Daktaro disertacijos „Nėštumo laukimo laiką prognozuojančių veiksnių tyrimas“ tikslas - įvertinti nėštumo laukimo laiko sąsajas su demografiniais, socialiniais, gyvensenos, darbo, aplinkos ir genetiniais veiksniais ir sudaryti prognostinius jų įtakos modelius. Tyrimo uždaviniai: 1.Įvertinti demografinių, socialinių, gyvensenos, darbo ir gyvena–mosios aplinkos veiksnių sąsajas su nėštumo laukimo laiku. 2.Sudaryti svarbiausių demografinių, socialinių, gyvensenos, darbo ir gyvenamosios aplinkos veiksnių, kurie nulemia 12 mėnesių ir ilgesnį nėštumo laukimo laiką, prognostinį įvertinimo modelį. 3.Įvertinti FSH receptoriaus geno polimorfizmo variantų įtaką nėš–tumo laukimo laikui. 4.Sudaryti FSH receptoriaus geno polimorfizmo įtakos svarbiausiems demografiniams, socialiniams, gyvensenos, darbo ir gyvenamosios aplinkos veiksniams, kurie nulemia 12 mėnesių ir ilgesnį nėštumo laukimo laiką, prognostinį modelį. Nustatėme, kad svarbiausi nepriklausomi 12 mėnesių ir ilgesnį nėštumo laukimo laiką nulemiantys prognostiniai veiksniai yra 30 metų ir vyresnis amžius, anksčiau gydyti vaisingumo sutrikimai, ginekologinės ligos, kontracepcijos priemonių naudojimas iki nėštumo planavimo pradžios ir FSH receptoriaus geno SER/SER variantas, kurie pastojimo po 12 ir daugiau mėnesių tikimybę didino, atitinkamai, 1,95, 1,57, 2,21, 1,87 ir 1,68 kartus. / “Study of time to pregnancy prognostic factors”. The aim of the study was to investigate the relation between various factors and female fecundity, which was expressed as time to pregnancy (TTP) and to create prognostic models. Tasks of the study were: 1.Estimate the relation between socioeconomic, demographic, life-style, environmental and job-related factors and time to pregnancy; 2.Create prognostic valuation model for the most important social, demographic, life-style, environmental and job-related factors what are associated with 12 month or longer time to pregnancy; 3.Estimate the impact of FSH receptor gene polymorphism variant on time to pregnancy; 4.Create prognostic model for the most important factors what are associated with 12 month or longer time to pregnancy under the influence of FSH receptor gene polymorphism. We established, that the most important independent risk factors prognoses time to pregnancy of 12 or more months in women analyzed for FSH receptor gene polymorphism group were older age, having gynecological diseases or fertility problems in the past, the use of contraception prior to conception and SER/SER polymorphism variant, what increased the probability of conceiving after 12 or more months 1.95, 1.57, 2.21, 1.87 and 1.68 times respectively.

SILVA, A.W.B. Efeito da Ativina-A e do Hormônio Folículo Estimulante (FSH) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos. 2012. 88 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-08-23T12:10:03Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_awbsilva.pdf: 1265381 bytes, checksum: a7525f915d1304e7cbab05e24fe3f5b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-25T14:57:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_awbsilva.pdf: 1265381 bytes, checksum: a7525f915d1304e7cbab05e24fe3f5b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-25T14:57:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_awbsilva.pdf: 1265381 bytes, checksum: a7525f915d1304e7cbab05e24fe3f5b4 (MD5) Previous issue date: 2012 / The aim of this study was to evaluate the effect of FSH alone or in combination with activin-A on survival, growth and expression of mRNA for ActR- IB, ActR- IIB, FSH-R, PCNA, and HAS1/2/3 in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Preantral follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of bovine ovaries and individually cultured in the absence (control medium) or presence of activin-A alone at concentrations of (100ng/mL); FSH alone in increased concentrations - 50ng/mL (from day 0 to day 6), 100ng/mL (from day 7 to day 12), and 200ng/mL (from day 13 to day 18) or in association with activin-A in the same concentrations. After 18 days in vitro, follicles cultured with FSH showed a significant increase in diameter compared to the other treatments. On the other hand, the activin-A alone did not increase follicular diameter compared to control medium. Moreover, when combined with FSH, activin-A inhibited the growth promoted by FSH. At the end of 18 days of culture, all treatments presented antrum formation but without difference between treatments. