Mutações inativadoras em homozigose no gene do transdutor de sinal e ativador de transcrição 5B (STAT5B) causam insensibilidade ao hormônio de crescimento associada a disfunção imunológica grave que se manifesta na forma de infecções exacerbadas e de repetição, pneumonia intersticial linfocítica e outros eventos autoimunes. A caracterização do fenótipo destas mutações em heterozigose não foi realizada previamente. Dois pacientes descritos com mutação em homozigose na STAT5B (c.424_427del / p.L142RfsX19) são irmãos brasileiros naturais de Criciúma - Santa Catarina, sem consanguinidade conhecida na família. Houve também o relato de dois outros casos semelhantes na cidade, já falecidos, sugerindo que mutações na STAT5B pudessem ser relativamente frequentes nesta região. Os objetivos deste estudo foram investigar a frequência da mutação c.424_427del da STAT5B na população de Criciúma, avaliar a existência de efeito fundador e caracterizar o efeito da mutação c.424_427del da STAT5B em heterozigose sobre o fenótipo antropométrico e hormonal. Para investigar a frequência desta mutação em Criciúma, 1192 indivíduos da população foram genotipados. Foram identificados sete indivíduos heterozigotos, caracterizando uma frequência alélica mínima de 0,29% (intervalo de confiança 95%: 0,08 a 0,5%), significativamente mais alta que a frequência de outras variantes patogênicas da STAT5B descritas em bases de dados públicas. Utilizando-se o equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi possível estimar a incidência de casos de homozigotos para o alelo mutado em um a cada 40 anos. No entanto, utilizando-se a maior frequência possível de acordo com o intervalo de confiança, esta incidência poderia atingir um a cada 13 anos. Além disso, foram estudados os pais dos dois casos relatados como semelhantes aos pacientes homozigotos para mutações na STAT5B e estes pais eram portadores da mutação c.424_427del da STAT5B em heterozigose. Para avaliar o efeito fundador, foram analisados dois marcadores próximos à mutação c.424_427del da STAT5B nos pacientes homozigotos para a mesma, em 33 indivíduos heterozigotos de sete famílias independentes e em 53 indivíduos controles. O mesmo haplótipo estava presente nos pacientes homozigotos para a mutação e em todos os heterozigotos, enquanto em apenas 9,4% dos controles (p < 0,001), apontando a probabilidade de que a mutação c.424_427del nas diferentes famílias tenha sido herdada de um antepassado em comum. Para avaliar o efeito da mutação c.424_427del da STAT5B em heterozigose, foram comparados em conjunto os 33 indivíduos heterozigotos e os 38 familiares não portadores em relação à altura e a alguns exames laboratoriais (gerais e hormonais). Os indivíduos heterozigotos foram significativamente mais baixos, com uma redução na altura de 0,6 desvios-padrão (p= 0,006). Também apresentaram redução significativa dos desvios-padrão de fator de crescimento insulina-símile 1 (IGF-1) e da proteína 3 de ligação a fator de crescimento insulina-símile (IGFBP-3), sem alteração em outros exames. Esses achados mostram que as mutações na STAT5B em heterozigose causam um impacto negativo significativo na altura, mais leve que o visto em pacientes com mutações em homozigose, com altura dentro da variação normal. Esse resultado favorece a hipótese de que variantes patogênicas raras em heterozigose contribuem para a variabilidade da altura normal / Homozygous inactivating mutations in signal transducer and activator of transcription 5B gene (STAT5B) cause growth hormone insensitivity associated with signs of severe immune dysfunction, such as recurrent infections, lymphoid interstitial pneumonia and other autoimmune events. The phenotypic characterization of these mutations in heterozygous state has not been accomplished previously. Two patients with a homozygous STAT5B mutation (c.424_427del / p.L142RfsX19) are Brazilian brothers born in the city of Criciúma, Santa Catarina, and there is not known consanguinity in their family. Moreover, there was a report about two similar cases in this city, already deceased, suggesting that STAT5B mutations