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Thesis (Ph.D.) in Biochemistry and Molecular Biology--University of Maine, 2008. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 142-162).

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The prevalence of allergic diseases has dramatically increased over the last three decades. Presently, it is estimated that 20-30 per cent of the developed world suffers from allergic diseases. The majority of allergic diseases are rooted in the activities of IgE; an immunoglobulin which exerts its effector functions by interacting with a network of proteins. This network includes its low affinity receptor CD23. Cross linking of membrane IgE and CD21 by soluble CD23 results in an increase in IgE synthesis. This marks the interaction between CD23 and CD21 as an attractive therapeutic target. However, details regarding this interaction are inadequate for rational drug design. To obtain a deeper understanding of the CD23-CD21 interaction recombinant human CD21 (SCR1-2 and SCR5-8) and CD23 (16 kD and 25 kDa) were produced. The cloning, expression and purification of recombinant proteins comprised a significant portion of this study. Recombinant CD23 was expressed as inclusion bodies, refolded by rapid dilution and purified by size exclusion chromatography. Conversely, recombinant CD21 was expressed as soluble MBP-fusions and purified with an amylose affinity resin. The interaction between recombinant CD23 and CD21 was analysed by flow cytometry and ELISA experiments. Flow cytometry showed that 16 kDa and 25 kDa CD23 interacted with SCR5-8 to the same extent. Semi-quantitative ELISA experiments showed that both SCR1-2 and SCR5-8 were able to interact with 16 kDa and 25 kDa CD23. This suggests that the binding sites of SCR1-2 and SCR5-8 occur on 16 kDa CD23. Furthermore, since proteins were expressed in E. coli it suggests that the CD23-CD21 interaction does not require glycosylation. Furthermore, considering what is known about the SCR1-2-CD23 interaction from previous NMR studies; i.e. that the C-terminal tail (residues residues 289-298) of CD23 is responsible for binding SCR1-2, indicates that SCR5-8 binds somewhere within the lectin domain of CD23. This indicates that the CD23-CD21 interaction involves C-terminal tail-SCR1-2 and lectin domain-SCR5-8 interactions.

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Titre de l'écran-titre (visionné le 16 janvier 2024) / Les mégacaryocytes (MK), outre leur rôle de producteurs des plaquettes, sont des cellules de plus en plus étudiées pour leur contribution dans la réponse immunitaire. Les MK humains expriment plusieurs récepteurs immunitaires, dont celui de la région constante des immunoglobulines G (IgG), le FcγRIIA, et divers toll-like receptors (TLR) incluant TLR4, tous impliqués dans la réponse innée. Il est possible que les MK humains participent à l'inflammation via des interactions directes avec les récepteurs FcγRIIA et TLR, dont TLR4. Pour étudier l'implication des MK dans la réponse inflammatoire, des souris humanisées exprimant le récepteur FcγRIIA (FcγRIIA$^\textup{TGN}$) et des souris sauvages ont été utilisées. Une technique de culture et d'isolation des MK murins a été développée, permettant d'obtenir à partir de la moelle osseuse des MK matures et viables. Ces MK ont été soumis à des challenges immunitaires in vitro à l'aide de complexes immuns IgG, ou du ligand de TLR4, le lipopolysaccharide (LPS). La libération de cytokines inflammatoires a été mesurée par analyse ELISA et essai multiplex afin de dresser un profil cytokinique. Ces analyses ont révélé chez les MK FcγRIIA$^\textup{TGN}$ et sauvage en contact avec le LPS une augmentation de libération de plusieurs chimiokines inflammatoires impliquées dans le recrutement des neutrophiles. La mise en présence des MK de souris FcγRIIA$^\textup{TGN}$ avec les complexes immuns a conduit à une augmentation importante de libération de MIP (protéine inflammatoire macrophagique)-2, une chimiokine inflammatoire aussi impliquée dans l'activation des neutrophiles. De plus, dans ces mêmes conditions, une tendance à plus de libération de PF4 (cytokine platelet factor 4) a aussi été observée. En plus d'établir des conditions de culture et d'isolation des MK, les travaux ont permis d'étudier l'implication des récepteurs FcγRIIA et TLR4 dans la réponse inflammatoire médiée par les MK et leur libération de chimiokines qui sont également liées à l'activité des neutrophiles.

Thesis (M.S.)--University of Michigan, 1982.

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