Memoria para optar al título de Bioquímico / El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una neurotrofina, que inicialmente fue descrita en el cerebro, y que en los últimos años ha adquirido importancia, debido a que actúa en sitios no-neuronales, entre ellos el ovario, donde se ha encontrado que NGF participa en el desarrollo ovárico, proliferación y diferenciación de células somáticas y en la esteroidogénesis. Una de las etapas importantes que ocurren durante el desarrollo folicular y del cuerpo lúteo es la angiogénesis, una de las moléculas importantes en este proceso es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). NGF aumenta la expresión de VEGF en diversos tipos celulares. VEGF es regulado en forma directa por el gen inducible por hipoxia (HIF-1) y en forma indirecta por c-Myc. Además c-Myc, es un gen involucrado en la proliferación celular. En este trabajo se investigó el rol que cumple NGF en la regulación de VEGF y la proliferación celular. Para este fin se utilizaron células de granulosa humana, provenientes de pacientes del programa de fertilización asistida, las cuales se cultivaron por 2, 4, 8 y 18 horas con NGF (50 ng/ml). Se midieron los niveles del ARNm de VEGF, c-Myc e HIF-1 alfa por RT-PCR. En este trabajo el ARNm de las isoformas de VEGF 165 y 121 aumentaron a las 4 y 8 horas respectivamente, los niveles del ARNm de HIF-1 alfa se mantuvieron inalterados a todos los tiempos estudiados. Los niveles de ARNm de c-Myc aumentaron a las 8 y 18 horas por efecto de NGF. Por Inmunocitoquímica se determinó Ki67, un marcador de proliferación celular. La proteína Ki67 aumentó a las 8 y 18 horas por efecto de NGF, concordando con la expresión génica de c-Myc. Los resultados indican que NGF presenta la capacidad de aumentar, tanto la expresión del ARNm de VEGF, como la proliferación en forma independiente, y que este aumento en la proliferación sería en una etapa posterior al alza de VEGF y que probablemente el VEGF expresado en las células de granulosa humana en cultivo, éste involucrado en la proliferación directamente, esto podría suponer que una falla en la producción de NGF por parte del folículo podría llevar a éste a un crecimiento y maduración deficiente, debido a que no ocurriría una angiogénesis y proliferación adecuada / The nerve growth factor (NGF) is a neurothrophin, initially described in the brain, that has acquired importance in the last few years, because it has several functions in non-neuronal tissues. One of these tissues is the ovary, where NGF participates in the ovarian development, proliferation and differentiation of somatic cells and steroidogenesis. Angiogenesis is an essential stage during follicular and luteal development, and one of the most important molecules in this process is the vascular endothelial growth factor (VEGF). NGF increases VEGF expression in different cell types. VEGF is directly regulated by hypoxia inducible factor-1(HIF-1) and indirectly by c-Myc. c-Myc is also a gene involved in cell proliferation. This work investigated the role of NGF in regulating VEGF and cell proliferation. To this aim, granulosa cells obtained from patients undergoing in vitro fertilization were cultured for 2, 4, 8 and 18 hours with NGF (50 ng/ml). The levels of VEGF, c-Myc and HIF-1alpha mRNA were evaluated by RT-PCR. mRNA for VEGF 165 and VEGF 121 isoforms increase at 4 and 8 hours respectively. HIF-1alpha mRNA levels did not change at any time. NGF (50ng/ml) induces c-Myc mRNA increase at 8 and 18 hours. Ki67 protein, a cell proliferation marker, was determined by immunocytochemistry. Ki67 protein increases at 8 and 18 hours with NGF stimulation, and no change was observed at 4 hours, agreeing with the genic expression of c- Myc. The results indicate that NGF is able to increase VEGF mRNA expression and cell proliferation by independent ways, and that the increase in the proliferation would be a later stage to VEGF's rise. It is probable that the VEGF expressed in cultured human granulosa cells acts directly on cell proliferation, suggesting that fails in follicular NGF production might induce a deficient follicular growth and maturation, due to impairment in angiogenesis and cell proliferation

La formación de vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes, o angiogénesis, es un proceso esencial en el desarrollo del tejido normal. La mayor parte de la angiogénesis fisiológica ocurre en la etapa embrionaria, y en el adulto, el endotelio vascular es un tejido con un bajo índice de proliferación. Sin embargo, los ovarios presentan cíclicamente procesos asociados a angiogénesis. En el ovario, la angiogénesis acompaña al desarrollo folicular y a la formación del cuerpo lúteo, y de no existir concepción, esta red vascular involuciona. La extraordinaria rapidez con que los vasos sanguíneos aparecen y son reabsorbidos en cada ciclo ovárico, hace de este sistema un modelo ideal para el estudio de los elementos regulatorios de la angiogénesis, por lo que su mejor comprensión podría significar un gran avance para la investigación de la angiogénesis en eventos fisiológicos y patológicos. Distintos elementos regulan la angiogénesis en el ovario y otros tejidos. Entre ellos, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF[beta]) han sido asociados a eventos importantes en la angiogénesis ovárica fisiológica y patológica. El