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of follicles cultured in FSH after 18 days. Follicles cultured in the presence of activin-A in association with FSH significantly reduced (P<0.05) levels of mRNA for ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R and PCNA. Moreover, in follicles cultured with FSH alone, levels of mRNA for HAS 1 and HAS 2 were significantly higher (P<0.05) that in follicles cultured with activin-A in association with FSH. In addition, the level of mRNA expression for HAS-3 did not differ (P> 0.05) between treatments. In conclusion, activin-A is important for early follicular development (up to 6 days), but reduces the stimulatory effect of FSH on bovine preantral follicles after 18 days of culture in vitro. Our results also indicate that FSH is a key factor for survival and growth of bovine preantral follicles cultured in vitro for a long period (18 days). Moreover, activin-A in combination with FSH reduce the levels of mRNA for activin receptor type IB (ActR-IB), type II-B (ActR-IIB), FSH-R and PCNA after 18 days in vitro. In addition, follicles cultured in medium supplemented with FSH alone levels of mRNA for HAS-1 and HAS-2 were higher than in follicles cultured in medium supplemented by the association of activin-A and FSH. / O objetivo deste estudo foi o de avaliar o efeito do FSH sozinho ou em combinação com a ativina-A na sobrevivência, crescimento e expressão de RNAm para ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R, PCNA e HAS1/2/3 em folículos secundários de bovinos cultivados in vitro por 18 dias. Folículos pré-antrais (~0,2mm) foram isolados do córtex de ovários bovinos e cultivados individualmente na ausência- α-MEM+ (grupo controle) ou na presença de ativina-A sozinha na concentração de (100ng/mL); FSH sozinho em concentrações seriadas - 50ng/mL (do dia 0 ao dia 6), 100 ng/mL (do dia 7 ao dia 12), e 200ng/mL (do dia 13 ao dia 18) ou em associação com a ativina-A nas mesmas concentrações. Após 18 dias de cultivo in vitro, folículos cultivados com FSH apresentaram aumento significativo no diâmetro em comparação aos demais tratamentos. Por outro lado, a ativina- A sozinha não induz o crescimento folicular comparado ao grupo controle. Além disso, quando combinada com FSH, a ativina-A inibiu o crescimento folicular promovido pelo FSH. Ao final de 18 dias de cultivo, todos os tratamentos apresentaram a formação de antro embora sem diferenças significativas entre os tratamentos. A análise ultra-estrutural confirmou a integridade dos folículos cultivados em FSH após 18 dias de cultivo. Folículos cultivados na presença de ativina-A associada ao FSH, reduziram significativamente (p <0,05) os níveis de RNAm para ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R e PCNA. Além disso, em folículos cultivados com FSH sozinho, os níveis de RNAm para HAS1 e HAS 2 foram significativamente maiores (p<0,05) que em folículos cultivados com ativina-A em associação ao FSH. Ademais, o nível de expressão do RNAm para HAS-3 não diferiu (p>0,05) entre os tratamentos. Em conclusão, a ativina-A é importante para o desenvolvimento folicular inicial (até 6 dias), mas reduz o efeito estimulatório do FSH em folículos pré-antrais bovinos após 18 dias de cultivo in vitro. Nossos resultados apontam que o FSH é um fator chave para a sobrevivência e crescimento de folículos pré-antrais cultivados in vitro por um longo período (18 dias). Além disso, ativina-A em associação ao FSH reduz os níveis de RNAm para o receptor de ativina do tipo IB (ActR-IB), tipo II-B (ActR-IIB), FSH-R e PCNA, após 18 dias in vitro. Em adição, folículos cultivados em meio suplementado com FSH sozinho, apresentaram níveis de expressão de RNAm para HAS-1 e HAS-2 maiores que em folículos cultivados em meio suplementado pela associação de ativina-A e FSH.

