Bone defects are a pervasive complication arising from many clinical conditions, both mechanical and pathological. Current treatments for large bony defects focus on applying bone grafts or synthetic materials to the defect area. Cell-based—and especially stem-cell—therapies have advanced greatly thanks to increasing attention focused on their ability to generate new tissues in situ with biomechanical properties approaching that of native tissue, but they suffer from their own shortcomings as well. Exosomes have been shown to play critical roles in cell-signaling and tissue regeneration and are therefore potentially ideal therapeutic vehicles for treating bone defects. Exosomes are small microvesicles counted amongst stem cells’ paracrine factors capable of delivering nucleic acid and enzymatic protein cargoes in a targeted 2 manner. Our previous studies have shown that hMSC-Exosomes are both proliferative and chemotactic, inhibit inflammatory cytokine production, and suppress osteoclast differentiation. Our long term goal is to develop hMSC-Exosome as a clinical therapy for bone regeneration. The objectives of this study were to determine the ability of hMSC-Exosome to enhance bone healing in a rat calvarial defect model, and to further investigate the integrity of the exosome under certain storage conditions. The specific aims of this study were: 1) To determine the osteogenic potential of hMSC-Exosomes in rat calvarial defects, and 2) To determine the impact of variable storage conditions on the integrity of exosomes. To investigate in vivo regenerative potential, rats with surgically-created craniotomy defects were treated with hMSC-Exosome suspension via a collagen gel matrix. After 4 weeks, the calvaria were harvested and analyzed via micro-CT. Volumetric micro-CT analysis showed that hMSC-Exosome could significantly enhance center healing, structural integrity, and growth uniformity in a calvarial defect model. Western blot and TEM showed thorough destruction of surface protein markers and decreased membrane integrity in lyophilized exosome fraction; moderate progressive surface protein marker loss and aggregation were observed with increasing freeze-thaw cycles. In summary, hMSC-Exosome is a promising therapeutic for treatment of bone defects.

Les « terminal balls » qui constituent des complexes de maturation sont détectées à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes eucaryotes inspectés à ce jour ; générant les images de référence en « arbres de Noël ». La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées « SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes. Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S). Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres de Noël ». La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation. Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité 5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de mécanismes de contrôles de qualité. Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage (liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases 3’-5’ l’ Exosome.

Deux classes de poly(A)-binding protein (PABP) lient la queue poly(A) des ARNm chez la plupart des mammifères: PABPC1 au cytosol et PABPN1 au noyau. PABPC1 stimule la traduction des ARNm tandis que PABPN1 stimule la processivité de la poly(A) polymérase tout en contrôlant la taille des queues poly(A). Il est à noter que les orthologues de PABPC1 sont bien caractérisés chez la levure, toutefois un homologue de PABPN1 n'avait jamais été identifié. Précédemment, le Dr. Bachand avait réalisé une purification par affinité avec la protéine d’arginine méthyltransférase I (Rmt1) couplée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d'identifier l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission. Différentes expériences ont démontré que Pab2 est une protéine nucléaire non-essentielle qui lie spécifiquement des séquences poly(A) in vitro. Pab2 a été identifiée par son interaction avec Rmt1 et cette enzyme méthyle les arginines présentes dans le domaine riche en arginine de la protéine Pab2. Cette modification post-traductionnelle n'affecte pas la localisation nucléaire et l’affinité aux séquences poly(A) de Pab2. Par contre, les niveaux d’oligomérisation de Pab2 sont nettement augmentés lorsque Pab2 n’est plus méthylée. De plus, les ARNs provenant de cellules [Delta]pab2 sont hyperadénylés, ce qui corrobore avec la fonction de PABPN1 à contrôler la taille des queues poly(A) in vitro. Par la suite, j'ai caractérisé l’implication de Pab2 durant la maturation du pré-ARNm. Des essais d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont établi que Pab2 est recrutée co-transcriptionnellement aux gènes activement transcrits. De façon surprenante, mes études ont démontré que le recrutement de Pab2 précède celui d'un facteur impliqué dans le clivage et la polyadénylation. De plus, le recrutement de Pab2 dépend de l’ARNm naissant. Conséquemment, j'ai voulu identifier les protéines associées à Pab2. Ainsi, une purification d’affinité par tandem couplée à la spectrométrie de masse a révélé que Pab2 est associée à plusieurs protéines ribosomales ainsi que des facteurs de traduction générale. Ces données étaient étonnantes puisque la traduction des ARNm implique la protéine Pab1. Par conséquent, il était pertinent de vérifier le rôle possible de Pab2 sur la traduction. À priori, j ’ai confirmé que Pab2 fait la navette entre le noyau et le cytosol, ce qui concorde avec l’orthologue PABPN1. Par la suite, j'ai démontré qu’une fraction de la protéine Pab2 demeure associée aux ARNm activement traduits. Il devenait alors intéressant de connaître les cibles de Pab2. L’analyse génomique a établi que Pab2 régule l’expression de certains transcrits, tels que les gènes méïotiques, les snoRNAs et les rétrotransposons. Pour la suite de mes recherches, je me suis concentrée sur le gène codant pour la protéine ribosomale de la large sous-unité Rpl30-2, dont l’expression augmente de 4 fois en absence de Pab2. Il est intéressant de noter que le changement d ’expression de Rpl30-2 dans une souche [Delta]pab2 dépend de la présence de l’intron Rpl30-2. Mes travaux démontrent que l’expression de Rpl30-2 est régulée au niveau du pré-ARNm par Pab2 et Rrp6, une composante de l’exosome nucléaire. De plus, l’analyse du transcriptome par RNA-seq a établi que ce mécanisme permet de réguler l’expression d'une soixantaine de gènes qui sont inefficacement épissés. En ce qui concerne Rpl30-2, l’épissage de ce transcrit est ralenti par Rpl30-1, le paralogue de Rpl30-2. L’ensemble de mes travaux ont pu caractériser l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission tout en établissant une fonction spécifique pour cette poly(A)-binding protein.

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Les HSP ou protéines de stress ont été découvertes chez la drosophile par Ritossa en 1962. Hautement conservées entre les espèces, elles sont essentielles à l’homéostasie cellulaire et plus encore à la survie lors de stress d’origine diverse (chimique, physique, métabolique etc…). Actuellement, chez les mammifères, il existe cinq principales familles d'HSPs en fonction de leur poids moléculaires : HSP110, HSP90, HSP70 et HSP60 et les petites HSPs à laquelle appartient HSP27 (Kampinga et al., 2009). Parmi les HSPs, HSP70 est la plus fortement induite que ce soit par des agressions telles que le stress oxydatif, les agents anticancéreux ou les radiations ionisantes. HSP70 est, contrairement aux cellules « normales », fortement exprimée dans les cellules cancéreuses et confère à ces cellules une résistance aux drogues anticancéreuses (Goloudina, Demidov & Garrido, 2012) favorisant ainsi le développement tumoral. Les propriétés cyto-protectrices de HSP70 ont été jusqu’à présent attribuées par ces fonctions intracellulaires, principalement en inhibant le processus apoptotique à différentes étapes clés de la signalisation cellulaire (Ravagnan et al., 2001). Cependant une forme membranaire de HSP70 a été détectée à la surface des exosomes dérivant des cellules tumorales (Kuppner et al., 2001). HSP70 membranaire participerait au processus de tumorigenèse en inhibant l’activation des cellules myéloïdes suppressives (MDSCs) et en conséquence, la réponse immune anti-tumorale (Pfister et al., 2007; Schmitt, Gehrmann, Brunet, Multhoff, & Garrido, 2007). Par cette double facette, HSP70 représente donc une cible thérapeutique de choix pour la thérapie anticancéreuse. Compte tenu du rôle clé de HSP70, à la fois par ses fonctions intracellulaires et extracellulaires dans le développement tumoral, l’un des projets phare de notre groupe a été de développer des inhibiteurs spécifiques de HSP70, notamment des aptamères peptidiques et des peptides. Dans un premier travail, nous avons démontré in vitro que deux aptamères A8 et A17 (et son dérivé P17), interagissent avec HSP70 sur des domaines différents et sensibilisent les cellules cancéreuses à la mort induite par des agents chimiothérapeutiques. Des études in vivo réalisées chez la souris et le rat confirment ces résultats et mettent en évidence une réduction significative de la croissance tumorale par ces aptamères peptidiques. Dans un deuxième travail, nous avons généré un dérivé de l’aptamère A8, le peptide