Cistinose é um erro inato do metabolismo, associado ao acúmulo de cistina nos lisossomos, causado pelo efluxo defeituoso de cistina. O acúmulo de cistina provoca uma série de sintomas, dependendo do tecido envolvido. Atrofia cortical é uma possível conseqüência do acúmulo de cistina no córtex cerebral. Contudo, os mecanismos pelos quais a cistina é tóxica para os tecidos estão longe de serem esclarecidos. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crucial para a homeostasia energética, e que dissulfetos como a cistina podem alterar enzimas tiólicas pela troca tiol/dissulfeto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da cistina sobre a atividade da creatinaquinase em homogeneizado total e frações citosólica e mitocondrial de córtex cerebral de ratos Wistar de 21 dias de idade. Nós também fizemos estudos cinéticos e investigamos o efeito da glutationa reduzida, um protetor natural de grupos tiólicos, e cisteamina, a droga usada para o tratamento da cistinose, sobre a atividade da creatinaquinase. Os resultados mostraram que a cistina inibe a atividade enzimática nãocompetitivamente de uma maneira tempo e dose dependente. Resultados mostram ainda que a glutationa preveniu e reverteu parcialmente a inibição causada pela cistina, enquanto a cisteamina preveniu e reverteu completamente aquela inibição, sugerindo que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase por interação com os grupos sulfidrílicos da enzima. Devido ao envolvimento da creatinaquinase na homeostasia energética do córtex cerebral, estes resultados sugerem um possível mecanismo para a toxicidade da cistina e também um possível efeito benéfico no uso da cisteamina em pacientes cistinóticos.

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

A deficiência da desidrogenase de acilas de cadeia média (MCAD) é o mais freqüente erro inato da oxidação de ácidos graxos. Os indivíduos afetados por esse distúrbio apresentam-se sintomáticos durante períodos de descompensação metabólica, caracterizado pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia média (AGCM), particularmente os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e cis-4-decenóico (AcD). Durante as crises, os pacientes apresentam hipoglicemia hipocetótica, hipotonia, rabdomiólise, edema cerebral e, finalmente, entram em coma, podendo ter um desenlace fatal. O tratamento de urgência é baseado na infusão de glicose nos pacientes durante as crises, enquanto uma dieta rica em carboidratos e pobre em gorduras é recomendada nos períodos fora das crises. Uma parte considerável dos pacientes que sobrevivem às crises apresenta um grau variável de manifestações neurológicas. Entretanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos da deficiência de MCAD são praticamente desconhecidos. No presente estudo avaliamos a influência dos principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD, os ácidos AO, AD e AcD, e , em alguns casos, também de seus derivados de carnitina e glicina, sobre as atividades de enzimas importantes do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos Wistar de 30 dias de vida. AO, AD, AcD e octanoilcarnitina inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase, com ênfase ao AcD, o inibidor mais potente da atividade da enzima. Além disso, verificamos que a co-incubação do AO com glutationa (GSH) ou trolox (vitamina E solúvel) evitou seu efeito inibitório sobre a atividade da enzima. A inibição da enzima pelo AcD foi também prevenida quando o mesmo foi co-incubado com as enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) juntas, mas não com GSH. Além disso, AO, AD e AcD aumentaram a lipoperoxidação em homogeneizados de córtex cerebral de ratos, medidos por quimioluminescência e TBA-RS. Tais resultados sugerem que esses metabólitos inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase via radicais livres. Observamos ainda que somente AD e AcD inibiram atividades dos complexos da cadeia respiratória, ao contrário do AO que não teve qualquer ação sobre essas atividades. Enquanto o AD diminuiu somente a atividade do complexo IV a uma concentração muito alta (3 mM), o AcD diminuiu as atividades dos complexos II, II-III e IV dentro da faixa de concentrações encontrada na deficiência de MCAD (0,25-0,5 mM). Além disso, AO, AD e AcD inibiram a produção de CO2 a aprtir de glicose e acetato radiativos como substratos, indicando uma inibição do ciclo de Krebs. No entanto, somente AD e AcD reduziram a produção de CO2 a partir de citrato, enquanto AO não alterou a mesma. Além disso, nenhum dos três metabólitos testados alterou a atividade da citrato sintase. Demonstramos ainda que o AcD reduziu as atividades da creatinaquinase mitocondrial e citosólica, mas em uma concentração muito alta não encontrada na deficiência de MCAD. Este efeito não foi evitado por GSH, vitamina C+E ou L-NAME, sugerindo que o mesmo deve ter ocorrido via mecanismo distinto do estresse oxidativo. AcD foi o inibidor mais potente das atividades enzimáticas testadas neste trabalho, indicando que deve ser o metabólito de maior toxicidade nesta doença, ao menos no que se refere ao comprometimento do metabolismo energético. Espera-se que nossos resultados possam contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos envolvidos na deficiência de MCAD.