Realizou-se um estudo estrutura-atividade sobre os efeitos citoprotetor/citotóxico de 5 flavonóides envolvendo processos mitocondriais, com ênfase na apoptose. Nossos resultados mostram que a dupla ligação na posição 2-3 / grupos 3-OH em conjugação com a função 4-oxo no anel C da estrutura dos flavonóides parece favorecer a interação destes compostos com a membrana mitocondrial, diminuindo a sua fluidez, e tanto inibindo a cadeia respiratória das mitocôndrias, quanto causando desacoplamento. Por outro lado, a estrutura o-di-OH no anel B parece favorecer a inibição da cadeia respiratória, sendo que a ausência desta estrutura parece favorecer a atividade desacopladora. Os flavonóides que não afetaram a respiração mitocondrial, induziram a transição de permeabilidade mitocondrial. A capacidade dos flavonóides em liberar o Ca2+ acumulado pelas mitocôndrias correlaciona-se com a sua capacidade de afetar a respiração mitocondrial e sua inabilidade em induzir a transição de permeabilidade mitocondrial. Já os dados referentes aos estudos da atividade protetora contra a formação de radicais livres demonstraram que a quercetina, luteolina e a galangina foram substancialmente mais potentes que a taxifolina e a catequina em conferir proteção contra a lipoperoxidação, embora somente a quercetina tenha sido um efetivo seqüestrador tanto de DPPH?, quanto de O2?-. Esses resultados sugerem que a dupla ligação na posição 2-3 em conjugação com a função 4-oxo na estrutura dos flavonóides são os fatores mais importantes na atividade antioxidante dos flavonóides sobre as mitocôndrias. Ainda, a presença da estrutura o-di-OH no anel B, conforme observado na quercetina, favorece essa atividade via seqüestro de O2?-, enquanto que a ausência dessa característica estrutural na galangina, a favorece via diminuição da fluidez de membrana e/ou desacoplamento mitocondrial. Os ensaios realizados para avaliar o efeito dos flavonóides sobre as células HepG2 mostraram que galangina, luteolina e quercetina são capazes de induzir morte celular. Esse efeito parece estar associado à dissipação do potencial de membrana mitocondrial e à diminuição na capacidade energética celular, mais pronunciada no caso dos dois primeiros; porém, como essa diminuição na concentração de ATP não é drástica, a morte celular pode ocorrer por apoptose. Os experimentos realizados para avaliar essa possibilidade sugerem uma ativação das caspases via mitocôndria, observada pelo aumento das atividades de caspase -9 e -3 e também pela exposição de fosfatidil serina. A taxifolina que não apresentou capacidade de produzir dano celular, apresentou, por outro lado, capacidade de prevenir parcialmente a diminuição de viabilidade das células HepG2 induzida pelo pró-oxidante t-butilhidroperóxido, aparentemente por meio de sua atividade antioxidante que inibiu, também de forma parcial, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. / We carried out a structure-activity study addressing the protective/toxic effects of 5 flavonoids (quercetin, taxifolin, luteolin, catechin and galangin) upon mitochondrial aspects with emphasis on the mechanisms potentially involved in cell apoptosis. The major findings were: The 2,3 double bond/3-OH group in conjugation with the 4-oxo function on the C-ring in the flavonoid structure seems favour the interaction of these compounds with the mitochondrial membrane, decreasing its fluidity either inhibiting the respiratory chain of mitochondria or causing uncoupling; while the o-di-OH on the B-ring seems favour the respiratory chain inhibition, the absence of this structure seems favour the uncoupling activity. The flavonoids not affecting the respiration of mitochondria induced MPT. The ability of flavonoids to induce the release of mitochondria-accumulated Ca2+ correlated well with their ability to affect mitochondrial respiration on the one hand, and their inability to induce MPT, on the other. The data concerning the protective activity against the free radical formation showed that quercetin, luteolin and galangin were far more potent than taxifolin and catechin in affording protection against lipid peroxidation, although only quercetin was an effective scavenger of both DPPH? and O2?-. These results suggest that the 2,3-double bound in conjugation with the 4-oxo function in the flavonoid structure are major determinants of the antioxidant activity of flavonoids on mitochondria, the presence of an o-di-OH structure on the B-ring, as occurring in quercetin, favouring this activity via O2?- scavenging, while the absence of this structural feature in galangin, favouring it via decrease in membrane fluidity and/or mitochondrial uncoupling. The assays addressing the flavonoids effects on HepG2 cells showed that galangin, luteolin and quercetin are able to induce cell death. This effect appears to be linked to the mitochondrial membrane potential dissipation and consequent decrease in the cellular energy charge, more pronounced for the galangin or luteolin treatment. However, since this decrease in ATP content is not drastic, the apoptosis process can occur. The set of experiments performed in order to evaluate this possibility demonstrated caspases-9 and -3 activation and also phosphatidylserine exposure on the cell membrane. On the other hand, taxifolin, that did not present ability to induce injury to the cell, was able to partially inhibit a viability decrease of HepG2 cell exposed to the pro-oxidant t-butylhydroperoxide, probably on account of its capacity to partially decrease ROS formation.