factor de crecimiento nervioso (NGF) también se ha relacionado con angiogénesis en otros tejidos, como el ganglio cervical superior en ratas neonatas. Además este factor gatilla la proliferación de células endoteliales humanas. NGF, a través de sus receptores trkA y p75, ejerce acciones esenciales tanto en el desarrollo ovárico como en la función del ovario. De hecho, NGF está presente en el ovario humano desde la etapa fetal. Sin embargo, se desconoce si NGF participa en la angiogénesis ovárica. Por otra parte, NGF modula la expresión de TGF[beta]1 y VEGF en distintos tipos celulares, pero tampoco se sabe si en el ovario dicha expresión es regulada por esta neurotrofina. En esta Tesis se propuso estudiar la participación de NGF como factor angiogénico en el ovario, y su acción en los niveles de proteína y mRNA de los factores VEGF y TGF[beta]1. Para cumplir con este objetivo, se trabajó con ovarios de ratas neonatas cultivados con NGF, ovarios de ratones neonatos NGF-deficientes (NGF KO), ratas prepúberes con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y ratones transgénicos prepúberes que sobreexpresan NGF en el ovario. Se analizaron los niveles de mRNA y/o proteína de VEGF y TGF[beta]1 en los ovarios de estos animales. También se cultivaron células de granulosa humana y se estimularon con NGF, para luego determinar los contenidos de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 y los niveles de proteína secretada en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos en ovario de roedores y en el cultivo de células de granulosa indican que NGF incrementa tanto el mRNA como la proteína de VEGF. Los niveles de TGF[beta]1 no se modificaron por NGF en los modelos estudiados. Con el objetivo de conocer el mecanismo mediante el cual NGF induce los cambios observados en el ovario, se estudió la participación de trkA, el receptor de alta afinidad para NGF. Se analizaron ovarios de ratones neonatos trkA-deficientes (trkA KO). Se determinó que en estos animales el contenido de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 es similar al encontrado en ratones silvestres, probablemente por un sistema de compensación que involucra el aumento de la expresión p75, el receptor de baja afinidad para NGF. También se analizó el efecto de K252a, inhibidor del receptor trkA, en células de granulosa humana tratadas con NGF. La preincubación con el inhibidor revirtió en forma significativa el aumento de mRNA y proteína de VEGF inducido por NGF. A continuación, se quiso saber si NGF inducía la activación de MAPK asociadas a la fosforilación del receptor trkA en el ovario, y si la producción del mensajero o proteína de VEGF y TGF[beta]1 dependía de esta vía de señalización. Para estudiar esto se utilizó el modelo de células de granulosa humana en cultivo. Análisis de western blot mostraron que hubo un incremento significativo en la proporción de proteínas ERK 2 fosforiladas respecto de ERK 2 totales, luego de 5 minutos de estimulación con NGF. Además, el incremento en la expresión de mRNA y proteína de VEGF fue prevenido por la incubación previa con U0126, un inhibidor de la proteína MEK, responsable de la fosforilación de ERK 1/2. El factor de transcripción HIF1 es uno de los responsables de la activación transcripcional de VEGF como respuesta a la hipoxia, pero también frente al estímulo con factores de crecimiento. No se produjo un cambio en el contenido de mRNA de la isoforma inducible de HIF1, HIF1[alfa] en células de granulosa humana estimuladas con NGF 50 ng/ml por 8 horas. Sin embargo, en ovario de rata neonata en cultivo, el contenido de mRNA de HIF1[alfa] aumenta en los tejidos estimulados con NGF por 2 horas. Finalmente, se quiso verificar si existían acciones indirectas de NGF sobre la proliferación de células endoteliales, a través del aumento en los niveles de VEGF. Para esto se realizó un ensayo de angiogénesis in vitro, en el cual el medio condicionado de células de granulosa tratadas con NGF se utilizó para estimular células endoteliales provenientes de cordón umbilical humano (células HUVEC). El medio condicionado no indujo mayor proliferación de células endoteliales, probablemente debido a que la concentración de VEGF en éste era muy baja para estimular la proliferación en las células HUVEC. Sin embargo, es muy importante destacar que estudios in vivo realizados en ratas con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y en ratones transgénicos que sobreexpresan NGF en el ovario, demostraron que esta neurotrofina es capaz de incrementar la vascularización en ovario de roedores prepúberes. Los resultados aquí reportados no permiten establecer si el efecto de NGF sobre la vascularización ovárica es una consecuencia del aumento de VEGF. La señalización de NGF es esencial para la ovulación. Por otra parte, se produce un marcado aumento de la expresión ovárica de VEGF en la etapa periovulatoria. Los resultados presentados indican que NGF es capaz de aumentar la expresión de VEGF y la vascularización ovárica. De acuerdo con lo anterior, existiría una asociación entre el alza periovulatoria de NGF, y el aumento de VEGF y de los capilares ováricos. Esto podría tener importantes aplicaciones en el área de la medicina reproductiva y las terapias contra el cáncer, ya que amplía la información acerca de los elementos reguladores de la angiogénesis en el ovario.