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. / Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients affected by short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy, illnesses characterized by neurological and muscular symptoms. Considering that the mechanisms responsible for the brain and skeletal muscle damage in these diseases are poorly known, in the present work we investigated the effects of acute EMA administration on oxidative stress parameters in cerebral cortex and skeletal muscle from 30-day-old rats. Animals received three subcutaneous injections of EMA (6 mol/g; 90 min interval between injections) and were killed 1 h after the last injection. Control animals received saline in the same volumes. EMA administration significantly increased thiobarbituric acid-reactive substances levels in cerebral cortex and skeletal muscle, indicating an increased lipid peroxidation. In addition, carbonyl content was increased in EMA-treated animal skeletal muscle when compared to the saline group. EMA administration also significantly increased DCFH oxidation and superoxide production (reactive species markers), and decreased glutathione peroxidase activity in cerebral cortex, while glutathione levels were decreased in skeletal muscle. The present results show that acute EMA administration elicits oxidative stress in rat brain and skeletal muscle, suggesting that oxidative damage may be involved in the pathophysiology of the brain and muscle symptoms found in patients affected by SCADD and ethylmalonic encephalopathy. / O ácido etilmalônico (EMA) se acumula em tecidos e fluidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da desidrogenase de acil-coenzima A de cadeia curta (SCADD) e pela encefalopatia etilmalônica (EE). Ambas as doenças caracterizam-se por sintomas neurológicos e musculares. O presente trabalho investigou os efeitos da administração aguda de EMA sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos de 30 dias de vida. Os animais receberam três injeções subcutâneas de EMA (6 μmol/g; 90 minutos de intervalo entre as injeções) e foram eutanasiados 1 hora após a última injeção. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes. A administração de EMA aumentou significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo de grupamentos carbonila em córtex cerebral e músculo esquelético, quando comparados ao grupo controle. A administração aguda de EMA também aumentou significativamente a oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína reduzida e a geração de ânion superóxido. Por outro lado, a atividade da enzima glutationa peroxidase em córtex cerebral foi inibida pela administração de EMA, em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, os níveis de glutationa reduzidas encontraram-se diminuídos no músculo esquelético dos animais que receberam a administração aguda de EMA. Os resultados do presente estudo mostram que a administração aguda de EMA induz estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos jovens, sugerindo que o dano oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia dos danos neurológicos e musculares encontradas em pacientes afetados por SCADD e EE.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Mutations in the TAT gene cause tyrosinaemia type II (Richner–Hanhart syndrome). It is an autosomal recessive disorder caused by, producing a TAT enzyme with decreased or inexistent activity, which leads to increased blood tyrosine levels and clinical manifestations such as keratitis and/or painful palmoplantar hyperkeratotic lesions and inflammations in the eyes. Neurological manifestations are variable and some patients are developmentally normal, while others show different degrees of developmental retardation. Considering that increased blood tyrosine levels cause neurological manifestations and that the mechanisms responsible by this alterations are poorly understood, In the present study, we evaluated