We examined the extracellular vesicle (EV) and RNA composition of pooled normal cerebrospinal fluid (CSF) samples and CSF from five major neurological disorders: Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), low-grade glioma (LGG), glioblastoma multiforme (GBM), and subarachnoid haemorrhage (SAH), representing neurodegenerative disease, cancer, and severe acute brain injury. We evaluated: (I) size and quantity of EVs by nanoparticle tracking analysis (NTA) and vesicle flow cytometry (VFC), (II) RNA yield and purity using four RNA isolation kits, (III) replication of RNA yields within and between laboratories, and (IV) composition of total and EV RNAs by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNASeq). The CSF contained similar to 106 EVs/mu L by NTA and VFC. Brain tumour and SAH CSF contained more EVs and RNA relative to normal, AD, and PD. RT-qPCR and RNASeq identified disease-related populations of microRNAs and messenger RNAs (mRNAs) relative to normal CSF, in both total and EV fractions. This work presents relevant measures selected to inform the design of subsequent replicative CSF studies. The range of neurological diseases highlights variations in total and EV RNA content due to disease or collection site, revealing critical considerations guiding the selection of appropriate approaches and controls for CSF studies.

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.