El Factor de Crecimiento Epidermal(FCE) encargado de estimular los procesos de división, migración y diferenciación de las células epiteliales. El tabaquismo principal factor de riesgo asociado a la formación de lesiones cancerígenas en boca, vías respiratorias, pulmón etc. El presente estudio se encargó de determinar la relación entre Tabaquismo y la Concentración del Factor de Crecimiento Epidermal en saliva, para lo cual se recolectó muestras de saliva total no estimulada y se evaluó los niveles de concentración del FCE mediante el inmunoensayo de ELISA de 40 pacientes no fumadores como grupo control y 39 pacientes fumadores como grupo de estudio, estos últimos divididos en subgrupos de fumadores leves(19), fumadores moderados(10) y fumadores severos(10) que acudieron al Servicio de Diagnóstico de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se encontró que a mayor grado de tabaquismo los niveles de concentración de FCE eran más elevados encontrándose una diferencia estadísticamente significativa entre pacientes no fumadores, fumadores leves, fumadores moderados y fumadores severos(p=0.000). También se encontró que no hay relación del FCE con respecto a la edad, ni al género. / Tesis

Memoria para optar el título de Bioquímico / El cese de la función ovárica está dado principalmente por la pérdida del número de folículos primordiales. Durante el envejecimiento, existe un decrecimiento en el número de folículos ováricos. En mujeres se ha establecido el periodo de subfertilidad después de los 37 años, cuando quedan menos de 100.000 folículos. En roedores, este período es caracterizado por disminución de la ciclicidad estral, del número de partos y de crías nacidas vivas por cada hembra. En este trabajo, se determinó el período de subfertilidad y el término del período reproductivo en ratas Sprague Dawley (SD). Desde los 8 meses se observaron cambios importantes en ratas, como disminución de estradiol y androstenediona, variación en los niveles de progesterona, aumento de la Noradrenalina (NA) ovárica y adrenal, además, de la disminución de la ciclicidad estral y fertilidad. El contenido intraovárico del factor de crecimiento nervioso (NGF), no cambia durante el período de subfertilidad. Sin embargo, aumenta significativamente a los 16 meses de edad, cuando la rata es infértil. Estos resultados permiten establecer el período de subfertilidad de la rata entre los 8 a 10 meses de edad. Después de esta caracterización se usaron ratas en el período de subfertilidad, para determinar si NGF y su receptor de baja afinidad p75NTR, son parte de un posible mecanismo que participa en este período. Para ello se administró localmente en el ovario una minibomba osmótica que infundió una mezcla de anticuerpo anti NGF con oligonucleótido antisentido contra mRNA de p75NTR . Después de 28 días de perfusión continua, se observó una sobreproducción de NGF intraovárico, el que posiblemente junto con el bloqueo de la traducción de p75NTR provocó: un aumento de androstenediona en plasma, pérdida de la ciclicidad estral, disminución del contenido de NA en médula adrenal, ganglio celíaco y ovario, encontrado al final del período observado. Además, hubo un aumento en el número de folículos saludables antrales y preantrales, y un aumento de estructuras quísticas, folículos tipo III y folículos luteinizados. La administración de la minibomba osmótica con anticuerpo contra NGF y el oligonucleótido antisentido tuvo un mayor efecto en los ovarios de rata de 8 meses que en los de 10 meses de edad y afecta a los dos ovarios por igual, tanto al que está conectado con la minibomba como al ovario contralateral. Los cambios morfológicos observados en ovario de rata de 8 meses de edad sugieren que un incremento en la actividad nerviosa simpática adelanta el envejecimiento reproductivo ovárico, proceso regulado por control neurotrófico intraovárico. / The cessation of reproductive function is mostly due to lost of primordial follicles pool. During aging, there is a decreased in the number of ovarian follicles. In women, the subfertility period was found from 37 years, when the number of follicles are smaller than 100.000. In rodents, this period is characterized for the lost of estrual cycling activity, decrease in the number of pups and deliveries by the female. In the present work, we determined the period of subfertility and the end of the reproductive period in Sprague Dawley (SD) rats. Since 8 month old we found important neuroendocrine changes in rats a such as decrease of estradiol and androstenedione, changes in progesterone, increase in ovarian and adrenal noradrenaline (NA). In addition, there was a decrease of estrual cyclicity and fertility. There were not changes in the nerve growth factor (NGF) at period of subfertility, but NGF was increased at 16 months, when the rat is infertile. Altogether these dates permitted us to define the period of subfertility betwen 8 to 10 months for the Sprague Dawley rat. After this characterization we used rats during the period of subfertility, to determine if NGF and its low affinity p75NTR receptor were involved in the possible mechanisms resulting in the end of ovary function. For that, we used Alzet osmotic minipumps to infuse one rat ovary with a mix of neutralizing antiserum to NGF in conjunction with an antisense oligodeoxynucleotide to mRNA p75 NGFR . After 28 days of continuous perfusion, we observed an overproduction of ovarian protein NGF, which together with the blockade of translation of p75NTR, could be the responsible of the: increase in serum androstenedione, lost of the cyclicity, decrease of NA content from the adrenal medulla, celiac ganglion and ovary, found at the end of observation. In addition, there was an increase in the number of antral and preantral healthy follicles and an increase in cystic structures; follicles type III and luteinizing follicles. The effect of the neutralizing antiserum to NGF with the antisense oligodeoxynucleotide to p75NTR was stronger in the ovary of rats of 8 month old than that in the ovary of rats of 10 month old. In both cases, the effect was the same for contralateral ovary (without miniosmotic pump). The morphological changes found in the ovary of rats of 8 month old suggest that an increasing sympathetic nerve activity accelerated ovarian reproductive aging in a process regulated by intraovarian neurotrophic control