the effects of L-tyrosine administration on the activities of enzymes citrate synthase, malate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, and complexes I, II, II-III, and IV of mitochondrial respiratory chain in the posterior cortex, hippocampus and striatum of rats with 10-day-old. Wistar rats were killed one hour after a single intraperitoneal injection of either tyrosine (500 mg/kg) or saline. The activities of energy metabolism enzymes were evaluated. Our results demonstrated that the acute administration of L-tyrosine in rats with 10-day-old inhibited the citrate synthase enzyme and the complex I and II activity of the mitochondrial respiratory chain in the striatum. The succinate dehydrogenase enzyme and the complex II-III activity were increased in the hippocampus. Furthermore, the malate dehydrogenase and the complex IV activity were not altered by an acute administration of L-tyrosine. In particular, several groups report that systemically administered tyrosine is differentially distributed across brain regions. In conclusion, our results indicate that an alteration in the energetic metabolism of the hippocampus and striatum can leads to damage in the involved in acquisition, retrieval, consolidation and storage of memory, and cognitive processes after the acute administration of L-tyrosine in young rats. Thus our results contribute to a better knowledge of the pathophysiology of hypertyrosinemia. / Mutações no gene tirosina aminotransferase (TAT) causam tirosinemia tipo II (síndrome de Richner-Hanhart) é uma doença autossômica recessiva causada pela atividade reduzida ou inexistente da enzima tirosina aminotransferase, o que leva a um aumento dos níveis sanguíneos de tirosina e manifestações clínicas como ceratite, lesões palmo plantares dolorosas e hiperqueratose e inflamações nos olhos. As manifestações neurológicas são variáveis e alguns pacientes tem desenvolvimento normal, enquanto outros mostram diferentes graus de retardo no desenvolvimento. Considerando que aumento dos níveis de tirosina no sangue, causam manifestações neurológicas e que os mecanismos responsáveis por estas alterações são mal compreendidos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da administração de L-tirosina sobre a atividade das enzimas citrato sintase, malato desidrogenase, succinato desidrogenase, e complexos I, II, II-III, e IV da cadeia respiratória mitocondrial no córtex, hipocampo e estriado de ratos com 10 dias de idade. Ratos Wistar foram mortos uma hora após uma única injeção intraperitoneal de tirosina (500mg/kg) ou solução salina. As atividades das enzimas do metabolismo energético foram avaliadas. Os nossos resultados demonstram que a administração aguda de L-tirosina em ratos com 10 dias de idade, inibiu a enzima citrato sintase e a atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial no estriado. A enzima succinato desidrogenase e atividade do complexo II-III foram aumentadas no hipocampo. Além disso, a malato-desidrogenase e a atividade do complexo IV não foram alteradas pela administração aguda de L-tirosina. Em particular, diversos grupos relataram que a tirosina administrada sistemicamente é diferencialmente distribuída entre as regiões do cérebro. Em conclusão, os nossos resultados indicam que uma alteração no metabolismo energético do hipocampo e corpo estriado pode levar a danos no desenvolvimento na aquisição, recuperação, consolidação e no armazenamento de memória, e os processos cognitivos após a administração aguda de L-tirosina em ratos infantes. Assim, nossos resultados contribuem para um melhor conhecimento da fisiopatologia da hipertirosinemia.

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / A galactosemia é um erro inato do metabolismo em que há deficiência no metabolismo da galactose, levando ao acúmulo de galactose e seus metabólitos nos tecidos e líquidos biológicos de pacientes. Os sinais incluem alterações comportamentais e deficiência intelectual, bem como danos hepáticos, renais e musculares, podendo ocasionar a morte. Estudos têm demonstrado que administrações crônicas e com altas concentrações de galactose causam efeitos deletérios em diversos tecidos corporais, incluindo o sistema nervoso central. Entretanto, a fisiopatologia da doença ainda não está totalmente desvendada. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração aguda de Dgalactose sobre parâmetros de metabolismo energético e de estresse oxidativo em estruturas cerebrais de ratos jovens. Foram utilizados ratos Wistar machos, de 30 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e galactosemia. Para a avaliação de parâmetros de metabolismo energético, os animais do grupo galactosemia receberam uma única administração subcutânea de galactose (5 μmol/g), enquanto os animais controles receberam solução salina no mesmo volume. Uma hora após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral, soro e liquido cefalo raquidiano foram isolados e analisados. Para a avaliação de parâmetros de estresse oxidativo, o protocolo de administração foi idêntico ao anterior. Uma, doze e vinte e quatro horas após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral e cerebelo foram isolados limpos e analisados. Observou-se que a administração aguda de D-galactose em ratos jovens causou diminuição significativa da succinato desidrogenase (SDH) em córtex cerebral, no período de uma hora. Também houve alteração da homeostase redox em córtex e cerebelo, com danos oxidativos e prejuízo das defesas antioxidantes, em todos os tempos estudados. Além disso, houve aumento significativo do estresse nitrosativo em córtex cerebral em todos os tempos estudados, porém em cerebelo apenas no período de doze horas da admistração de D-galactose. Os resultados do presente trabalho sugerem alterações no metabolismo energético cerebral e danos oxidativos e nitrosativos precoces em cérebro de ratos jovens. Tais achados podem colaborar para o esclarecimento dos danos cerebrais encontrados em pacientes galactosêmicos.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A doença do xarope do bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α cetoácidos de cadeia ramificada. Como consequência desse bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, bem como seus αcetoácidos e α hidroxiácidos correspondentes. As principais características clínicas apresentadas pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose convulsões, apnéia, hipoglicemia, coma, ataxia, retardo psicomotor e retardo mental, bem como edema generalizado e hipomielinização/desmielinização, como evidenciado por estudos de ressonância magnética do sistema nervoso central (SNC). No entanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. No presente estudo investigou-se os efeitos da administração aguda de um pool de AACR sobre o imunoconteúdo de alguns marcadores envolvidos na morte celular por apoptose (Bax, Bcl-2, Bcl-xL, caspase 3 e caspase 8), para melhor compreender a fisiopatologia da disfunção neurológica presente nos pacientes com DXB. Ratos Wistar de 10 e 30 dias de vida receberam três administrações de um pool de AACR (15,8 µL/g de peso corporal), com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea (grupo teste). Os animais do grupo controle receberam três administrações de salina, com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea. Uma hora após a última administração, os ratos foram mortos por decapitação, o cérebro foi removido e o hipocampo e córtex cerebral foram isolados. A quantificação das proteínas Bax, Bcl-2, Bcl-xL e as caspases 3 e 8 foram mensuradas por Western blotting. Em ratos de 30 dias foi observado um aumento no imunoconteúdo do fator pró-apoptótico Bax e das caspases 3 e 8 no córtex cerebral, por outro lado, houve diminuição das caspases 3 e 8 concomitantemente com aumento dos fatores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL no hipocampo. Estes resultados sugerem que os AACR induzem apoptose, ativada pela via extrínseca, seguida da ativação da via intrínseca, no córtex cerebral, porém no hipocampo os parâmetros analisados não demonstram alterações. Os presentes resultados contribuem para explicar, pelo menos em parte, as sequelas neurológicas associadas às altas concentrações plasmáticas dos metabólitos acumulados na doença do xarope do bordo. / A doença do xarope do bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α cetoácidos de cadeia ramificada. Como consequência desse bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, bem como seus αcetoácidos e α hidroxiácidos correspondentes. As principais características clínicas apresentadas pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose convulsões, apnéia, hipoglicemia, coma, ataxia, retardo psicomotor e retardo mental, bem como edema generalizado e hipomielinização/desmielinização, como evidenciado por estudos de ressonância magnética do sistema nervoso central (SNC). No entanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. No presente estudo investigou-se os efeitos da administração aguda de um pool de AACR sobre o imunoconteúdo de alguns marcadores envolvidos na morte celular por apoptose (Bax, Bcl-2, Bcl-xL, caspase 3 e caspase 8), para melhor compreender a fisiopatologia da disfunção