P8.1. Nous avons démontré que ce peptide est capable de neutraliser la forme membranaire de HSP70, présente à la surface des exosomes, bloquant ainsi l’activation des MDSCs et restaurant la réponse immunitaire anti-tumorale. A plus long terme, ce travail vise à mettre au point et à valider en clinique une thérapie anticancéreuse plus efficace, en associant aux traitements anticancéreux actuels, les inhibiteurs de HSP70. / Heat shock proteins (HSPs) were first discovered in Drosophila by Ritossa in 1962. As stress proteins, HSPs are induced in response to a wide variety of physiological and environmental insults. HSPs have a cyto-protective function and act as molecular chaperones by assisting the folding of nascent or misfolded proteins and by preventing their aggregation. Mammalian HSPs have been classified into 5 families according to their molecular weight: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60 and the family of small HSPs such as HSP27 (Kampinga et al., 2009). The most well-known inducible stress chaperone HSP70 is hardly detectable at basal level in normal “non-stressed” cells, but in cancer cells HSP70 is constitutively highly expressed. In that respect, this HSP play a key role in oncogenesis and in resistance to chemotherapeutic drugs (Goloudina et al., 2012).Until now, the cytoprotective properties of HSP70 were attributed to its intracellular functions mainly via its ability to block the apoptotic process at key points of the signal (Ravagnan et al., 2001). More recently, a membrane bound form of HSP70 was detected but also at the surface of exosomes derived from tumor cells but not non-cancerous cells (Kuppner et al., 2001). Moreover, growing evidence support the critical role of this membrane-bound HSP70 in the process of tumorigenesis (Pfister et al., 2007; Schmitt et al., 2007) via the activation of myeloid suppressor cells (MDSCs), which inhibit the anti-tumor immune response (Chalmin et al., 2010). Thereby, HSP70 by this dual action represents an attractive target for new anti-cancer therapy.In that aim, we developed specific inhibitors of HSP70, including peptide aptamers and peptides. In this work, we demonstrated that two aptamers A8, A17 (and the peptide P17), interact with different domains of HSP70 and, significantly sensitized cancer cells to apoptosis induced by chemotherapeutic drugs. Accordingly, in vivo studies in mice and rats showed a significant reduction of tumor growth by these inhibitors. Finally, we generate an A8 derived peptide called P8.1 that specifically neutralized the extracellular region of HSP70 at the surface of exosomes. Our results demonstrated that this peptide P8.1 inhibits MDSC activation and restored the antitumor immune response in vitro and in vivo, respectively.Overall, our work will help to develop and validate more effective cancer therapy based on the association of conventional chemotherapy with HSP70 inhibitors.

O exossomo é um complexo constituído por até 11 subunidades (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p, Mtr3p) que possui atividade exorribonucleolítica 3`→5` e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs na célula eucariótica. O complexo tem sido estudado em diversos organismos, como leveduras, insetos, plantas, humanos e também em várias espécies de archaea. Apesar da conservação da estrutura do exossomo ao longo da evolução e de oito subunidades do exossomo eucariótico apresentarem domínios de RNase, apenas duas proteínas, Rrp6p e Rrp44p têm atividade catalítica. A despeito da importância do exossomo para a célula, ainda não está claro o papel de cada subunidade na atividade do complexo. Neste trabalho foram utilizados mutantes da subunidade Rrp43p a fim de avaliar como mutações pontuais nesta subunidade afetam a montagem e estabilização do complexo do exossomo de Saccharomyces cerevisiae. Ensaios de purificação do exossomo com TAP-Rrp43p revelaram que os mutantes co-purificam Mtr3p e Rrp44p menos eficientemente. Além disso, os mutantes também apresentam atividade exorribonucleolítica 3`→5` reduzida, indicando que o defeito na montagem do complexo pode afetar a sua atividade enzimática. / The exosome is a protein complex comprised of up to eleven subunits (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p and Mtr3p) that has 3`→5` exoribonucleolytic activity and is involved in degradation and processing pathways of several kinds of RNA in eukaryotes. This complex has also been identified in several organisms, such as yeast, insects, plants, humans and also many species of archaea. Despite the overall structure conservation of the complex throughout evolution and