSUD patients during treatment in order to verify if there was correlation between these parameters and oxidative stress. It was demonstrated that MSUD patients under treatment present a reduction of glucose, total cholesterol, albumin and creatinine levels and an increased activity of aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase. However, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, alanine aminotransferase, creatine kinase, urea and uric acid measurements were not altered. Besides, it was verified a significant increase of TBARS and a significant decrease of TAR, as well as a positive correlation between TBARS and triglycerides levels. In summary, our results suggest an imbalance between the production of free radicals and the antioxidant defenses in MSUD patients leading to oxidative stress at diagnosis and during treatment and that this is not correlated with the amino acids leucine, isoleucine and valine accumulating in this disease. Besides, the selenium deficiency and the decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity could be associated to the development of oxidative stress. Finally, it is possible that oxidative damage may contribute, at least in part, to the pathophysiology of this disorder. If that is the case, antioxidants may serve as an adjuvant therapy in MSUD.

As acidemias isovalérica (IVAcidemia), 3-metilglutacônica (MGTA) e 3- hidroxi-3-metilglutárica (HMGA) são doenças hereditárias neurometabólicas que afetam o catabolismo da leucina. Os pacientes afetados pela IVAcidemia apresentam acúmulo e excreção urinária aumentada dos ácidos isovalérico (IVA), 3- hidroxiisovalérico (3-OHIVA) e da isovalerilglicina, ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária dos ácidos 3-metilglutacônico (MGT), 3-metilglutárico (MGA) e 3-OHIVA. Os indivíduos afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção dos ácidos 3-hidroxi-3- metilglutárico (HMG), MGA, MGT e 3-OHIVA. Os pacientes afetados por essas doenças apresentam sintomas predominantemente neurológicos cujos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano cerebral são pouco conhecidos. No presente estudo, investigamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA e IVG), bem como da administração intracerebroventricular de IVA sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos efeitos inibitórios do IVA sobre o ciclo do ácido cítrico (produção de CO2 e citrato sintase), bem como sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase, sugerindo que esse ácido orgânico pode causar disfunção mitocondrial e prejudicar a neurotransmissão. Além disso, demonstramos que os efeitos inibitórios causados pelo IVA, tanto in vitro quanto ex vivo, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase foram prevenidos pela pré-incubação com trolox e creatina (ensaios in vitro) e pelo prétratamento (experimentos ex vivo) com creatina, respectivamente, sugerindo o envolvimento da formação de espécies reativas nesse efeito inibitório. Além disso, estudamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na MGTA sobre parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que tanto o MGT quanto o MGA não causaram qualquer alteração in vitro nos parâmetros de metabolismo energético examinados (produção de CO2 a partir de glicose, atividade dos complexos da cadeia de transporte de elétrons e das enzimas creatina quinase e Na+,K+-ATPase), sugerindo assim que as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes afetados por essa doença não parecem ser devidas à redução na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Finalmente, estudamos também os efeitos in vitro e da administração intracerebroventricular in vivo do HMG sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens Demonstramos que o HMG não causa qualquer alteração tanto in vitro quanto ex vivo nos parâmetros analisados em córtex cerebral de ratos, indicando assim que o as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes não parecem ser devidas a inibições na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Tomados em seu conjunto, os resultados presentes apontam para um efeito neurotóxico do IVA in vitro e in vivo, inibindo o metabolismo energético e provavelmente a neurotransmissão em córtex cerebral. Considerando-se que esse ácido orgânico acumula-se predominantemente na IVAcidemia, a mais severa das três doenças estudadas, é possível concluir que as convulsões frequentes e a atrofia cortical severa que acomete os pacientes afetados por essa doença possam ser devidos à inibição da produção de energia e da Na+,K+-ATPase, uma enzima crucial para a neurotransmissão glutamatérgica. / Isovaleric (IVAcidemia), 3-methylglutaconic (MGTA) and 3-hydroxy- 3methylglutaric (HMGA) acidemias are inborn neurometabolic diseases affecting leucine catabolism. IVAcidemia is characterized by accumulation and high urinary excretion of isovaleric (IVA) and 3-hydroxyisovaleric (3-OHIVA) acids and isovalerylglycine (IVG), whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of the branched-chain organic acids 3-methylglutaconic (MGT), 3- methylglutaric (MGA) and OHIVA. HMGA is characterized by high urinary excretion of the organic acids 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), MGA, MGT and 3-OHIVA, Patients affected by these acidemias predominantly present neurologic symptoms whose mechanisms involved in the pathophysiology of cerebral damage are virtually unknown. In the present study, we investigated the in vitro effects of the metabolites accumulating in IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA and IVG), as well as the effects of intracerebroventricular injection of IVA on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex of young rats. We observed that IVA inhibited citric acid cycle activity (CO2 production and citrate synthase activity), as well as the activity of Na+,K+- ATPase, suggesting that this organic acid can induce mitochondrial dysfunction and disturb neurotransmission. Moreover, we demonstrated that the in vitro and ex vivo inhibitory effects caused by IVA on Na+,K+-ATPase activity were prevented by preincubation with trolox and creatine (in vitro experiments) and pre-treatment with creatine (in vivo experiments), suggesting the participation of reactive species formation on this inhibitory effect. Next, we studied the in vitro effect of the metabolites accumulating in MGTA on energy metabolism parameters on cerebral cortex of young rats. Our results showed that both MGT and MGA did not alter the parameters analyzed (CO2 production from glucose, the activities of the electron transfer chain complexes and of the enzymes creatine kinase and Na+,K+-ATPase), suggesting that the neurological alterations presented by patients affected by MGTA are not due to reduction on energy production, transfer or utilization by the brain. Finally, we also studied the in vitro and of intracerebroventricular administration effects of HMG on energy metabolism parameters in cerebral cortex of young rats. We demonstrated that HMG did not alter both in vitro and ex vivo the analyzed parameters on cerebral cortex of rats, indicating that the neurological alterations presented by affected patients are not caused by inhibition of production, transfer or utilization of energy by the brain. Taking together, our results point to a neurotoxic effect of IVA in vitro and in vivo, by inhibit energy metabolism and probably neurotransmission in cerebral cortex. Considering that this organic acid accumulates in IVAcidemia, the most severe of the diseases studied, it is feasible to conclude that convulsions and cortical atrophy presented by affected patients can be due to inhibition of energy production and of Na+,K+-ATPase activity, a crucial enzyme for glutamatergic neurotransmission.