neurológica presente nos pacientes com DXB. Ratos Wistar de 10 e 30 dias de vida receberam três administrações de um pool de AACR (15,8 µL/g de peso corporal), com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea (grupo teste). Os animais do grupo controle receberam três administrações de salina, com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea. Uma hora após a última administração, os ratos foram mortos por decapitação, o cérebro foi removido e o hipocampo e córtex cerebral foram isolados. A quantificação das proteínas Bax, Bcl-2, Bcl-xL e as caspases 3 e 8 foram mensuradas por Western blotting. Em ratos de 30 dias foi observado um aumento no imunoconteúdo do fator pró-apoptótico Bax e das caspases 3 e 8 no córtex cerebral, por outro lado, houve diminuição das caspases 3 e 8 concomitantemente com aumento dos fatores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL no hipocampo. Estes resultados sugerem que os AACR induzem apoptose, ativada pela via extrínseca, seguida da ativação da via intrínseca, no córtex cerebral, porém no hipocampo os parâmetros analisados não demonstram alterações. Os presentes resultados contribuem para explicar, pelo menos em parte, as sequelas neurológicas associadas às altas concentrações plasmáticas dos metabólitos acumulados na doença do xarope do bordo.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. / A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva causado pela deficiência da enzima metilmalonilCoA mutase. Os principais sinais e sintomas incluem danos neurológicos, renais e hepáticos. Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos orgânicos no plasma, na urina e em tecidos dos pacientes afetados, particularmente o ácido metilmalônico (MMA). Adicionalmente, os pacientes apresentam quadros de hiperamonemia, especialmente durante crises metabólicas. Entretanto, até o momento, não se sabe a influência da hiperamonemia na fisiopatologia da doença, bem como a toxicidade do MMA associado à hiperamonemia. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar parâmetros bioenergéticos e inflamatórios em rim e fígado em um modelo animal de acidemia metilmalônica associada à hiperamonemia. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos com 7, 15, 30 e 60 dias de vida, divididos em 4 grupos experimentais: controle, MMA, acetato de amônio (AA) e MMA+AA. Os animais do grupo controle receberam solução de NaCl 0,9 % e os animais dos grupos tratados receberam MMA (1,76 µmol/g; s.c) associado ou não ao AA (2,65 µmol/g; i.p) por cinco dias.. Os resultados mostram aumento significativo da taxa de creatinina sérica no grupo de animais com 7 e 30 dias de vida nos grupos AA e MMA+AA, bem como aumento das concentrações de ureia, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase e creatina cinase em animais com 60 dias. Adicionalmente, foi observada uma redução da taxa de filtração glomerular nos grupos de animais com 7, 30 e 60 dias. A análise histológica apresentou resultados heterogêneos, como dilatação dos túbulos, vacuolização nos túbulos proximais e dilatação dos túbulos distais, assim como desestruturação celular com desintegração da sua estrutura, alteração do epitélio e retração glomerular no grupo MMA+AA. Também foram encontradas alterações significativas na atividade da enzima citrato sintase no tecido hepático de animais com 15, 30 e 60 dias e no tecido renal de animais com 15 dias de vida. A atividade da enzima succinato desidrogenase se mostrou diminuída no grupo de animais com 15, 30 e 60 dias sobre o tecido hepático e renal. Além disso, as atividades dos complexos da cadeia respiratória foram alteradas estatisticamente. A atividade do complexo IV foi aumentada em rins de animais com 15 dias de vida. Por outro lado, a atividade do complexo II-III da cadeia respiratória foi aumentada em tecido hepático de animais do grupo MMA+AA. No grupo de animais com 30 dias de vida, houve alteração das atividades dos complexos I e II no tecido hepático, bem como complexos e II, II-III e IV no tecido renal de animais com 60 dias de vida. Aliados a esses resultados, foram observadas alterações estatisticamente significativas nos níveis de interleucina 6 e fator de necrose tumoral alfa (TNFα) em tecido hepático dos animais do grupos MMA, AA e MMA+AA e de TNFα no tecido renal de animais com 30 dias de vida dos grupos MMA e MMA+AA. Tomados em conjunto, esses achados sugerem que alterações bioenergéticas e inflamatórios ocasionadas pela toxicidade da hiperamonemia associada ao MMA podem colaborar para os danos hepáticos e renais apresentados por pacientes acometidos pela acidemia metilmalônica.