As estruturas e propriedades biológicas das amidas piplartina e a piperina, isoladas respectivamente de Piper tuberculatum e P. nigrum, inspiraram a síntese de 89 derivados e 7 esters estruturalmente relacionadas. As preparações envolveram metodologias tradicionais e os compostos purificados tiveram suas estruturas caracterizadas por análises espectroscópicas e espectrométricas. Os estudos de fragmentação por IE e IES indicaram a clivagem preferencial da ligação N-CO no caso das cinamamidas, dienamidas e cinamimidas. Estudos computacionais envolvendo afinidade protônica e energias de ligação confirmaram a fragmentação preferencial da ligação amídica para as amidas. A citotoxicidade de 89 substâncias foi avaliada contra três células leucêmicas (K562, Nalm6 e Raji) e a partir dos valores de IC50 foram realizados estudos de relação estrutura-atividade (SAR). As linhagens K562 e a Nalm6 foram a mais resistente e vulnerável, respectivamente, e as amidas piplartina (1a), N-Ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)propanamida (1n), e (E)-N,N-dibutil-3-(3,4-dimetoxifenil)acrilamida (13h) foram as mais ativas com IC50 de 0,34 µM; 0,84 µM e 1,88 µM contra K562 e (E)-N-ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)-3-(3,4-dimetoxifenil)acrylamida (13i) com IC50 de 0,98 µM contra Nalm6. A avaliação de atividade leishmanicida de 18 substâncias não se mostrou promissora. As abordagens qualitativas e quantitativas foram feitas baseadas nos descritores moleculares gerados pelo programa VolSurf+. A partir de métodos quimiométricos tais com PLS, algoritmo genético, árvores de decisão foi possível gerar modelos para correlacionar às propriedades moleculares com a atividade biológica. As propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção e os equilíbrios entres as regiões hidrofílicas e hidrofóbicas foram importantes para atividade citotóxica. O estudo de ancoragem molecular mostrou que as amidas (E)-N,N-dibutil-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acrilamida (1l), 1n, (E)-3-(4-clorofenil)-N-ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)acrilamida (5a), 13h e 13i podem atuar como inibidores das histonas desacetilases particularmente HDAC4 e HDAC8. / The structures and biological properties of the amides piplartine and piperine isolated from Piper tuberculatum and P. nigrum respectively, inspired the synthesis of derivatives 89 and 7 esters structurally related. Their preparations were achieved using classical procedures and the purified amides were submitted to spectroscopic and spectrometric characterization. The study of fragmentation process by EI and ESI suggested the preferential cleavage of the N-CO bond of cinnamamides, dienamides and cinnamimides. The cytotoxicity of 89 compounds was evaluated against three leukemic cells (K562, Nalm6 and Raji) and based on IC50 values the structure-activity relationship (SAR) was performed. While the K562 and Nalm6 cells were the more resistant and more sensitive, respectively, the amides piplartine (1a), N-cyclohexyl-N-(ciclohexylcarbamoyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propanamide (1n) and (E)-N,N-dibutyl-3-(3,4-dimethoxyphenyl)acrylamide (13h) were in general the most active with IC50 of 0.34 µM, 0.84 µM and 1.88 µM against K562 and (E)-N-cyclohexyl-N-(ciclohexylcarbamoyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)acrylamide (13i) with IC50 of 0.98 µM against Nalm6. The evaluation of leishmanicidal activity of 18 substances was also performed but was not promising. Qualitative and quantitative approaches were made based on molecular descriptors generated by VolSurf+ program. The chemometric methods such as PLS, genetic algorithm, decision trees generated models to correlate molecular properties with the biological activity. The absorption, distribution, metabolism and excretion properties and a balance between hydrophilic and hydrophobic moieties of the amides were important for an optimized activity. The molecular docking revealed that amides such as (E)-N,N-dibutyl-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylamide (1l), 1n, (E)-3-(4-chlorophenyl)-N-cyclohexil-N-(cyclohexylcarbamoyl)acrylamide (5a), 13h and 13i have potential to act as possible inhibitors of histone deacetylase proteins particularly HDAC4 and HDAC8.

A hemoglobina (Hb) é uma fonte reconhecida de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 da cadeia α da Hb, isolado do trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus, foi o primeiro a ser descrito com ação antimicrobiana. O seu análogo sintético amidado, Hb33-61a, mostrou-se ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos [Fogaça et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. O estudo de análogos do Hb33-61 nas formas amidada e com carboxila livre revelou que a amidação provoca aumento significativo da atividade frente a Candida albicans. Por apresentar propriedades biológicas e estruturais idênticas às do Hb33-61a, o Hb40-61a pareceu ser a sua porção mÌnima ativa [Sforça et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. Para comprovar tal sugestão, no presente trabalho, sintetizamos, purificamos e caracterizamos novos an·logos do Hb33-61a, bem como os avaliamos quanto às suas atividades frente a C. albicans e Micrococcus luteus. Os resultados confirmaram a sugestão apenas para a ação antifúngica. O análogo Hb40-61a também se mostrou ativo frente a C. albicans resistente a fluconazol. A sua atividade antifúngica se mostrou fortemente dependente da força iônica do meio. A sua baixa atividade hemolítica foi confirmada mesmo em meio de baixa força iônica. O peptídeo Hb40-61a não apresentou sinergismo com o fluconazol frente a C. albicans. A cinética de morte celular mostrou que ele mata a levedura de forma rápida. Portanto, esta hemocidina sintética pode apresentar valor comercial se a via de administração for tópica ou se o seu uso envolver meios de baixa força iônica. Além disso, ela é um modelo valioso para o estudo do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos com características estruturais similares e pode servir de base para o desenho de novos agentes antibiôticos. / It is well known that hemoglobin (Hb) is a source of biologically active peptides. The fragment 33-61 of bovine hemoglobin α-chain, isolated from the gut contents of the tick Boophilus microplus, was the first identified with antimicrobial activity . Its amidated analogue, Hb33-61a, showed to be active against Gram-positive bacteria and fungi strains [FogaÁa et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. The study of a series of carboxyl-free and amidated synthetic analogues of Hb33-61 revealed that C-terminus amidation enhances the activity against Candida albicans. Since Hb33-61a and Hb40-61a presented identical biological and structural properties, it seemed that Hb40-61a was Hb33-61a minimal active motif [SforÁa et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- To test this suggestion, in the present study 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. we synthesized, purified and characterized Hb40-61a analogues and assayed them against C. albicans and Micrococcus luteus. The results confirmed the suggestion only for the antifungal activity. When tested against fluconazole-resistant C. albicans, Hb40-61a was also active. Its antifungal activity showed to be dependent on the ionic strength of the medium. Its low hemolytic activity was confirmed even under low ionic strength conditions. Hb40-61a had no synergic effect with fluconazole on C. albicans. In vitro time-kill assays demonstrated that Hb40-61a kills the yeast rapidly. Therefore, this synthetic hemocidin may be of commercial interest for topical application or other uses involving low ionic strength medium. Moreover, it can serve as a template for the study of the mechanism of action of structurally related antimicrobial peptides or for the design of novel antibiotic drugs.