A doença de Fabry (DF) é uma doença lisossômica com herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência na enzima alfa-galactosidase A (GLA), gerando acúmulo progressivo de globotriaosilceramida no interior dos lisossomos. O diagnóstico bioquímico de DF é baseado na medida da atividade enzimática da GLA e pode ser difícil em alguns casos, devido à diversidade de fenótipos encontrados e à diferença existente entre indivíduos masculinos (hemizigotos) e femininos (heterozigotos). Tendo em vista a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para este diagnóstico, o objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar as propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF), plasma e leucócitos de pacientes com DF e indivíduos saudáveis, bem como avaliar o uso de Nacetilgalactosamina (GalNAc) como inibidor da alfa-galactosidase B em ensaios realizados para os mesmos fins. A atividade da GLA foi caracterizada e comparada em termos de: pH ótimo, Km, Vmáx e termoestabilidade. Foram realizados ensaios para medida da atividade da GLA utilizando diferentes concentrações de GalNAc em amostras de SPF, plasma e leucócitos de controles e pacientes com DF. Foi observada diferença entre a Vmáx da GLA de pacientes com DF e controles saudáveis utilizando amostras de SPF, plasma e leucócitos. Em leucócitos, a préincubação a 50 °C por 1 hora foi efetiva para diferenciar pacientes com DF de controles. Foi observada diferença entre a atividade da alfa-galactosidase na ausência e presença de GalNAc, em todas as concentrações testadas do inibidor, utilizando amostras de SPF de mulheres com DF e amostras de plasma de homens com DF. Em plasma, atividade residual de mulheres e homens saudáveis diferiu em ensaios utilizando 50 mM de GalNAc, e a atividade residual de homens com DF foi menor que a atividade de homens saudáveis, para todas as concentrações testadas do inibidor. Em leucócitos, não foi observada diferença na atividade em diferentes concentrações de GalNAc, nem entre os grupos estudados. Os resultados da comparação das propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA podem ser usados como ferramenta auxiliar para o diagnóstico da DF, especialmente em casos de pacientes cuja atividade da GLA se encontra dentro dos limites considerados normais. A utilização de GalNAc pode diminuir os resultados falsonegativos, principalmente quando utilizado amostras de SPF e plasma. Em leucócitos, o uso do inibidor parece não ser necessário. / Fabry disease (FD) is a lysosomal disorder with X-linked inheritance, caused by a deficiency in the enzyme alpha-galactosidase A (GLA), resulting in progressive accumulation of globotriaosylceramide within lysosomes. The biochemical diagnosis of FD is based on the measurement of GLA enzymatic activity and can be difficult in some cases due to the diversity of phenotypes and the difference between male (hemizygous) and female (heterozygous) subjects. Given the need for improvements in the diagnosis techniques, the aim of this study was to establish and compare the GLA biochemical and kinetic properties using dried blood spots (DBS), plasma and leukocytes samples of FD patients and healthy individuals, as well as evaluating the use of N-acetylgalactosamine (GalNAc) as an inhibitor of alpha-galactosidase B in assays for the same purposes. The GLA activity was characterized and compared in terms of pH optimum, Km, Vmax and thermostability. Assays for measuring GLA activity using different concentrations of GalNAc in DBS, plasma and leukocytes samples of FD patients and controls were performed. A difference was observed between the Vmax of FD patients and controls using DBS, plasma and leukocyte samples. In leukocytes, pre-incubation at 50 °C for 60 min was effective to differentiate FD patients from healthy controls. It was observed a difference between alphagalactosidase activity in the absence and presence of GalNAc at all concentrations of inhibitor tested, using DBS samples of women with FD and plasma samples of men with DF. In plasma, the residual activity of male and female healthy subjects differed in assays using 50 mM GalNAc, and the residual activity of men with FD was lower than the activity of healthy men, for all concentrations of the inhibitor. In leukocytes, no difference in GLA activity was observed neither at different concentrations of GalNAc nor between groups. The results comparing the biochemical and kinetic properties of GLA can be used as an auxiliary method to the FD diagnosis, especially in cases of patients whose GLA activity is within normal range. The use of GalNAc can decrease the false-negative results, especially when DBS and plasma samples are used. In leukocytes, the use of the inhibitor seems not to be necessary.