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es el cáncer ovárico más común, siendo en Chile la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Un aspecto importante para la mantención y progresión tumoral es el establecimiento de nueva vasculatura. En COE, NGF y su receptor TRKA son mediadores directos de angiogénesis in vitro, e indirectos al inducir la expresión y secreción de VEGF. El factor transcripcional RUNX2 induce procesos oncogénicos como proliferación, migración e invasión celular. Adicionalmente, se cree que RUNX2 puede ser un mediador de angiogénesis tumoral, ya que en varios modelos de cáncer promueve la expresión de VEGF y sus niveles proteicos se incrementan en hipoxia. En COE, RUNX2 los niveles se relacionan con mal pronóstico y en modelos in vitro promueve proliferación, migración e invasión en células de cáncer ovárico, sin embargo, no existen estudios que busquen vincularlo con angiogénesis en este cáncer. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial se produce un aumento en los niveles de RUNX2, y en la línea celular A2780 de cáncer ovárico sus niveles son incrementados por los factores proangiogénicos NGF e hipoxia cuando se comparan con la línea celular HOSE de epitelio superficial ovárico normal. Objetivos: Establecer si RUNX2 se expresa en cáncer ovárico epitelial, si sus niveles se incrementan con la progresión de la transformación maligna del epitelio ovárico, y determinar si en el modelo de líneas celulares, RUNX2 es aumentado por las condiciones proangiogénicas de hipoxia y estímulo con NGF. Metodología: Se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en tejidos ováricos (OVI, ovario normal inactivo; TBE-TBO, tumores ováricos Benignos y Borderline; y COE) mediante Western Blot, y a través de inmunohistoquímica se determinó el % células positivas con RUNX2 nuclear. En las líneas celulares HOSE y A2780 se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en extractos totales y en fracciones subcelulares mediante Western Blot, y su localización subcelular mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizaron estímulos con NGF, CoCl2 y ensayos de hipoxia en ambas líneas celulares, para posteriormente determinar los niveles proteicos de RUNX2 y HIF-1α por Western Blot. Resultados: Se determinó que los tejidos ováricos correspondientes a TBE-TBO y COE presentaron un mayor porcentaje de células positivas para RUNX2 nuclear respecto a lo observado en OVI. Por otro lado, ambas líneas celulares, HOSE y A2780, presentaron RUNX2 con localización principalmente nuclear, mostrando la línea HOSE niveles más altos respecto a la línea A2780. Los estímulos con NGF y CoCl2 no modificaron los niveles proteicos de RUNX2 en las líneas celulares en las condiciones analizadas. Por otra parte, se determinó que en la línea celular HOSE los niveles de RUNX2 disminuyen durante hipoxia, manteniéndose constantes los de HIF-1α. En el caso de las células A2780, no se observaron cambios en los niveles de las proteínas RUNX2 y HIF-1α en condiciones de hipoxia. Conclusiones: El presente trabajo permite concluir que los tejidos transformados de epitelio ovárico poseen un alto porcentaje de células con RUNX2 nuclear. Consistente con esto, la línea celular A2780 presenta altos niveles de RUNX2 en el núcleo, sugiriendo estos antecedentes un rol de RUNX2 en COE. Por otro lado, en las condiciones evaluadas, NGF e hipoxia no produjeron cambios en los niveles de RUNX2 en las líneas celulares. Proyección: Es necesario realizar nuevos ensayos para determinar con certeza si las condiciones proangiogénicas de NGF e hipoxia pueden inducir angiogénesis a través de RUNX2 en COE. En el caso de NGF es necesario evaluar si este puede influenciar la actividad transcripcional de RUNX2, y en el caso de hipoxia, se requiere modificar las condiciones experimentales para determinar con mayor seguridad si la restricción de oxígeno afecta los niveles de RUNX2 / Epithelial ovarian cancer (COE) is the most common ovarian cancer, being Chile the second cause of death due to gynecological neoplasias. An important aspect for tumor maintenance and progression is the establishment of new vasculature. In COE, NGF and its TRKA receptor are direct mediators of in vitro angiogenesis, and indirectly by inducing VEGF expression and secretion. RUNX2 transcriptional factor induces oncogenic processes such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, it is believed that RUNX2 may be a mediator of tumor angiogenesis, since in several cancer models it promotes the expression of VEGF and its protein levels increase in hypoxia. In COE, RUNX2 levels are related to poor prognosis and in vitro models promote proliferation, migration and invasion in ovarian cancer cells, however, there are no studies that seek to link it with angiogenesis in this cancer. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer there is an increase in RUNX2 levels, and in the A2780 cell line of ovarian cancer their levels are increased by the proangiogenic factors NGF and hypoxia when compared to the HOSE cell line of normal ovarian surface epithelium. Objective: To establish whether RUNX2 is expressed in epithelial ovarian cancer, if its levels increase with the progression of malignant transformation of ovarian epithelium, and to determine if RUNX2 is increased in the cell lines model by the proangiogenic conditions of hypoxia and stimulation with NGF. Methods: RUNX2 protein levels in ovarian tissues (OVI, normal ovary, TBE-TBO, Benign ovarian tumors and Borderline, and COE) were evaluated by Western Blot, and by means of immunohistochemistry the percentage of RUNX2 nuclear positive cells was determined. In the HOSE and A2780 cell lines the protein levels of RUNX2 in total extracts and subcellular fractions were evaluated by Western Blot, and its subcellular localization by immunocytochemistry. Additionally, stimuli were performed with