RIBEIRO, R.P. Efeito da lectina jacalina (artocarpus integrifolia) sobre a sobrevivência e ativação in vitro de folículos primordiais caprinos. 2013. 89 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T13:14:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-10-03T14:46:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-03T14:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 μg/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 μg/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 μg/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9. / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentrações de jacalina e da interação de jacalina e FSH sobre a sobrevivência, ativação e expressão gênica em folículos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do córtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com diferentes concentrações de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 μg/mL - experimento I), por um e seis dias. Após o término do período de cultivo, os fragmentos de córtex ovariano foram fixados para histologia clássica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folículos primordiais ou em desenvolvimento no controle não cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. Após a determinação da concentração de jacalina mais eficiente (50 μg/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de córtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 μg/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). Após 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clássica. Além disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressão de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folículos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que após seis dias de cultivo, a presença de 50 μg/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folículos morfologicamente normais, bem como uma redução da percentagem de folículos primordiais e aumento de folículos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativação dos folículos e contribuem para a manutenção da viabilidade, mas não foi observada uma interação positiva entres essas duas substâncias. A expressão de RNAm para a BMP-15 e KL após o cultivo in vitro de fragmentos de ovário nos diferentes tratamentos por 6 dias não foi alterada. No entanto, a presença de FSH aumentou os níveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressão reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusão, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 6 dias de cultivo. A presença de FSH aumentou a expressão do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presença da jacalina reduziu a expressão do GDF-9.

Orientador: Anthony César de Souza Castilho / Resumo: A superestimulação ovariana é uma das biotecnologias utilizadas com objetivo de aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas com alto valor econômico através da obtenção de múltiplas ovulações e tem sido amplamente empregada na espécie bovina. O conhecimento da dinâmica folicular permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos hormonais capazes de regular o desenvolvimento folicular, o momento e o número de ovulações produzidas. As duas gonadotrofinas mais utilizadas para induzir o crescimento de múltiplos folículos durante esses protocolos são o hormônio folículo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica equina (eCG); e ambos têm se mostrado eficazes. Sabe-se que a utilização da superestimulação ovariana utilizando FSH provoca mudanças positivas nos complexos cumulus-oócito (CCOs) e que a utilização do eCG no final do tratamento superestimulatório aumenta a resposta ovulatória, a ocorrência de estro, as concentrações de progesterona e as taxas de prenhes em programas de inseminação artificial (IA). Deste modo, o uso desses protocolos parece alterar o microambiente folicular e consequentemente a competência dos CCOs que se desenvolvem nele. Dentre os vários fatores presentes nesse microambiente estão as vesículas extracelulares (VEs; incluindo os exossomos), que carregam diversas moléculas como mRNA e microRNAs (miRNAs). Diante disso, o presente estudo visou avaliar o efeito da superestimulação ovariana com FSH ou FSH combinado a eCG, sobre a expressão gênica de embriões ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ovarian superestimulation is a biotecnology used to increase the reproductive potential of females with high economic value by obtaining multiple ovulations and has been widely used in cattle. The follicular dynamics knowledge allows the development of numerous hormonal protocols able to regulate follicular development, the moment and the number of ovulations produced. Two most used gonadotrophins to induce the growth of multiple follicles during these protocols are follicle stimulating hormone (FSH) and chorionic gonadotropin equine (eCG) and both have proven effective. It is known that the ovarian superstimulation using FSH causes positives changes in cumulus-oocyte complexes (COCs) and the use of eCG at the end of superstimulatory treatment increases the ovulatory response, the oestrus occurrence, progesterone concentrations and pregnancy rates in artificial insemination (AI). Thus, these protocols seems to alter the follicular microenvironment and therefore the competence of COCs that development it. Among the several factors presents in this microenvironment are the extracellular vesicles (EVs; including the exosomes), that carry different molecules such mRNA and microRNA (miRNAs). Therefore, this study aimed to assess the effects of ovarian superstimulation with FSH or FSH combined with eCG on embryo gene expression produced from COCs recovered from superstimulated cows. Additionally, it was checked if the exosomes presents in follicular fluid from these cows, when adde... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01352.pdf: 910573 bytes, checksum: def77bf1be41bca063446f544a989865 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo - IB/USP

Les β-arrestines jouent un rôle important dans la transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous montrons dans cette thèse que les β-arrestines exercent des régulations plus complexes et subtiles qu'on ne le pensait jusque-là sur la voie AMPc/PKA/CREB qui est activée par les RCPGs couplés à Gs. Nous montrons que les β-arrestines interagissent directement la PKAcat et contribuent à sa translocation nucléaire. De plus, nous mettons en évidence une interaction β-arrestine/CREB qui conduit à la formation d'un complexe transcriptionnellement actif sous l’action de l’agoniste. D’autre part, nous avons constaté que les β-arrestines interagissent directement avec PKAcat, p70S6K et Src via un même site et lesquelles sont donc potentiellement mutuellement exclusives. Nous avons ensuite mesuré l’impact d’une mutation et d’un polymorphisme du R-FSH sur la signalisation dépendante des β-arrestines, notamment grâce à l’utilisation de senseurs FRET et BRET. / Β-arrestins play an important role in G protein-coupled receptor (GPCR)-induced signal transduction. In this thesis, we show here that β-arrestins exert more complex and subtle regulation than previously thought on the cAMP/PKA/CREB pathway which is activated by Gs-coupled GPCRs. We demonstrate that β-arrestins directly interact with PKAcat and promote its translocation to the nucleus. Moreover, we provide evidence that β-arrestins directly interact with CREB thereby forming a transcriptionally active complex upon agonist stimulation. We also found that PKAcat, p70S6K and Src all directly interact with β-arrestins through the same interaction site and are therefore potential mutually exclusive interactions. We then measured the impact of a point mutation and of a polymorphism in the FSH-R on β-arrestin-dependent signaling, in part using FRET and BRET sensors.