Os ácidos fitânico (Fit) e pristânico (Prist) são ácidos graxos saturados de cadeia lateral ramificada, cujas concentrações estão aumentadas em diversas doenças peroxissomais. Os pacientes afetados por esses distúrbios apresentam predominantemente manifestações clínicas neurológicas. As concentrações elevadas do Fit e Prist, que podem chegar a 5000 μM e 300 μM, respectivamente, no plasma dos indivíduos afetados, indicam que estes ácidos graxos possam ser neurotóxicos. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos Fit e Prist sobre vários parâmetros do metabolismo energético e sobre a Na+,K+-ATPase em cerebelo e cérebro de ratos jovens. Inicialmente, observamos que o Fit diminuiu a atividade dos complexos da cadeia respiratória I, I-III, II e II-III, sem alterar o IV, indicando que o funcionamento da cadeia respiratória está prejudicado por esse ácido graxo. Além disso, o Fit diminuiu o estado 3 da respiração mitocondrial, achados que refletem uma inibição metabólica. Por outro lado, a atividade da enzima creatina quinase (CK), não foi alterada pelo Fit, enquanto a atividade da enzima Na+,K+-ATPase foi diminuída de maneira acentuada, indicando que a neurotransmissão possa estar prejudicada por esse metabólito. Além disso, o Fit aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu os valores do índice de controle respiratório (RCR). O Fit também diminuiu o potencial de membrana, que foi atenuado pela adição de NAC, e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Já o Prist inibiu a produção de 14CO2 a partir de [1-14C] acetato, sugerindo uma redução da atividade do ciclo do ácido cítrico. O Prist também diminuiu acentuadamente a atividade dos complexos I, II e II-III sem interferir na atividade do complexo IV, o que indica que esse ácido graxo interfere no fluxo dos elétrons pela cadeia respiratória, podendo comprometer a geração de ATP. Além disso, o Prist diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O, achados que indicam uma inibição metabólica e também uma diminuição na eficiência da fosforilação oxidativa provocada por esse ácido graxo. Também determinamos as atividades da enzima CK, que não foi alterada pelo Prist, e da enzima Na+,K+-ATPase que foi significativamente reduzida, o que indica que a manutenção do potencial de membrana necessário para o funcionamento da neurotransmissão possa ser comprometida pelo Prist. Além disso, o Prist aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu os valores do índice de RCR. O Prist também diminuiu o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos (NAD(P)H) da matriz mitocondrial, achados que sugerem um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. O Prist também provocou inchamento mitocondrial que foi prevenido por ciclosporina e por NacetilcisteÍna, sugerindo o envolvimento do PTP nesse efeito, provavelmente através de mecanismos oxidativos. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos Fit e Prist acumulados em algumas doenças peroxissomais comprometem o metabolismo energético, atuando como desacopladores e inibidores da fosforilação oxidativa, bem como a neurotransmissão. É possível que esses mecanismos possam estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas desordens. / Phytanic acid (Phyt) and pristanic acid (Prist) are branched-chain saturated fatty acids whose concentrations are elevated in various peroxisomal disorders. Patients affected by these disorders present predominant neurological involvement. The elevation of plasma Phyt and Prist concentrations that can reach up to 5000 μM and 300 μM, respectively, indicate that these fatty acids may be neurotoxic. Considering that the pathophysiology of the neurological symptoms of these diseases are not well established, the present work proposed to investigate the in vitro effects of Phyt and Prist on various parameters of energy metabolism and Na+,K+-ATPase in cerebellum and brain of young rats. Initially, we observed that Phyt diminished the activities of complexes I, I-III, II and II-III but not IV of the respiratory chain, indicating that the respiratory chain function is impaired by this fatty acid. In addition, Phyt decreased state 3 of respiration, reflecting a metabolic inhibition. On the other hand, the activity of creatine kinase was not altered by this metabolite, whereas the activity of Na+,K+-ATPase was drastically reduced, indicating that the neurotransmission is probably compromised by this metabolite. Besides, Phyt markedly increased state 4 respiration and reduced the respiratory control ratio. Phyt also diminished the mitochondrial membrane potential, attenuated by NAC, and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative phosphorylation. Regarding on Prist effects, this fatty acid decrease 14CO2 production from labeled acetate suggesting an impairment of CAC functioning. Prist also reduced the activities of the respiratory chain complexes and observed that this fatty acid reduced the activity of complexes I, II and II-III without interfering with complex IV, indicating that this fatty acid compromises ATP generation. In addition, Prist decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, indicating a metabolic inhibition provoked by this fatty acid. We also determined the activities of creatine kinase, that was not altered by Prist, and .Na+,K+-ATPase, that was significantly reduced, indicating that the maintenance of membrane potential necessary to a normal neurotransmission may be a compromise by Prist. In addition, Prist increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. Prist also diminished the mitochondrial membrane potential, which was not prevented by NAC, and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative phosphorylation. Prist also provoked mitochondrial swelling and this effect was prevented by both cyclosporine and NAC, suggesting a PTP involvement on this effect probably through oxidative mechanisms. Taken together, our results suggest that the fatty acids Phyt and Prist accumulated in some peroxisomal diseases compromise energy metabolism, acting as uncouplers and oxidative phosphorylation inhibitors, as well as the neurotransmission. It is feasible that these mechanisms may be involved with the neurological damage presented by patients affected by these disorders.