A reemergência de algumas bactérias Gram-positivas, em particular, do gênero Staphylococcus, como principal foco causador de infecções hospitalares, tem se intensificado nas últimas décadas, e, apesar da existência de potentes fármacos voltados para o tratamento de infecções causadas por este gênero de bactéria, as taxas de morbidade e mortalidade prevalecem com perfil crescente. Além disso, um grande problema associado a cepas de MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é o fenótipo de multi-resistência, característica que confere a este microrganismo resistência não apenas à meticilina como também a uma série de outros fármacos, exceto frente à vancomicina e à teicoplanina. Muito tem se feito, mas ainda são poucos os resultados efetivamente aplicáveis no tratamento de infecções com caráter de multi-resistência, justificando, desta forma, a necessidade de desenvolvimento de sucedâneos que sejam consideravelmente mais efetivos para a solução deste problema. Baseado nestes fatos, a proposta deste estudo envolveu o planejamento, síntese, identificação e estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) em duas e três dimensões de derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos com atividade antimicrobiana frente a cepas padrão e multi-resistente de Staphylococcus aureus. A escolha dos grupos substituintes foi realizada em duas etapas. Na primeira delas seguiu-se metodologia de substituição em anéis aromáticos proposta por Topliss para a otimização da bioatividade de compostos. Em uma segunda etapa, predominantemente quantitativa, foram selecionados mais alguns derivados baseando-se em faixa de hidrofobicidade ótima pré-determinada experimentalmente e na variação de efeito estérico dos grupos substituintes. Quatorze derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos foram sintetizados, estruturalmente identificados e avaliados quanto à atividade antimicrobiana frente às cepas padrão (ATCC 25923) e multi-resistente (3SP/R33) de Staphylococcus aureus por determinação da concentração inibitória mínima empregando-se método de macrodiluição sucessiva em tubos. Salienta-se que a cepa 3SP/R33 se mostra resistente a dezenove antibióticos empregados na prática médica e apresenta suscetibilidade apenas à vancomicina. As concentrações inibitória e bactericida mínimas apresentadas pelos compostos sintetizados mostraram sofrer influência significativa da hidrofobicidade sobre as referidas atividades de acordo com os estudos de QSAR-2D e QSAR-3D, sendo os resultados obtidos para a cepa multi-resistente absolutamente compatíveis com os anteriormente determinados para a cepa padrão. Os estudos de QSAR-2D indicaram que a atividade antimicrobiana das 5nitro-2-tiofilideno benzidrazidas substituídas sofre influência significativa de duas propriedades físico-químicas que são a hidrofobicidade e a distribuição eletrônica. A relevância dos descritores estruturais σ e efe na determinação da atividade antimicrobiana, sinalizam que a distribuição eletrônica influencia fortemente o aumento da potência antimicrobiana dos compostos em estudo tanto pela influência dos efeitos indutivo e de ressonância na estrutura química do ligante, como também pelos campos moleculares gerados ao redor de grupos substituintes, sugerindo uma possível interação dos mesmos com uma área específica do sítio receptor. Nos estudos de QSAR-3D, foi evidenciado, em concordância com o estudo clássico anteriormente realizado, que a hidrofobicidade prevalece como propriedade de fundamental importância no estabelecimento da atividade antimicrobiana. Foi observada a importância da presença de regiões hidrofílicas pontuais nos compostos de forma a propiciar processos de solvatação e dessolvatação que são críticos na difusão através de membranas biológicas. Pode-se afirmar que a análise de QSAR, considerando os aspectos tridimensionais ligantes, ressaltou a necessidade de um balanço lipofílico-hidrofílico para um bom desempenho das 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas ρ-substituídas como agentes antimicrobianos. A partir dos resultados obtidos evidenciou-se, neste estudo, o forte potencial de derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos como possível alternativa para o desenvolvimento racional, em nível molecular, de fármacos voltados para o tratamento de infecções causadas por cepas multi-resistentes de Staphylococcus aureus. / In the last decade, there has been a reemergence of Gram-positive bacteria, in particular Staphylococcus, which isconsidered one of the. most causing of nosocomial infections. Although potent antistaphylococcal drugs are available, this infection continues presenting increasing morbidity and mortality rates. Besides, a serious problem associated with MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) is the phenotype of multidrug resistance, which is, resistance not only to methicillin but also to many other drugs, except to vancomycin and teicoplanin. Many efforts have been made in a tentative to reduce this problem, nevertheless there is only a few number of alternatives to combat Staphylococcus aureus multidrug-resistant strains, justifying the necessity of development of more effective compounds to the treatment of these infections. Based in these facts, the purpose of this study was the design, synthesis, structural identification and 2D-QSAR and 3D-QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) studies of 5-nitro-2-thiophylidene derivatives with antimicrobial activity against multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus. The choice of substituent groups was made in two stages. The first stage comprises on application of Topliss