NGF, CoCl2 and hypoxia assays in both cell lines, to later determine the protein levels of RUNX2 and HIF-1α by Western Blot. Results: It was determined that the ovarian tissues corresponding to TBE-TBO and COE presented a higher percentage of RUNX2 nuclear positive cells than observed in OVI. On the other hand, both cell lines, HOSE and A2780, presented RUNX2 with mainly nuclear localization, showing the line HOSE levels higher than the line A2780. The stimuli with NGF and CoCl2 did not modify the protein levels of RUNX2 in the cell lines in the conditions analyzed. On the other hand, it was determined that in the HOSE cell line the levels of RUNX2 decrease during hypoxia, keeping those of HIF-1α constant. In the case of A2780 cells, no changes were observed in the levels of the RUNX2 and HIF-1α proteins under conditions of hypoxia. Conclusions: The present work concludes that the transformed tissues of ovarian epithelium possess a high percentage of cells with nuclear RUNX2. Consistent with this, the A2780 cell line presents high levels of RUNX2 in the nucleus, suggesting this background a RUNX2 role in COE. On the other hand, under the conditions evaluated, NGF and hypoxia did not produce changes in the RUNX2 levels in the cell lines. Projection: Further testing is required to determine with certainty whether the proangiogenic conditions of NGF and hypoxia may induce angiogenesis tHRPough RUNX2 in COE. In the case of NGF it is necessary to evaluate if this can influence the transcriptional activity of RUNX2, and in the case of hypoxia, it is necessary to modify the experimental conditions to determine more safely if the oxygen restriction affects RUNX2 levels / Fondecyt

Memoria para optar el título de Bioquímico / La plasticidad homeostática mantiene la actividad sináptica y neuronal en rangos fisiológicos. En cultivos neuronales primarios, estos cambios compensatorios se inducen por perturbaciones prolongadas (48 horas) de la actividad neuronal utilizando fármacos. Así, al incubar cultivos con Bicuculina, un inhibidor de la neurotransmisión inhibidora (GABAérgica), aumenta la actividad neuronal. Los cambios compensatorios incluyen inhibición de la neurotransmisión excitadora, que está mediada por el neurotransmisor L-glutamato. En las sinapsis glutamatérgicas, los receptores post-sinápticos son principalmente canales iónicos que conducen cationes y existen subtipos de ellos basados en su perfil farmacológico diferencial. Así, el receptor tipo NMDA conduce sodio, potasio y calcio. Se ha propuesto que este receptor puede ser inhibido de manera homeostática por óxido nítrico (NO) frente a períodos de actividad aumentada, induciendo neuroprotección. NO modifica la actividad del receptor NMDA a través de S-nitrosilación de residuos de cisteína relevantes. Sin embargo, también se ha reportado que NO es tóxico. En el hipocampo, la sobre-estimulación del receptor NMDA activa a la óxido nítrico sintasa, que es calcio-dependiente, síntesis de NO y muerte neuronal por excitotoxicidad. También se sabe que diversas zonas cerebrales son diferencialmente sensibles a la excitotoxicidad, siendo el hipocampo una de las zonas más vulnerables. Para dilucidar los efectos controversiales del NO en nuestro laboratorio se realizaron ensayos de viabilidad celular en cultivos primarios de neuronas incubados con NMDA. Se usaron tanto cultivos primarios hipocampales como corticales, en los cuales se indujeron aumentos de actividad prolongadas por incubaciones por 48 horas con bicuculina. Después de un insulto excitotóxico con NMDA, se encontró que las neuronas corticales son más resistentes al daño excitotóxico comparado con neuronas hipocampales, en que la sobrevida celular alcanzó al 72,93 ± 4,75 y 71,17 ± 2,81% en cultivos control e incubados con bicuculina. La mayor sobrevida de cultivos corticales depende de NO y la neurotrofina BDNF y su receptor TrkB. En cambio, en neuronas hipocampales, se confirmó la toxicidad de NO y la presencia de BDNF no tuvo efecto sobre la viabilidad. Basados en estos hallazgos, la hipótesis de esta memoria es la siguiente: BDNF, a través de su receptor TrkB, induce síntesis de NO lo que lleva a modulación homeostática del receptor de NMDA en neuronas corticales pero no hipocampales. Esta vía no depende de fosforilación del receptor TrkB en el residuo Y515. Se encontró que BDNF es capaz de inducir síntesis de NO en neuronas corticales, pero no en hipocampales. Además, NO inhibe los influjos de calcio mediadas por el receptor de NMDA en neuronas corticales, pero no hipocampales. Esta vía neuroprotectora no pudo ser detectada en células hipocampales, en la cual el NO fue sintetizado principalmente en respuesta a estimulación NMDA, lo que no inhibió los influjos de calcio. Este estudio muestra que BDNF tiene un papel neuroprotector frente a un insulto excitotóxico en neuronas corticales pero no hipocampales, efecto que está mediado por NO. Por lo tanto, efectos biológicos opuestos del NO dependen de la vía de señalización implicada en su síntesis. Es posible que este mecanismo neuroprotector pueda ser potenciado en regiones cerebrales vulnerables a insultos excitotóxicos asociados a patologías como la epilepsia, isquemia y accidentes vasculares