Apesar do grande volume de pesquisas e dos avanços da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a eficiência da técnica ainda está distante do desejável, principalmente quando comparada a embriões produzidos in vivo. A maturação in vitro é etapa importante da PIV, visto que a qualidade dos embriões é dependente da qualidade do oócito e, assim, modificações nas condições de maturação in vitro podem trazer avanços à produção de embriões. A melatonina é um hormônio que foi detectado no fluido folicular de humanos, suínos e, mais recentemente, de bovinos. Ainda, seus receptores foram localizados em oócitos e células da granulosa. Estudos in vitro apontam efeitos benéficos de sua utilização na maturação e cultivo in vitro de oócitos e embriões, embora os resultados sejam por vezes contraditórios. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da melatonina na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e também seu potencial como indutor de genes de enzimas antioxidantes e inibidor de fragmentação nuclear em células do cumulus. Para tanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs), obtidos de ovários de abatedouro, foram maturados in vitro na presença de melatonina (10-9 e 10-6 M), FSH (controle positivo) ou sem hormônios (controle negativo). As taxas de maturação nuclear foram avaliadas às 6, 12, 18 e 24 horas de cultivo (Experimento 1). No Experimento 2, os mesmos grupos experimentais foram avaliados quanto à abundância relativa de transcritos de genes de enzimas antioxidantes (Cu,ZnSOD, MnSOD e GPx) em oócitos e células do cumulus (24 horas de MIV) por PCR em tempo real. No Experimento 3 foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a fragmentação nuclear em células do cumulus pela técnica de TUNEL e citometria de fluxo (24 horas de MIV). A taxa de maturação avaliada às 6 h de MIV foi de 100% de oócitos imaturos em vesícula germinativa (VG) (P&GT;0,05). Às 12 horas de cultivo foi observado o efeito da melatonina similar ao FSH, variando a proporção de oócitos em metáfase I (MI) de 54,0 a 80,7 % entre os grupos (P&LT;0,05). Após 18 h de MIV observou-se que a maioria dos oócitos já havia atingindo o estádio de metáfase II (MII) variando de 57,2 a 74,2 % (P&GT;0,05). Após 24 h de MIV, observou-se que a maioria dos oócitos atingiu o estádio de MII (50,7 a 89,5%), sendo que a melatonina na maior concentração apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&LT;0,05). Em relação à expressão de enzimas antioxidantes em oócitos não houve efeito de nenhum tratamento (P&GT;0,05%). Já em células do cumulus houve maior expressão do MnSOD no grupo com FSH em relação ao grupo maturado sem hormônios ou imaturo (P&LT;0,05). A melatonina nas diferentes concentrações apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&GT;0,05). Transcritos para a enzima Cu,ZnSOD foram mais abundantes em cumulus de CCOs maturados com a maior concentração de melatonina (10-6 M) em relação ao grupo imaturo (P&LT;0,05), não havendo variação nos demais (P&GT;0,05). GPX4 não foi afetado pelos tratamentos (P&GT;0,05). A quantidade de células do cumulus com fragmentação nuclear não foi afetada por nenhum tratamento (33,4 a 41,5/10.000 células; P&GT;0,05) Com base nestes resultados conclui-se que a melatonina nas concentrações avaliadas (10-9 e 10-6 M), embora seja capaz de estimular a maturação