operational scheme for aromatic substitution. In a second quantitative stage, more derivatives were selected according by hydrophobicity range previously determined. Other standard considered at the selection of substituent groups was the variation of steric effect. Fourteen 5-nitro-2-thiophylidene derivatives were synthesized, structural identified and tested against standard (A TCC 25923) and multidrug-resistant (3SP/R33) strains of Staphylococcus aureus. The Minimal Inhibitory Concentration, MIC, was determined using the serial dilution tests in two sequential stages. The 3SP/R33 strain is resistant to nineteen antimicrobial agents in use, except to vancomycin. The minimal inhibitory and bactericidal concentrations of synthesized compounds showed, according by 2D-QSAR and 3D-QSAR studies, a significant influence of hydrophobic properties on antimicrobial activity determination and the results obtained for multidrug-resistant strain were consistent with those determined for A TCC 25923 strain. 2D-QSAR studies showed that antimicrobial activity are mainly influenced by two physico-chemical properties: hydrophobicity and electronic distribution. The relevance of σ e ephe parameters on antimicrobial activity determination, denotes the contribution of inductive and resonance effects for the polar performed by the substituent groups, probably suggesting an interaction between them and specific receptor site. 3D-QSAR studies showed that hydrophobicity is a essential property to antimicrobial activity determination, sustained the same conclusions previously obtained by Hansch Analysis. It was observed a great concern of small hydrophilic regions distributed on derivatives in order to promote solvation and desolvation process, that have critical importance on diffusion process through the biological membranes. QSAR studies considering three-dimensional properties of ligands indicated the necessity of accurate hydrophilic-hydrophobic balance on nitrothiophene derivatives for their good performance as antimicrobial agents. The results obtained in this preliminary study have shown the potential of synthesized compounds as alternatives to the treatment of infections caused by multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-30T20:10:51Z No. of bitstreams: 2 TAISA PEREIRA PIACENTINI RIBEIRO.pdf: 3904493 bytes, checksum: 479855c30863d881e3a40de6b85ca548 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T20:10:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TAISA PEREIRA PIACENTINI RIBEIRO.pdf: 3904493 bytes, checksum: 479855c30863d881e3a40de6b85ca548 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-09 / The search for new herbicides to control herbicides-resistant weeds is necessary to attend the rising demand of food from the world’s population. This work was divided into two parts. The first aimed to obtain a model of QSAR-2D, 3D and hybrid to predict compounds with activity to the inhibition of photosynthesis. For this, was used a data set of 44 quinoline analogues described in the literature as PET inhibitors, and all tested in the same bioassay method. For construction of models were used the programs QSAR Modeling and Pentacle. The obtained models A, C and D, were approved in the validation tests (internal and external), they are robust and with good predictive capacity. The second part of studie aimed to identify a pharmacophore model, for select compounds from the data set of first part, aiming to use as a tool for virtual screening. The research resulted in 86,560 compounds, and thus several screening filters were applied according to Briggs rule of three, in silico toxicity analyzes, unsupervised pattern recognition (PCA), and docking studies. As a result, 28 compounds remained, all of which showed potential to be herbicides, through the prediction using the obtained QSAR models, however, only the model D proved to be reliable for prediction the virtual screening. Finally, we selected the ten compounds that presented the highest predictive value of PET inhibition activity, using the model D. / A busca de novos herbicidas para o controle de ervas daninhas resistentes é necessária para atender à crescente demanda alimentar da população mundial. Este trabalho foi dividido em duas partes. A primeira teve por objetivo a obtenção de modelos de QSAR-2D, 3D e híbrido para previsão de compostos com atividade de inibição da fotossíntese. Para isso, foi utilizado um conjunto de dados formado por 44 análogos de quinolina descritos na literatura como inibidores do PET e todos testados pela mesma metodologia de ensaio biológico. Para construção dos modelos foram utilizados os programas QSAR Modeling e Pentacle. Os modelos A, C e D obtidos foram aprovados nos testes de validação (interna e externa), são robustos e com boa capacidade de previsão. A segunda parte do estudo teve como objetivo a identificação de um modelo farmacofórico, para compostos selecionados do conjunto de dados da primeira parte, visando o uso do mesmo como ferramenta para triagem virtual. A pesquisa resultou em 86.560 compostos, e assim foram aplicados diversos filtros de seleção de acordo com a regra de três de Briggs, análises “in silico” de toxicidade, técnica de reconhecimento de padrões não supervisionados (PCA), e estudos e ancoramento molecular. Como resultado, restaram 28 compostos, sendo que todos mostraram potencial para serem herbicidas, através da previsão utilizando os modelos de QSAR obtidos, porém apenas o modelo D mostrou-se confiável para previsão da triagem virtual. Por fim, foram selecionados os dez compostos que apresentaram maior valor de previsão de atividade de inibição do PET, utilizando o modelo D.