Memoria para optar al título de Bioquímico / Debido a la demanda social, la mujer ha tenido que postergar la maternidad. Esto presenta el inconveniente de que con el aumento de la edad decrece el número y la calidad de los folículos, disminuyendo progresivamente la fertilidad. Además, se ha descrito que los ovarios de mujeres pre y posmenopáusicas presentan características del desarrollo folicular similares al del ovario poliquístico (PCO) descrito en mujeres en edad fértil. También se ha descrito que mujeres con PCO y posmenopáusicas (entre 51 y 94 años de edad) presentan una mayor densidad de fibras nerviosas ováricas comparadas con ovarios de mujeres normales. En el modelo múrido, la rata presenta un aumento en la concentración de noradrenalina (NA) intraovárica y un incremento en el número de folículos tipo III (FTIII) y quistes ováricos a medida que envejece. Como consecuencia, disminuye el número de cuerpos lúteos (CL), el porcentaje de ovulación y el número de partos y crías. Por otro lado, en PCO en rata inducido con estímulos hormonales y/o ambientales, se generan características similares a las descritas en el envejecimiento ovárico. Además, PCO en ratas es acompañado de un aumento en la activación noradrenérgica ovárica, la cual es gatillada por un aumento previo en la producción de NGF intraovárico y su receptor de baja afinidad p75NTR. Mas aún, incremento de NGF intraovárico mediante al inyección de células sobreproductoras en el ovario de ratas jóvenes, induce un incremento del número de FTIII y prequistes. Por lo tanto, proponemos que NGF como factor neurotrófico y/o factor de crecimiento, durante el periodo de subfertilidad, acelera el envejecimiento ovárico siendo un importante componente para el control del final del periodo reproductivo en la rata. Ratas Sprague-Dawley de 6, 8 y 10 meses de edad fueron tratadas con NGF localmente en el ovario durante 28 días mediante una minibomba osmótica. Durante el procedimiento la ciclicidad estral fue estudiada por frotis vaginal. Posteriormente las ratas fueron eutanasiadas y se determinó la concentración de NGF intraovárico, la concentración de NA por HPLC, hormonas esteroidales en suero por EIA, y la morfología ovárica fue analizada mediante cortes de 6 um teñidos con hematoxilina-eosina. Los resultados demostraron los mayores efectos de la administración de NGF se observaron a los 10 meses de edad, donde observamos un incrementó en la concentración de NA y el número de FTIII en ovario, como esperábamos, disminuyó el número de CL y el porcentaje de ovulación. En los tratamientos de 6 y 8 meses no se observaron cambios tan importantes. Sin embargo, se observaron algunas características típicas del envejecimiento ovárico, como incremento de la concentración de noradrenalina, disminución de la población folicular y aumento de folículos tipo III. En la función esteroidogénica, se observó un perfil hormonal sérico similar al del envejecimiento. Estos resultados sugieren que el aumento intraovárico de NGF participa en el envejecimiento del ovario, favoreciendo la aparición de las características observadas al final del periodo reproductivo. / Woman has delayed their motherhood still after 30 years old because of social demand, but ovarian follicle numbers and quality decreases with age, progressively decreasing the fertility with age. Furthermore, it has been described that ovaries from women during the pre- and/or post-menopausal period show a follicular development similar to polycystic ovary (PCO) in fertile women. It has been also found that the ovary of women with PCO (between 18 and 44 years old) or during postmenopausal period (between 51 and 94 years old) shows increased nerves fibers in contrast with the ovary of normal women. In the murine model, the ovary of ageing rat is characterized by increased concentration of noradrenaline (NA) and elevated number of type III follicles (FTIII) and cysts in the ovary. As a consequence, it decreased the number of corpus luteum (CL), the ovulation rate, pregnancy and the number of live pups. PCO in rat, either induced by hormonal and/or environmental stimulus, presents similar characteristics as most of ovarian ageing. In addition PCO in rats is accompanied by an increase in the activity of sympathetic nerves induced by a previous increase in the intraovarian levels of NGF (nerve growth factor) and its receptor p75NTR. Moreover, local increase of NGF by injection of overproducing cells in the ovaries of young rats induces an elevated number of FTIII and pre-cysts. Therefore, now we propose that NGF, during the subfertile period, could act either as a neurotrophic factor or as a growth factor to accelerate the ovarian ageing being a principal component to control the end of reproductive period in rats. Sprague-Dawley rats 6, 8 and 10 months old (before at the end of the reproductive period) were used. We administered NGF during 28 days trough an osmotic mini-pumps, connected to the ovary by a sylastic cannula. During the procedure the estrual cycling activity was followed by vaginal smear. Rats were euthanized and the ovarian concentration of NGF was determined by ELISA, NA was determined by HPLC, the concentration of steroid hormones in serum by EIA and the morphological analysis of the ovary was done in 6 um slices stained with hematoxylineosin measured. The major effects of NGF occurred in the 10 months old rats, at this age we observe an increase in the concentration of NA and in the number of FTIII. As we can expect, the number of CL and the ovulation rate were decreased. In the NGF treatment at 6 and 8 months old there were no important changes. However, we observed the appearance of some ovarian ageing characteristics such as an increase in the concentration of NA, decrease of follicular population and an elevate number of FTIII (it was observed at 8 month old, as we can expect if the ageing is accelerated). In the steroidogenic function, we observe in all treatments the normal ageing-hormonal profile. These results suggest that the intraovarian excess of NGF accelerate the ageing ovarian, maybe increasing the rises of the typical characteristic at the end of the reproductive period