nuclear e induzir a expressão de alguns genes antioxidantes em células do bovinas, ainda que de forma semelhante ao FSH, não provocou redução da fragmentação nuclear nestas células. / Nevertheless the great volume of research and the advances in in vitro production (IVP) of bovine embryos, the efficiency of this techinque is still beyond the desireable, specially when compared to embryos produced in vivo. in vitro maturation (IVM) is an important step in IVP, since the quality of embryos is dependent on the quality of oocytes, and, therefore, modifications to in vitro maturation conditions can bring improvements to embryo production. Melatonin is a hormone which has been detected in the folicular fluid of humans, pigs, and more recently, in bovine. Also, its receptores have been identified in oocytes and granulosa cells. Studies in vitro have shown that melatonin may have beneficial effects when used in oocyte maturation and embryo culture, although results are sometimes contradictory. The aim of the present work was to assess the effect of melatonin during IVM on nuclear maturation of bovine oocytes as well as its potential to induce expression of antioxidant enzymes and to reduce nuclear fragmentation in cumulus cells. Cumulus-oocyte comprexes (COCs), obtained from abbattoir ovaries, were matured in vitro in the presence of melatonin (10-9 e 10-6 M), FSH (positive controle) or without hormones (negative control). Maturation rates were evaluated at 6, 12, 18 and 24 h (Experiment 1). In Experiment 2, the same groups were evaluated for the relative abundance of transcripts encoding antioxidant enzymes (Cu,ZnSOD, MnSOD and GPx) in oocytes and cumulus cells (24 h IVM) by real time PCR. In Experiment 3, the effect of treatments on nuclear fragmentation in cumulus cells was determined by TUNEL and flow cytometry (24 h IVM). At 6 h IVM, all oocytes were at immature germinal vesicle (GV) stage. After 12 h of cuture the effect of melatonin was similar to that of FSH, with proportions of oocytes in metaphase I (MI) varying from 54.0 to 80.7% between groups (P&GT;0.05). After 18 h IVM most oocytes had reached metaphase II (MII) stage (57.2 to 74.2%, P&GT;0.05). At 24 h IVM, oocytes were also mostly in MII stage (50.7 to 89.5%), and the highest melatonin concentration was similar to the gonadotrophin (P&GT;0.05). Regarding expression of antioxidant enzymes in oocytes there was no effect of treatments for any of the genes (P&GT;0.05). However, in cumulus cells MnSOD expression was higher in FSH compared with the groups matured without hormones or immature cells (P&LT;0.05). Melatonin in both concentrations were similar to FSH (P&GT;0.05). Transcripts for Cu,ZnSOD were more abundant in cumulus from COCs matured with the highest melatonin concentration (10-6 M) in relation to immature cells (P&LT;0.05), but was not diferent from other groups (P&GT;0.05). GPx was not affected by treatments (P&GT;0.05). The number of nuclear fragmentation in cumulus cells was also not affected by treatments (33.4 to 41.5/10,000 cells; P&GT;0.05). According to these results it is concluded that melatonin is able to induce meiosis resumption in oocytes (10-9 and 10-6 M) and expression of some antioxidant genes in bovine cumulus cells, similar to the effect of FSH, but was ineffective in reducing nuclear fragmentation in these cells.