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra microrganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. As EROs produzidas, tais como O2∙-, H2O2, HO∙, HOCl, 1O2 e NO, que são essenciais para matar os microrganismos fagocitados, podem também ser liberadas para o meio extracelular e causar lesões oxidativas aos tecidos do hospedeiro. Essas lesões têm sido implicadas na patogênese de doenças como aterosclerose, câncer, artrite reumatóide, pneumonia e enfisema pulmonar. Com o intuito de prevenir essas lesões oxidativas, tem-se investigado a atividade antioxidante de diversos compostos, especialmente os derivados de plantas. Neste trabalho foram avaliadas as atividades de oito cumarinas simples (compostos 1 a 8) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados com Zimosan opsonizado, empregando-se os ensaios de quimioluminescência (QL) dependente de lucigenina (QLluc) e de QL dependente de luminol (QLlum). A QLluc reflete a produção apenas de O2∙- , enquanto que a QLlum é resultante da oxidação do luminol pelas diversas EROs produzidas pelos neutrófilos estimulados. Assim, a inibição da QLluc e da QLlum será decorrente da redução da concentração das EROs responsáveis pela oxidação da lucigenina e do luminol no meio de reação, respectivamente. Foram avaliadas também a atividade dos antioxidantes a-tocoferol, butil-hidroxitolueno (BHT) e quercetina sobre a QLlum e a QLluc, e a toxicidade das cumarinas 1 a 8 e dos três antioxidantes citados sobre os neutrófilos de coelho. Determinou-se o coeficiente de partição e o volume molecular das cumarinas 1 a 8. Dentre os três antioxidantes, observou-se que a quercetina inibiu tanto a QLlum quanto a QLluc, e não foi tóxica para os neutrófilos, na concentração de 50 mmol/L. O a-tocoferol não inibiu a QLlum nem a QLluc, enquanto o BHT foi tóxico para os neutrófilos de coelho. Para as cumarinas simples, observou-se que: (1) a cumarina 1 não apresentou atividade inibitória sobre a QLluc e sobre a QLlum; (2) as cumarinas 3, 4, 5 e 6 tiveram atividades inibitórias sobre a QLluc semelhantes à da quecetina, que foram maiores que as das cumarinas 2, 7 e 8; (3) as atividades inibitórias das cumarinas 2 a 8 sobre a QLluc não estão relacionadas à lipofilicidade e ao volume molecular desses compostos, nem à toxicidade dos mesmos sobre os neutrófilos de coelho; (4) as cumarinas 3 e 4 provocaram aumento da QLlum medida, enquanto as demais não tiveram atividade neste sistema. / Neutrophils play a crucial role in the defense of the organism against invading microorganisms, thorough phagocytosis, degranulation and generation of reactive oxygen species (EROS). The last one is a consequence of activation of neutrophils\' oxidative metabolism. The produced EROs, such as O2∙-, H2O2, HOCl, HO∙, 1O2 and NO, which are essential for killing phagocyted microorganisms, may also be released to the extracellular milieu and inflict oxidative damage to host tissues. This damage has been implicated in the pathogenesis of diseases, such as arteriosclerosis, cancer, rheumatoid arthritis, pneumonia and lung emphysema. The antioxidant activity of many compounds, especially those obtained from plants, has been investigated with the aim of avoid such oxidative damage. In this work, we studied the activity of eight simple coumarins (compounds 1 to 8) on the oxidative metabolism of rabbit neutrophils upon stimulation by opsonized zymosan, using luminol- (QLlum) and lucigenin (QLluc)-enhanced chemiluminescence (QL) assays. QLluc reflects generation of O2∙- only, whereas QLlum is a result of luminol oxidation by the various EROs produced by the stimulated neutrophils. Inhibition of QLluc and of QLlum will be a consequence of the decrease of the concentration of that EROs which are involved in the oxidation of lucigenin and luminol, respectively, in the reaction medium. We also evaluated the activity of the antioxidants a-tocopherol, butyl-hydroxytoluene (BHT) and quercetin on QLlum and QLluc, and the toxicity of coumarins 1 to 8 and the three antioxidants on rabbit neutrophils. Partition coefficient and molecular volume values of coumarins 1 to 8 were determined. We observed that, among the three antioxidants, quercetin inhibited QLlum and QLluc, and was not toxic to the neutrophils at concentration of 50 mmol/L. BHT was toxic to the rabbit neutrophils whereas a-tocopherol did not inhibit QLlum nor QLluc. For the simple coumarins we observed that: (1) coumarin 1 did not inhibit QLlum nor QLluc; (2) coumarins 3, 4, 5 and 6 had inhibitory effects, which were similar to the quercetin and higher than coumarins 2, 7 and 8; (3) the inhibitory activities of coumarins 2 to 8 on QLluc were not related to the lipophilicity and to the molecular volume of these compounds, nor to their toxicity upon the rabbit neutrophils; (4) coumarins 3 and 4 increased the QLlum, whereas the others had no effect on this system.