eight of the eukaryotic exosome subunits displaying RNase domains, only two proteins, Rrp6p and Rrp44p have catalytic activity. Although the exosome has been shown to be involved in many different aspects of RNA metabolism, the role that each subunit plays in the activity of the complex has not yet been determined. In this work we used of TAP-purified exosome complexes to study the effect of Rrp43p mutations on the assembly and stabilization of the complex in Saccharomyces cerevisiae. Co-immunoprecipitation assays revealed that Rrp43p mutants co-purify Mtr3p and Rrp44p subunits less efficiently. Besides, Rrp43p mutants also present decreased activity, indicating that an assembly defect may affect its enzymatic activity

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23411号 / 医博第4756号 / 新制||医||1052(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 藤田 恭之, 教授 山下 潤 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21020号 / 医博第4366号 / 新制||医||1028(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 椛島 健治, 教授 三森 経世, 教授 小柳 義夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬科学) / 甲第21345号 / 薬科博第95号 / 新制||薬科||10(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬科学専攻 / (主査)教授 髙倉 喜信, 教授 小野 正博, 教授 山下 富義 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

Rationale: Heart failure is the one of the leading causes of death in the United States. Myocardial infarction (MI) is followed by cardiac remodeling involving extensive fibrosis and which can ultimately progress into heart failure. Previous studies have shown both that both post-MI and post-ischemia reperfusion (I/R), there is a reduction in scar size and improved cardiac function as a result of administration of cortical bone stem cell treatment. Objectives: We investigated the mechanism through which CBSC-derived exosomes altered wound healing and reduced scar formation through in vitro experimentation and in an in vivo post-I/R study in mice. The effects of CBSCs and CBSC-derived exosomes on cardiac fibroblasts was determined. The aim was to broaden our understanding of the mechanism by which CBSCs exert their anti-fibrotic effects. Methods and Results: We investigated the effects of mouse CBSCs (mCBSC), human CBSCs (hCBSC), mCBSC-derived exosomes and hCBSC-derived exosomes on murine embryonic fibroblast (MEF) migration. Treatment with both mouse and human CBSC-conditioned media (CBSC-CM) which contains exosomes caused a decrease in fibroblast migration. Exosome depletion from the CBSC-CM enhanced the reduction in fibroblast migration, implying exosome contents are involved in fibroblast migration. Treatment of fibroblasts with mCBSC-CM and mCBSC-derived exosomes showed a reduction in fibroblast-associated genes matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and Collagen 3A1 (Col3A1), as evidenced by qPCR analysis. Next, to examine if exosomes decrease fibrotic activation, adult rat ventricular fibroblasts (ARVFs) and adult human cardiac fibroblasts (NHCFs) were treated with TGFβ to activate fibrotic signaling before treatment with mCBSC- and hCBSC-derived exosomes. mCBSC-derived exosomes cause a 40% decrease in myofibroblast activation in ARVFs compared to TGFβ activated controls. hCBSC-derived exosomes caused a 100-fold decrease in human fibroblast activation, implying an even stronger intraspecies anti-fibrotic effect. To further understand the signaling mechanisms regulating the protective decrease in fibrosis, we performed RNA sequencing on the NHCFs after hCBSC-derived exosome treatment. The group treated with both TGFβ and exosomes showed a decrease in micro RNA (miRNA) and small nucleolar RNA (snoRNA), known to be involved with ribosome stability. A 24hr I/R study on 13wk old C57B/L6NJ mice showed that injection of mCBSCs and mCBSC-derived exosomes into the ischemic region of an infarct had a protective effect against I/R injury. Conclusions: In vitro findings show that wound healing induced by CBSC-derived exosome treatment involves the reduction of myofibroblast activation. RNA-Seq analysis identified that CBSC-derived exosomes inhibit with fibroblast activation by decreasing the expression of ribosome-stabilizing snoRNA, reducing protein translation and inflammatory signaling in activated cardiac fibroblasts, culminating in a decrease of myofibroblast activation. Additionally, in vivo, we found that mCBSC-derived exosomes recapitulate the effects of CBSC treatment, indicating exosomes are partly responsible for CBSC therapeutic effects in the post-I/R heart. Both mCBSCs and mCBSC-derived exosome treatment led to lower infarct size at 24 hours post-IR. / Organ Systems & Translational Medicine