O Pirarucu (Arapaima gigas) é um peixe gigante da família Arapaimidae, nativo das bacias amazônicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Está presente no Equador, na Colômbia, no Peru, na Bolívia e no Brasil. Atualmente a espécie está ameaçada de extinção devido à pesca predatória e ao aumento da presença humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTH&alpha;) e da subunidade &beta; do hormônio folículo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreensão da diversidade e evolução desta glicoproteína em peixes e a futura síntese biotecnológica deste hormônio para fins reprodutivos e alimentícios. Tanto o cDNA do ag-GTH&alpha; quanto aquele do ag-FSH&beta; foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das glândulas hipofisárias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTH&alpha; possui uma sequência codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma proteína de 115 aminoácidos com um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e com um peptídeo maduro de 91 aminoácidos. Dez resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de cinco pontes dissulfeto, dois sítios de N-glicosilação e três resíduos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras espécies de peixes. A comparação baseada em sequências de aminoácidos de GTH&alpha; de 38 espécies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a análoga sequência de GTH&alpha; de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSH&beta;, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma proteína de 126 aminoácidos com um peptídeo sinal de 18 e um peptídeo maduro de 108 aminoácidos. Quando comparado com as sequências de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o peptídeo maduro de ag-FSH&beta; mostrou conter 12 resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um sítio de glicosilação perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas construídas mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irmão dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os teleósteos aqui analisados. / Pirarucu (Arapaima gigas) is a giant fish of the Arapaimidae family native to the Amazon river basin, that can reach 3 meters in length, weighing up to 250 Kg. It is present in Equador, Colombia, Peru, Bolivia and Brazil. This species is in danger of disappearing due to exploitation by the fishing industry and increasing human presence in its natural habitat. In the present work the cDNAs of the gonadotropin -subunit (ag-GTH) and of follicle-stimulating hormone &beta; subunit (ag-FSH&beta;) were isolated and cloned for the first time. As a consequence, a better understanding of the diversity and evolution of this glycoprotein in fish and its future biotechnological synthesis for reproductive and alimentary purposes will be possible. Both cDNAs of ag-GTH&alpha; and ag-FSH&beta; have been synthesized via reverse transcriptase reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction (PCR) using as a template total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. Ag-GTH&alpha;- subunit has a coding sequence (open reading frame, ORF) of 348 bp, corresponding to a 115 amino acid protein, with a putative signal peptide of 24 aminoacids and a mature peptide of 91 amino acids. Ten cysteine residues, responsible for the formation of five disulfide linkages, two N-glycosylation sites and three proline residues were found highly conserved when compared to other fish species. A comparison based on the amino acid sequence of the GTH&alpha;- subunit from 38 different species of fish showed high identity of A. gigas with members of the following orders: Acipenseriformes, Siluriformes and Cypriniformes (87.1-89.5%), while the lowest identity was found with Gadiformes and Cyprinodontiformes (55%). In comparison with the analogous sequence of Homo sapiens an identity of 67% was found. For the ag-FSH&beta; subunit an ORF of 381 bp, coding for a 126 amino acid protein, with a signal peptide of 18 and a mature peptide of 108 amino acids, was found. When compared with the Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii and Homo sapiens, the mature peptide of ag-FSH&beta; showed the presence of the twelve cysteine residues responsible for the formation of six disulfide linkages, two proline residues and one glycosylation site, all of them perfectly conserved. The identity with the mentioned species were 63, 50 and 45% respectively. The obtained phylogenetic trees have shown, in general, that A. gigas of the order of Osteoglossiformes appears as sister group of Clupeocephala, while Elopomorpha (Anguilliformes) forms the most basal group of all analyzed teleosts.