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-13T12:15:49Z No. of bitstreams: 1 arquuivototal.pdf: 3577415 bytes, checksum: 0e9d2a60e77718e50720d15b7cad6fb1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T12:15:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquuivototal.pdf: 3577415 bytes, checksum: 0e9d2a60e77718e50720d15b7cad6fb1 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In recent decades fungal infections have increased, and their high rates of morbidity and mortality have brought them much attention. Immunocompromised patients are more susceptible to microorganism infections; in particular, fungal species of the genus Aspergillus spp. Among the current infectious filamentous fungi they have a rather high incidence. Antifungal treatments have been subjected to numerous studies, and the increasing number of resistant fungal species has been highlighted. Thus, we see the importance of seeking new, more effective, and less toxic therapeutic sources. The aim of this study was to evaluate the in vitro antifungal activity and structure activity relationships of coumarin compounds against Aspergillus species. For this the MIC of 24 coumarin compounds was determined and subsequent SAR studies were performed with computer software. 12 of the 24 tested coumarin derivatives have antifungal activity, with 5 has shown excelent activity. Thus two derivatives, 7-hydroxy-6-nitrocoumarin (Cou-UNO2), and 4-acetoxycoumarin (Cou-UMB16), with better MIC values were evaluated via inhibition of mycelial growth and conidial germination, and by mechanism of action testing. The products were evaluated in combination with antifungals standards. The results showed that 12 of the 24 tested coumarin derivatives have antifungal activity, with MIC values ranging from 1024-16μg/ml. SAR studies have showed that the presence of a short aliphatic chain, and/or electronegative groups like ring substituents are favorable for antifungal activity. The coumarin derivatives with better MIC values (16μg/ml); Cou-UNO2 and Cou-UMB16 were capable of inhibiting both the mycelial growth and conidial germination of Aspergillus spp. Their activity is on the structure of the fungal cell wall. Cou-NO2, in a sub-inhibitory concentration, enhanced the in vitro effects of azoles, and in combination with azoles (voriconazole and itraconazole) there was an additive effect. Cou-UMB16 in combination with azoles (voriconazole and itraconazole) had synergistic or additive effects depending on the strain used. Thus this study concludes that coumarin derivatives have antifungal activity against the species A. flavus and A. fumigatus. The coumarin Cou-UMB16 and Cou-UNO2 have able to inhibit the mycelial growth and conidio germination and that this activity is due to its action on the fungal cell wall and the presence of electronegative groups as substituents of the benzopyrone ring favors this activity. / As infecções fúngicas, nas últimas décadas, têm se destacado devido ao seu crescente aumento e suas elevadas taxas de morbidade e mortalidade. Pacientes imunocomprometidos são os que possuem maior susceptibilidade a estes micro-organismos. Dentre estas infecções fúngicas, as espécies pertencentes ao gênero Aspergillus spp. possuem alta incidência entre os fungos filamentosos. A terapêutica antifúngica tem sido alvo de numerosos estudos e nestes tem sido destacado o crescente aumento de espécies fúngicas resistentes. Dessa forma, destaca-se a importância da busca de novas fontes terapêuticas que se apresentem mais eficazes e com menos tóxicas ao hospedeiro. Assim o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica in vitro e relação estrutura atividade (SAR) dos compostos cumarínicos frente às espécies do gênero Aspergillus. Para tal foi determinada a CIM de 24 compostos cumarínicos e posteriormente realizado estudos SAR com softwares computacionais. Dos 24 compostos ensaiados, 12 demonstraram possuir atividade antifúngica e 5 obtiveram forte atividade antifúngica. Destes derivados cumarínicos com forte atividade antifúngica, dois merecem destaque, 7-hidroxi-6-nitrocumarina (Cou-UNO2) e 4-acetóxicumarina (Cou-UMB16), com melhores valores de CIM, foram avaliados via testes de inibição do crescimento micelial, germinação dos conídios e testes de determinação do mecanismo de ação. Por fim os produtos foram avaliados em combinação com antifúngicos padrões. Os resultados demonstraram que 12 derivados cumarínicos dos 24 ensaiados possuem atividade antifúngica, com valores de CIMs variando entre 1024-16μg/mL. A SAR demonstra que a adição de grupos eletronegativos, como substituintes do anel benzopirona, favorece a atividade antifúngica destes compostos. Os derivados cumarínicos com melhores CIM (16μg/mL), 7-hidroxi-6-nitrocumarina (Cou-UNO2) e 4-acetóxicumarina (Cou-UMB16) foram capazes de inibir o crescimento micelial e a germinação dos conídios de Aspergillus spp. E estes possuem ação sobre a estrutura da parede celular fúngica. Em uma concentração subinibitória, Cou-UNO2 potencializou a ação in vitro dos derivados azólicos e em combinação com os derivados azólicos (voriconazol e itraconazol) observou-se um efeito aditivo. Já Cou-UMB16 em combinação com os derivados azólicos (voriconazol e itraconazol) obteve um efeito sinérgico a aditivo, dependendo da linhagem utilizada. Logo este estudo conclui que os derivados cumarínicos possuem atividade antifúngica contra as espécies de A. flavus e A. fumigatus. As cumarinas Cou-UNO2 e Cou-UMB16 foram capazes de inibir o crescimento micelial e a germinação dos conídios e que esta atividade seja devido a sua ação sobre a parede celular fúngica. E que esta atividade é favorecida pela presença de moléculas eletronegativas no anel básico da cumarina (1,2-benzopirona).