could be relatively frequent in this region. The objectives of this study were to evaluate the frequency of STAT5B c.424_427del mutation in Criciúma, to assess the existence of the founder effect and to characterize the effect of heterozygous STAT5B c.424_427del mutation on anthropometric and hormonal phenotypes. To evaluate the frequency of this mutation in Criciúma, 1192 individuals from the population were genotyped. Seven heterozygous individuals were identified, which characterized a minimum allele frequency of 0.29% (95% confidence interval: 0.08 to 0.5%), significantly higher than the frequency of other pathogenic variants described in public databases. By using the Hardy-Weinberg law, it was possible to estimate the incidence of cases of individuals homozygous for this mutation at one every 40 years. However, by using the highest possible frequency according to the confidence interval, this incidence could reach one every 13 years. Additionally, the parents of the two reported cases who were similar to patients with homozygous STAT5B mutations were genotyped and these parents were heterozygous for STAT5B c.424_427del mutation. To assess the founder effect, two markers near the mutation were analyzed in the two boys homozygous for STAT5B c.424_427del mutation, in 33 heterozygous individuals from seven unrelated families and in 53 control individuals. The same haplotype was present in the homozygous boys and in all heterozygous individuals, while in only 9,4% control individuals (p < 0,001), pointing to the probability that STAT5B c.424_427del mutation in different families has been inherited from a common ancestor. To study the effects of heterozygous STAT5B c.424_427del mutation, 33 heterozygous individuals were compared to 38 non-carrier relatives on height and some laboratorial tests. Heterozygous individuals were significantly shorter than their noncarrier relatives, with a height reduction of 0.6 standard deviation scores (p= 0,006). Furthermore, they had a significant reduction in insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP-3) standard deviation scores, without differences in the other exams. These findings show that heterozygous STAT5B mutations cause a significant negative impact on height, milder than the effect seen in patients with homozygous mutations, with height within the normal range. This result favors the hypothesis that rare pathogenic variants in heterozygous state contribute to normal height variability

Introdução: A patogênese molecular dos tumores adrenocorticais é heterogênea e ainda pouco compreendida. A hiperexpressão do gene do fator de crescimento semelhante à insulina II (IGF-II) tem sido demonstrada na maioria dos carcinomas adrenocorticais em adultos. Os efeitos mitogênicos do IGF-II são mediados pela interação com o receptor de IGF-I (IGF-IR). Adicionalmente, o fator esteroidogênico 1 (SF-1) e o fator codificado por uma região crítica do cromossomo X associada ao sexo reverso e à hipoplasia adrenal congênita (DAX-1), ambos envolvidos no desenvolvimento e na esteroidogênese adrenal, também têm sido implicados na tumorigênese adrenocortical. Objetivos: Analisar a expressão gênica e a imunorreatividade dos fatores IGF-II, IGF-IR, SF-1 e DAX-1 em tumores adrenocorticais de crianças e adultos. Avaliamos ainda os efeitos de um inibidor seletivo do IGF-IR (NVP-AEW541) na proliferação celular e apoptose de linhagens celulares de tumores adrenocorticais. Métodos: Neste estudo, a expressão gênica foi determinada por PCR quantitativa em tempo real em 57 tumores adrenocorticais (37 adenomas e 20 carcinomas). Vinte e três pacientes tinham idade inferior ou igual a 15 anos. A análise de imunohistoquímica foi realizada em 109 tumores adrenocorticais (71 adenomas e 38 carcinomas). Os efeitos do tratamento com NVP-AEW541 (0,3 a 30 M) na proliferação celular e apoptose foram avaliados nas células NCI H295 de carcinoma adrenocortical humano e em uma nova linhagem celular estabelecida a partir de um adenoma adrenocortical pediátrico da nossa casuística. Resultados: A hiperexpressão do gene IGF-II foi evidenciada nos