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi o de avaliar o efeito do FSH sozinho ou em combinaÃÃo com a ativina-A na sobrevivÃncia, crescimento e expressÃo de RNAm para ActR- IB, ActR-IIB, FSH-R, PCNA e HAS1/2/3 em folÃculos secundÃrios de bovinos cultivados in vitro por 18 dias. FolÃculos prÃ-antrais (~0,2mm) foram isolados do cÃrtex de ovÃrios bovinos e cultivados individualmente na ausÃncia- &#945;-MEM+ (grupo controle) ou na presenÃa de ativina-A sozinha na concentraÃÃo de (100ng/mL); FSH sozinho em concentraÃÃes seriadas - 50ng/mL (do dia 0 ao dia 6), 100 ng/mL (do dia 7 ao dia 12), e 200ng/mL (do dia 13 ao dia 18) ou em associaÃÃo com a ativina-A nas mesmas concentraÃÃes. ApÃs 18 dias de cultivo in vitro, folÃculos cultivados com FSH apresentaram aumento significativo no diÃmetro em comparaÃÃo aos demais tratamentos. Por outro lado, a ativina- A sozinha nÃo induz o crescimento folicular comparado ao grupo controle. AlÃm disso, quando combinada com FSH, a ativina-A inibiu o crescimento folicular promovido pelo FSH. Ao final de 18 dias de cultivo, todos os tratamentos apresentaram a formaÃÃo de antro embora sem diferenÃas significativas entre os tratamentos. A anÃlise ultra-estrutural confirmou a integridade dos folÃculos cultivados em FSH apÃs 18 dias de cultivo. FolÃculos cultivados na presenÃa de ativina-A associada ao FSH, reduziram significativamente (p <0,05) os nÃveis de RNAm para ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R e PCNA. AlÃm disso, em folÃculos cultivados com FSH sozinho, os nÃveis de RNAm para HAS1 e HAS 2 foram significativamente maiores (p<0,05) que em folÃculos cultivados com ativina-A em associaÃÃo ao FSH. Ademais, o nÃvel de expressÃo do RNAm para HAS-3 nÃo diferiu (p>0,05) entre os tratamentos. Em conclusÃo, a ativina-A à importante para o desenvolvimento folicular inicial (atà 6 dias), mas reduz o efeito estimulatÃrio do FSH em folÃculos prÃ-antrais bovinos apÃs 18 dias de cultivo in vitro. Nossos resultados apontam que o FSH à um fator chave para a sobrevivÃncia e crescimento de folÃculos prÃ-antrais cultivados in vitro por um longo perÃodo (18 dias). AlÃm disso, ativina-A em associaÃÃo ao FSH reduz os nÃveis de RNAm para o receptor de ativina do tipo IB (ActR-IB), tipo II-B (ActR-IIB), FSH-R e PCNA, apÃs 18 dias in vitro. Em adiÃÃo, folÃculos cultivados em meio suplementado com FSH sozinho, apresentaram nÃveis de expressÃo de RNAm para HAS-1 e HAS-2 maiores que em folÃculos cultivados em meio suplementado pela associaÃÃo de ativina-A e FSH. / The aim of this study was to evaluate the effect of FSH alone or in combination with activin-A on survival, growth and expression of mRNA for ActR- IB, ActR- IIB, FSH-R, PCNA, and HAS1/2/3 in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Preantral follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of bovine ovaries and individually cultured in the absence (control medium) or presence of activin-A alone at concentrations of (100ng/mL); FSH alone in increased concentrations - 50ng/mL (from day 0 to day 6), 100ng/mL (from day 7 to day 12), and 200ng/mL (from day 13 to day 18) or in association with activin-A in the same concentrations. After 18 days in vitro, follicles cultured with FSH showed a significant increase in diameter compared to the other treatments. On the other hand, the activin-A alone did not increase follicular diameter compared to control medium. Moreover, when combined with FSH, activin-A inhibited the growth promoted by FSH. At the end of 18 days of culture, all treatments presented antrum formation but without difference between treatments. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of follicles cultured in FSH after 18 days. Follicles cultured in the presence of activin-A in association with FSH significantly reduced (P<0.05) levels of mRNA for ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R and PCNA. Moreover, in follicles cultured with FSH alone, levels of mRNA for HAS 1 and HAS 2 were significantly higher (P<0.05) that in follicles cultured with activin-A in association with FSH. In addition, the level of mRNA expression for HAS-3 did not differ (P> 0.05) between treatments. In conclusion, activin-A is important for early follicular development (up to 6 days), but reduces the stimulatory effect of FSH on bovine preantral follicles after 18 days of culture in vitro. Our results also indicate that FSH is a key factor for survival and growth of bovine preantral follicles cultured in vitro for a long period (18 days). Moreover, activin-A in combination with FSH reduce the levels of mRNA for activin receptor type IB (ActR-IB), type II-B (ActR-IIB), FSH-R and PCNA after 18 days in vitro. In addition, follicles cultured in medium supplemented with FSH alone levels of mRNA for HAS-1 and HAS-2 were higher than in follicles cultured in medium supplemented by the association of activin-A and FSH.