Magister en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En el cáncer ovárico epitelial (COEI), el ovario pierde el control normal de la angiogénesis. El COE exhibe alta expresión del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), un factor proangiogénico. Por otro lado, la calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional con propiedades anti-angiogénicas. Su exposición en la cara extracelular de la membrana plasmática de células tumorales en proceso de muerte celular es necesaria para que éstas sean reconocidas y fagocitadas por células dendríticas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de CRT en muestras humanas: ovarios normales inactivos, tumores benignos, tumores borderline y muestras de cáncer ovárico epitelial. Además, evaluar si el NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales normales de la superficie ovárica humana (células HOSE) y en una línea celular de cáncer ovárico epitelial (A2780). Los niveles de mRNA y proteicos de CRT fueron evaluados mediante RT-PCR, western-blot e inmunohistoquímica en un total de 67 muestras ováricas humanas. La expresión de CRT inducida por estimulación con NGF en líneas celulares fue evaluada por RT-PCR, western-blot e inmunocitoquímica. Los niveles de mRNA de CRT aumentaron en muestras de cáncer ovárico epitelial comparado con ovarios normales inactivos, tumores benignos y tumores borderline. Los niveles proteicos resultaron mayores en cáncer con respecto a tumores benignos y tumores borderline. Al estimular las líneas celulares HOSE y A2780 con NGF (100 ng/ml) por 30 minutos, no se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de mRNA. Sin embargo, a través de inmunocitoquímica y western-blot se observó un aumento significativo en los niveles proteicos de CRT al estimular con NGF comparado con la situación control. Este efecto fue revertido por GW441756, un inhibidor específico del receptor de NGF, TRKA. Estos resultados sugieren que NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales ováricas mediante la activación de su receptor de alta afinidad TRKA / In epithelial ovarian cancer (EOC), the ovary loses the normal control of angiogenesis. EOC exhibits high expression of Nerve Growth Factor (NGF), a proangiogenic protein. On the other hand, calreticulin (CRT) is a multifunctional protein with anti-angiogenic properties. Its exposure on the cell membrane of dying tumor cells is necessary to promote their recognition and engulfment by dendritic cells. The aim of this work was to evaluate CRT expression in human samples: normal inactive ovaries, benign tumors, borderline tumors and epithelial ovarian cancer samples. Besides, to evaluate whether NGF regulates CRT expression in human ovarian surface epithelium cells (HOSE cells) and in an epithelial ovarian cancer cell line (A2780). Calreticulin mRNA and protein levels were analyzed by RT-PCR, western-blot and immunohistochemistry in 67 human ovarian samples. CRT expression induced by NGF stimulation in cell lines was evaluated by RT-PCR, western-blot and immunocytochemistry. CRT mRNA levels were elevated in epithelial ovarian cancer samples as compared to inactive normal ovaries, benign tumors and borderline tumors. CRT protein levels, evaluated by western-blot, were increased in epithelial ovarian cancer with respect to benign and to borderline tumors. When HOSE and A2780 cell lines where stimulated with NGF (100 ng/ml) for 30 minutes, no significant increase in CRT mRNA levels, evaluated by RT-PCR, was found. However, by immunocytochemistry and western-blot there was a significant increase in CRT protein levels after NGF stimulation, as compared to controls. This effect was reverted by GW441756, a TRKA specific inhibitor, receptor for NGF. These results suggest that Nerve Growth Factor regulates CRT expression in epithelial ovarian cells through TRKA activation, its high affinity receptor

A pesar del continuo progreso en quimioterapia, radioterapia y cirugía, las tasas de sobrevida para pacientes con tumores sólidos son aun insatisfactorias. Investigaciones recientes han mostrado áreas moleculares más específicas que son potenciales blancos para la intervención terapéutica: en particular, las señales intracelulares de los factores de crecimiento que regulan la proliferación celular. Un desequilibrio en esas vías intracelulares puede resultar en proliferación celular descontrolada llevando al desarrollo de tumores. EGFR es un excelente “target” para la terapia del cáncer debido a que es el receptor mas frecuentemente expresado en una variedad de canceres. De manera importante, en ciertos tumores, la expresión de EGFR esta asociada con enfermedad avanzada y pobre pronostico clínico. Esta asociación ha llevado al desarrollo de un número de terapias innovadoras que hacen blanco en este factor de crecimiento y sus vías intracelulares activadas.

Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica Aplicada, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es la primera causa de muerte por neoplasias ginecológicas en países desarrollados como Canadá, EE.UU e Israel. Específicamente en Chile, es la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Este cáncer se caracteriza por ser de diagnóstico tardío, debido a su sintomatología inespecífica, y poseer una pobre respuesta al tratamiento. Debido a lo anterior, es importante entender los mecanismos tanto de la génesis como del desarrollo de esta neoplasia. Actualmente, hay mucha literatura sobre los factores de crecimiento que están involucrado en la progresión del COE, así como también de aquellos factores de crecimiento que juegan un rol crítico en la carcinogénesis ovárica. En COE se sabe que la vía de señalización de TGF-β1 se encuentra alterada de modo que esta vía podría estar involucrada en la progresión de esta patología. Por otro lado, NGF y su receptor TRKA participan en la progresión del cáncer ovárico debido a su rol en la proliferación celular y angiogénesis. Estudios en nuestro laboratorio han reportado que a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de VEGF, NGF, receptor TRKA y su forma activa (p-TRKA). En otras patologías, se ha demostrado que TGF-β1 es capaz de aumentar los niveles de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), así como también que NGF puede inducir esta enzima en ovario bovino. COX-2 juega un papel importante en muchos tipos de cáncer y es clave en la síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico, siendo la PGE2 la más común y ubicuamente producida. Se ha reportado que esta prostaglandina es capaz de inducir la expresión de VEGF y, por ende, promover la angiogénesis tumoral. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de COX-2, y los factores de crecimiento NGF y TGF-β1, en forma independiente, aumentan los niveles de COX-2 y PGE2, induciendo un incremento en los niveles de VEGF en líneas celulares de cáncer de ovario. Objetivos: Evaluar si la presencia y el cambio en los niveles de COX-2 se relacionan con la progresión del COE; además, determinar si TGF-β1 o NGF aumentan los niveles de COX-2 y la producción de PGE2, y si este último induce un aumento en los niveles de VEGF en las líneas celulares de epitelio de la superficie ovárica humana (HOSE) y de cancer ovárico epitelial humano (A2780). Metodología: En los experimentos ex vivo se evaluaron los niveles de COX-2 en 36 muestras de tejido ovárico (6 OVI; 6 TBE; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II y 6 COE III) mediante inmunohistoquímica, western blot y RT-PCR. En relación a los experimentos in vitro, ambas líneas celulares se estimularon con TGF-β1 o NGF para determinar los niveles de COX-2, tanto por RT-PCR como western blot, y los los niveles secretados de PGE2 y VEGF en los medios de cultivo por inmunoanálisis. Resultados: La inmunotinción de COX-2 en las muestras de tejido ovárico muestra un aumento en los niveles proteicos de esta enzima a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial. Acorde a lo anterior, mediante western blot y RT-PCR se aprecian mayores niveles de COX-2 en las muestras de tejido de cáncer ovárico en comparación con las muestras de ovario inactivo. En las líneas celulares de ovario, sólo la línea celular cancerígena A2780 respondió ante los tratamientos con NGF o TGF-β1 durante 2 horas, observando un aumento en los niveles del transcrito y proteína de COX-2 y de PGE2. Finalmente, al utilizar un inhibidor de COX-2 no se aprecia una disminución en los niveles de secreción de VEGF, por efecto de los tratamientos con NGF o TGF-β1. Estos resultados sugieren que el incremento en los niveles de VEGF por NGF, demostrado y publicado por nuestro grupo de laboratorio, puede ser sin la participación de PGE2. Proyecciones: Desde el punto de vista clínico, sería interesante evaluar qué procesos tales como proliferación, migración o invasión celular está modulando COX-2 y PGE2, por efecto de NGF o TGF-β1 en las células A2780. Adicionalmente, sería importante determinar a través de qué vía de señalización esta prostaglandina está mediando tales procesos, puesto que sería crucial tener una visión mucho más acabada de los mecanismos involucrados en esta patología. Considerando lo anterior, se podrían plantear nuevos blancos terapéuticos que permitan mejorar la sobrevida de las pacientes que padecen de este tipo de cáncer / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecological malignancies in developed countries like Canada, USA and Israel. Specifically in Chile, is the second leading cause of death from gynecological malignancies. This cancer is characterized by being diagnosed in advanced stages, due to its nonspecific symptoms, and have a poor response to therapy. Because of this, it is important to understand the mechanisms of both the genesis and development of this pathology. Currently, there are many information regarding the effect of growth factors involved in EOC progression as well as those growth factors that play a critical role in ovarian carcinogenesis. It is known that in EOC the signaling pathway of TGF-β is altered then could be involved in the progression of this disease. On the other hand, NGF and TRKA receptor are involved in ovarian cancer progression due to its role in cellular proliferation and angiogenesis. Studies in our laboratory have reported that during epithelial ovarian cancer progression, there is an increase in VEGF, NGF, TRKA and p-TRKA levels. In other pathologies, it has been demonstrated that TGF-β1 is able to increase cyclooxygenase-2 (COX-2) levels and that NGF can also induce this enzyme in bovine ovary. COX-2 plays an important role in many cancers and is essential in prostaglandin synthesis from arachidonic acid, where PGE2 is the most common and ubiquitously produced. It has been reported that this prostaglandin induces VEGF expression and thus promote tumor angiogenesis. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer, there is an increase of COX-2 levels, and the growth factors NGF and TGF-β1, independently, increase COX-2 and PGE2 levels, inducing an increase in VEGF levels in ovarian cancer cell lines. Objectives: To evaluate whether the presence and change in COX-2 levels are associated with EOC progression; also to determine whether TGF-β1 or NGF increase COX-2 and PGE2 synthesis, and if the latter induces an increase in VEGF levels in human ovarian surface epithelium (HOSE) and human epithelial ovarian cancer (A2780) cell lines. Methods: In ex vivo experiments COX-2 levels were evaluated in 36 ovarian tissue samples (6 OVI; TBE 6; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II and 6 COE III) by immunohistochemistry, western blot and RT-PCR. In relation to in vitro experiments, both cell lines were stimulated with TGF-β1 or NGF to determine COX-2 levels by RT-PCR and western blot, and PGE2 and VEGF levels secreted into the culture medium by immunoassay. Results: Immunohistochemical detection of COX-2 in ovarian tissue samples shows an increase in protein levels of this enzyme with the progression of epithelial ovarian cancer. According to the above, by RT-PCR and western blot, higher COX-2 levels are observed in ovarian cancer compared to inactive ovary tissue samples. In ovarian cell lines, only A2780 cancer cell line responded to the treatment with NGF or TGF-β1 for 2 hours, observing an increase in transcript and protein COX-2 and PGE2 levels. Finally, when a COX-2 inhibitor is used, there is no decrease in VEGF secretion levels, by NGF or TGF-β1 effect. This results suggest that the increase of VEGF by NGF found and published by our group may be without the participation of PGE2. Projections: From the clinical standpoint, it would be interesting to evaluate what processes such as proliferation, migration or invasion is modulating COX-2 and PGE2, by effect of NGF or TGF-β1 in A2780 cells. Additionally, it would be important to determine what signaling pathway is mediating such processes, since it would be important to have a better understanding of the mechanisms involved in this pathology. Considering the above, it could propose new therapeutic targets to improve the survival of patients suffering this cancer / Fondecyt