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra microrganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. As EROs produzidas, tais como O2∙-, H2O2, HO∙, HOCl, 1O2 e NO, que são essenciais para matar os microrganismos fagocitados, podem também ser liberadas para o meio extracelular e causar lesões oxidativas aos tecidos do hospedeiro. Essas lesões têm sido implicadas na patogênese de doenças como aterosclerose, câncer, artrite reumatóide, pneumonia e enfisema pulmonar. Com o intuito de prevenir essas lesões oxidativas, tem-se investigado a atividade antioxidante de diversos compostos, especialmente os derivados de plantas. Neste trabalho foram avaliadas as atividades de oito cumarinas simples (compostos 1 a 8) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados com Zimosan opsonizado, empregando-se os ensaios de quimioluminescência (QL) dependente de lucigenina (QLluc) e de QL dependente de luminol (QLlum). A QLluc reflete a produção apenas de O2∙- , enquanto que a QLlum é resultante da oxidação do luminol pelas diversas EROs produzidas pelos neutrófilos estimulados. Assim, a inibição da QLluc e da QLlum será decorrente da redução da concentração das EROs responsáveis pela oxidação da lucigenina e do luminol no meio de reação, respectivamente. Foram avaliadas também a atividade dos antioxidantes a-tocoferol, butil-hidroxitolueno (BHT) e quercetina sobre a QLlum e a QLluc, e a toxicidade das cumarinas 1 a 8 e dos três antioxidantes citados sobre os neutrófilos de coelho. Determinou-se o coeficiente de partição e o volume molecular das cumarinas 1 a 8. Dentre os três antioxidantes, observou-se que a quercetina inibiu tanto a QLlum quanto a QLluc, e não foi tóxica para os neutrófilos, na concentração de 50 mmol/L. O a-tocoferol não inibiu a QLlum nem a QLluc, enquanto o BHT foi tóxico para os neutrófilos de coelho. Para as cumarinas simples, observou-se que: (1) a cumarina 1 não apresentou atividade inibitória sobre a QLluc e sobre a QLlum; (2) as cumarinas 3, 4, 5 e 6 tiveram atividades inibitórias sobre a QLluc semelhantes à da quecetina, que foram maiores que as das cumarinas 2, 7 e 8; (3) as atividades inibitórias das cumarinas 2 a 8 sobre a QLluc não estão relacionadas à lipofilicidade e ao volume molecular desses compostos, nem à toxicidade dos mesmos sobre os neutrófilos de coelho; (4) as cumarinas 3 e 4 provocaram aumento da QLlum medida, enquanto as demais não tiveram atividade neste sistema. / Neutrophils play a crucial role in the defense of the organism against invading microorganisms, thorough phagocytosis, degranulation and generation of reactive oxygen species (EROS). The last one is a consequence of activation of neutrophils\' oxidative metabolism. The produced EROs, such as O2∙-, H2O2, HOCl, HO∙, 1O2 and NO, which are essential for killing phagocyted microorganisms, may also be released to the extracellular milieu and inflict oxidative damage to host tissues. This damage has been implicated in the pathogenesis of diseases, such as arteriosclerosis, cancer, rheumatoid arthritis, pneumonia and lung emphysema. The antioxidant activity of many compounds, especially those obtained from plants, has been investigated with the aim of avoid such oxidative damage. In this work, we studied the activity of eight simple coumarins (compounds 1 to 8) on the oxidative metabolism of rabbit neutrophils upon stimulation by opsonized zymosan, using luminol- (QLlum) and lucigenin (QLluc)-enhanced chemiluminescence (QL) assays. QLluc reflects generation of O2∙- only, whereas QLlum is a result of luminol oxidation by the various EROs produced by the stimulated neutrophils. Inhibition of QLluc and of QLlum will be a consequence of the decrease of the concentration of that EROs which are involved in the oxidation of lucigenin and luminol, respectively, in the reaction medium. We also evaluated the activity of the antioxidants a-tocopherol, butyl-hydroxytoluene (BHT) and quercetin on QLlum and QLluc, and the toxicity of coumarins 1 to 8 and the three antioxidants on rabbit neutrophils. Partition coefficient and molecular volume values of coumarins 1 to 8 were determined. We observed that, among the three antioxidants, quercetin inhibited QLlum and QLluc, and was not toxic to the neutrophils at concentration of 50 mmol/L. BHT was toxic to the rabbit neutrophils whereas a-tocopherol did not inhibit QLlum nor QLluc. For the simple coumarins we observed that: (1) coumarin 1 did not inhibit QLlum nor QLluc; (2) coumarins 3, 4, 5 and 6 had inhibitory effects, which were similar to the quercetin and higher than coumarins 2, 7 and 8; (3) the inhibitory activities of coumarins 2 to 8 on QLluc were not related to the lipophilicity and to the molecular volume of these compounds, nor to their toxicity upon the rabbit neutrophils; (4) coumarins 3 and 4 increased the QLlum, whereas the others had no effect on this system.