Nos últimos anos, o emprego da aspiração folicular (OPU) e produção in vitro de embriões (PIVE) têm crescido mundialmente nos rebanhos bovinos. A OPU-PIVE viabiliza a rápida multiplicação do material genético, utilizando tanto a base genética da fêmea como do macho. No entanto, fêmeas de leite Bos taurus apresentam algumas peculiaridades, como menor população de folículos antrais e inferior qualidade oocitária, as quais foram apontadas como fatores responsáveis pela reduzida eficiência da técnica nesses rebanhos. Frente às dificuldades para o estabelecimento de programas de OPU-PIVE eficientes em vacas de leite Bos taurus, três experimentos foram conduzidos envolvendo diferentes tipos de tratamentos superestimulatórios em doadoras de oócitos lactantes e não lactantes. O primeiro estudo teve como objetivo aumentar a PIVE em doadoras da raça Holandesa lactantes e não lactantes submetidas ao tratamento tradicional de superstimulação com doses decrescentes de FSH porcino (FSHp) a cada 12 h, previamente à OPU. Nesse estudo, as doadoras (n = 15 vacas lactantes e n = 15 não lactantes da raça Holandesa) receberam protocolo para sincronização da emergência da onda folicular [protocolo a base de benzoato de estradiol (BE) e progesterona (P4)] e foram submetidas aos tratamentos de superestimulação em um delineamento experimental cross-over. Os outros dois estudos (n = 23 novilhas da raça Holandesa e n = 72 vacas não lactantes da raça Holandesa) foram desenvolvidos para avaliar diferentes diluentes para o FSHp com o objetivo de viabilizar a superestimulação com apenas uma aplicação de FSHp. No geral, os estudos avaliaram o efeito da superestimulação no perfil plasmático de FSH, na proporção de folículos classificados como pequenos (<6mm), médios (6-10mm) ou grandes (>10mm), conforme diâmetro folicular, na PIVE e no estabelecimento gestacional após transferência de embriões. A superestimulação aumentou a proporção de folículos médios, aumentou a competência oocitária e resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU. A aplicação única de FSHp associado ao diluente de liberação lenta (ácido hialurônico), resultou em semelhante área sob a curva de FSH, semelhante proporção de folículos pequenos, médios e grandes e semelhante PIVE comparado ao tratamento superestimulatório tradicional com doses de FSHp administradas a cada 12h. Independentemente do diluente e da dose de FSHp utilizada, o tratamento superestimulatório resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU comparado às vacas não tratadas com FSHp. Adicionalmente, semelhante taxa de estabelecimento gestacional foi observada, independentemente do tratamento utilizado na doadora. Portanto, os dados obtidos no presente estudo permitem concluir que independentemente do tipo de tratamento (diluente para FSHp ou dose utilizada de FSHp), a superestimulação previamente ao processo de OPU, aumentou o desenvolvimento de embriões in vitro, número de blastocistos por sessão de OPU e resultando em semelhante taxa de estabelecimento gestacional após transferência de embriões. / In the last years, the use of ovum pick-up (OPU) and in vitro produced embryo (IVEP) technology has worldwide increased in cattle herds. The OPU-IVEP enable a rapid individual multiplication based on the female and male donor genetic. However, Bos taurus dairy females present some peculiarities, as reduced antral follicle population and lower oocyte quality, and these factors have been awarded as responsible to the reduced technique efficiency among these herds. Given the difficulties of establishing OPU-IVEP programs with high efficiency in Bos taurus dairy cows, three studies were carried out, involving different types of superstimulation treatments in lactating and non-lactating Holstein donors. The first study aimed to increase IVEP in lactating and non-lactating Holstein dairy donors submitted to the traditional twice-daily porcine FSH (pFSH) superstimulation treatment prior to the OPU. For this purpose, donors (n = 15 lactating and n = 15 non-lactating Holstein cows) received the follicular wave synchronization protocol [estradiol benzoate (EB) and progesterone (P4) based protocol] and were submitted to superstimulation treatment in a cross-over design. Other two experiments were performed (n = 23 Holstein heifers and n = 72 non-lactating Holstein cows) to evaluate different pFSH diluents to enable superstimulation with a single injection. In general, these studies evaluated the effect of superstimulation on the plasmatic FSH profile, proportion of follicles sizes previous to OPU (small: <6mm; medium: 6-10mm; and large follicles: >10mm), on in vitro embryo production and pregnancy establishment after the produced embryo transfer. The superstimulation treatment improved the proportion of medium sized-follicles, improved oocyte competence and resulted in greater amount of blastocyst per OPU session. A single injection of pFSH combined with a slow release carrier (hyaluronan), resulted in similar FSH area under curve, proportion of follicles sizes previous to OPU and in vitro embryo production compared to the twice-daily superstimulating treatment. Regardless pFSH diluent and dose, superstimulating hormone resulted in greater number of blastocysts per OPU session compared to the non-pFSH treated donors. Additionally, similar pregnancy establishment was observed, regardless embryo donor treatment. Therefore, with the present data, we can conclude that regardless treatment type (pFSH diluent or dose), the superstimulation procedure prior to the OPU, enhanced in vitro embryo development, increased the number of blastocyst per OPU session and resulted in similar pregnancy establishment after embryo transfer.