As estruturas e propriedades biológicas das amidas piplartina e a piperina, isoladas respectivamente de Piper tuberculatum e P. nigrum, inspiraram a síntese de 89 derivados e 7 esters estruturalmente relacionadas. As preparações envolveram metodologias tradicionais e os compostos purificados tiveram suas estruturas caracterizadas por análises espectroscópicas e espectrométricas. Os estudos de fragmentação por IE e IES indicaram a clivagem preferencial da ligação N-CO no caso das cinamamidas, dienamidas e cinamimidas. Estudos computacionais envolvendo afinidade protônica e energias de ligação confirmaram a fragmentação preferencial da ligação amídica para as amidas. A citotoxicidade de 89 substâncias foi avaliada contra três células leucêmicas (K562, Nalm6 e Raji) e a partir dos valores de IC50 foram realizados estudos de relação estrutura-atividade (SAR). As linhagens K562 e a Nalm6 foram a mais resistente e vulnerável, respectivamente, e as amidas piplartina (1a), N-Ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)propanamida (1n), e (E)-N,N-dibutil-3-(3,4-dimetoxifenil)acrilamida (13h) foram as mais ativas com IC50 de 0,34 µM; 0,84 µM e 1,88 µM contra K562 e (E)-N-ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)-3-(3,4-dimetoxifenil)acrylamida (13i) com IC50 de 0,98 µM contra Nalm6. A avaliação de atividade leishmanicida de 18 substâncias não se mostrou promissora. As abordagens qualitativas e quantitativas foram feitas baseadas nos descritores moleculares gerados pelo programa VolSurf+. A partir de métodos quimiométricos tais com PLS, algoritmo genético, árvores de decisão foi possível gerar modelos para correlacionar às propriedades moleculares com a atividade biológica. As propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção e os equilíbrios entres as regiões hidrofílicas e hidrofóbicas foram importantes para atividade citotóxica. O estudo de ancoragem molecular mostrou que as amidas (E)-N,N-dibutil-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acrilamida (1l), 1n, (E)-3-(4-clorofenil)-N-ciclohexil-N-(ciclohexilcarbamoil)acrilamida (5a), 13h e 13i podem atuar como inibidores das histonas desacetilases particularmente HDAC4 e HDAC8. / The structures and biological properties of the amides piplartine and piperine isolated from Piper tuberculatum and P. nigrum respectively, inspired the synthesis of derivatives 89 and 7 esters structurally related. Their preparations were achieved using classical procedures and the purified amides were submitted to spectroscopic and spectrometric characterization. The study of fragmentation process by EI and ESI suggested the preferential cleavage of the N-CO bond of cinnamamides, dienamides and cinnamimides. The cytotoxicity of 89 compounds was evaluated against three leukemic cells (K562, Nalm6 and Raji) and based on IC50 values the structure-activity relationship (SAR) was performed. While the K562 and Nalm6 cells were the more resistant and more sensitive, respectively, the amides piplartine (1a), N-cyclohexyl-N-(ciclohexylcarbamoyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propanamide (1n) and (E)-N,N-dibutyl-3-(3,4-dimethoxyphenyl)acrylamide (13h) were in general the most active with IC50 of 0.34 µM, 0.84 µM and 1.88 µM against K562 and (E)-N-cyclohexyl-N-(ciclohexylcarbamoyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)acrylamide (13i) with IC50 of 0.98 µM against Nalm6. The evaluation of leishmanicidal activity of 18 substances was also performed but was not promising. Qualitative and quantitative approaches were made based on molecular descriptors generated by VolSurf+ program. The chemometric methods such as PLS, genetic algorithm, decision trees generated models to correlate molecular properties with the biological activity. The absorption, distribution, metabolism and excretion properties and a balance between hydrophilic and hydrophobic moieties of the amides were important for an optimized activity. The molecular docking revealed that amides such as (E)-N,N-dibutyl-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylamide (1l), 1n, (E)-3-(4-chlorophenyl)-N-cyclohexil-N-(cyclohexylcarbamoyl)acrylamide (5a), 13h and 13i have potential to act as possible inhibitors of histone deacetylase proteins particularly HDAC4 and HDAC8.

A hemoglobina (Hb) é uma fonte reconhecida de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 da cadeia α da Hb, isolado do trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus, foi o primeiro a ser descrito com ação antimicrobiana. O seu análogo sintético amidado, Hb33-61a, mostrou-se ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos [Fogaça et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. O estudo de análogos do Hb33-61 nas formas amidada e com carboxila livre revelou que a amidação provoca aumento significativo da atividade frente a Candida albicans. Por apresentar propriedades biológicas e estruturais idênticas às do Hb33-61a, o Hb40-61a pareceu ser a sua porção mÌnima ativa [Sforça et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. Para comprovar tal sugestão, no presente trabalho, sintetizamos, purificamos e caracterizamos novos an·logos do Hb33-61a, bem como os avaliamos quanto às suas atividades frente a C. albicans e Micrococcus luteus. Os resultados confirmaram a sugestão apenas para a ação antifúngica. O análogo Hb40-61a também se mostrou ativo frente a C. albicans resistente a fluconazol. A sua atividade antifúngica se mostrou fortemente dependente da força iônica do meio. A sua baixa atividade hemolítica foi confirmada mesmo em meio de baixa força iônica. O peptídeo Hb40-61a não apresentou sinergismo com o fluconazol frente a C. albicans. A cinética de morte celular mostrou que ele mata a levedura de forma rápida. Portanto, esta hemocidina sintética pode apresentar valor comercial se a via de administração for tópica ou se o seu uso envolver meios de baixa força iônica. Além disso, ela é um modelo valioso para o estudo do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos com características estruturais similares e pode servir de base para o desenho de novos agentes antibiôticos. / It is well known that hemoglobin (Hb) is a source of biologically active peptides. The fragment 33-61 of bovine hemoglobin α-chain, isolated from the gut contents of the tick Boophilus microplus, was the first identified with antimicrobial activity . Its amidated analogue, Hb33-61a, showed to be active against Gram-positive bacteria and fungi strains [FogaÁa et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. The study of a series of carboxyl-free and amidated synthetic analogues of Hb33-61 revealed that C-terminus amidation enhances the activity against Candida albicans. Since Hb33-61a and Hb40-61a presented identical biological and structural properties, it seemed that Hb40-61a was Hb33-61a minimal active motif [SforÁa et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- To test this suggestion, in the present study 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. we synthesized, purified and characterized Hb40-61a analogues and assayed them against C. albicans and Micrococcus luteus. The results confirmed the suggestion only for the antifungal activity. When tested against fluconazole-resistant C. albicans, Hb40-61a was also active. Its antifungal activity showed to be dependent on the ionic strength of the medium. Its low hemolytic activity was confirmed even under low ionic strength conditions. Hb40-61a had no synergic effect with fluconazole on C. albicans. In vitro time-kill assays demonstrated that Hb40-61a kills the yeast rapidly. Therefore, this synthetic hemocidin may be of commercial interest for topical application or other uses involving low ionic strength medium. Moreover, it can serve as a template for the study of the mechanism of action of structurally related antimicrobial peptides or for the design of novel antibiotic drugs.