tumores adrenocorticais benignos e malignos de crianças (média ± EPM, 50,8 ± 18,5 vs. 31,2 ± 3,7, respectivamente; p= 0,23). Em adultos, a expressão do gene IGF-II foi significativamente mais elevada nos carcinomas adrenocorticais quando comparada com os adenomas (270,5 ± 130,2 vs. 16,1 ± 13,3; p= 0,0001). O percentual das células neoplásicas imunorreativas para o IGF-II não foi significativamente diferente entre os adenomas e carcinomas adrenocorticais pediátricos (14,1 ± 2,8% vs. 31,1 ± 13,1%, respectivamente; p= 0,32). Em adultos, o percentual das células neoplásicas positivas para o IGF-II foi significativamente maior nos carcinomas adrenocorticais em relação aos adenomas (34,4 ± 5,8% vs. 14,2 ± 3,2, respectivamente; p= 0,03). Os valores de RNAm do IGF-IR foram significativamente mais elevados nos carcinomas adrenocorticais pediátricos em relação aos adenomas (9,1 ± 1,2 vs. 2,6 ± 0,3; p= 0,0001), enquanto a expressão deste receptor foi similar nos tumores adrenocorticais benignos e malignos de adultos (1,6 ± 0,3 vs. 1,8 ± 0,5, respectivamente; p= 0,75). Os valores de RNAm do IGF-IR [risco relativo (RR) 2,0, intervalo de confiança (IC) de 95% 1,2 a 3,1; p= 0,004] e os critérios histopatológicos de Weiss (RR 1,8, IC de 95% 1,2 a 2,7; p= 0,003) foram marcadores independentes de metástases em crianças e adultos, respectivamente. O NVP-AEW541 inibiu a proliferação celular estimulada por IGF-II de forma dose e tempo dependentes nas 2 linhagens celulares de tumores adrenocorticais através de uma significativa indução da apoptose. Adicionalmente, a hiperexpressão do gene SF-1 foi identificada em 13% e 15% dos tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos, respectivamente. O percentual das células neoplásicas com imunorreatividade nuclear para SF-1 foi significativamente maior nos tumores adrenocorticais pediátricos em relação aos tumores diagnosticados em adultos (29,1 ± 5,4% vs. 8,3 ± 2,3%, respectivamente; p= 0,0001). Estes dados indicam que o aumento da expressão do SF-1 nos tumores adrenocorticais pediátricos ocorre em nível pós-traducional. A hiperexpressão do gene DAX-1 foi identificada em 39% dos tumores adrenocorticais, com uma prevalência semelhante em crianças e adultos. De forma similar, o aumento da expressão da proteína DAX-1 foi identificado em 36% e 27% dos tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos, respectivamente. A imunorreatividade nuclear para DAX- 1 foi semelhante nos adenomas e carcinomas adrenocorticais (29,2 ± 3,8% vs. 21,4 ± 5,8% das células neoplásicas, respectivamente; p= 0,12). Conclusões: A hiperexpressão do IGF-II tem um papel relevante na tumorigênese adrenocortical. A hiperexpressão do gene IGF-IR foi um marcador biológico independente do carcinoma adrenocortical metastático em crianças. Os efeitos anti-tumorais in vitro do NVP-AEW541 sugerem que o IGF-IR constitui um potencial alvo terapêutico para o carcinoma adrenocortical humano. Adicionalmente, o aumento da expressão do SF-1 foi evidenciado predominantemente nos tumores adrenocorticais pediátricos. A hiperexpressão do DAX-1 constitui um evento importante na patogênese molecular dos tumores adrenocorticais benignos e malignos / Introduction: The molecular pathogenesis of adrenocortical tumors is heterogeneous and incompletely understood. Insulin-like growth factor II (IGF-II) overexpression has been demonstrated in adult adrenocortical carcinomas. IGF-II exerts its mitogenic effects through interaction with IGF-I receptor (IGF-IR). In addition, steroidogenic factor 1 gene (SF-1) and dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenita critical region on the X chromosome gene (DAX-1), which regulate adrenal development and steroidogenesis, have been also involved in adrenocortical tumorigenesis. Objectives: To analyze gene and protein expression of IGF-II, IGF-IR, SF-1 and DAX-1 in pediatric and adult adrenocortical tumors. We also evaluated the effects of a selective IGF-IR kinase inhibitor (NVP-AEW541) on adrenocortical tumor cell lines. Methods: Gene expression was determined by quantitative real-time PCR in 57 adrenocortical tumors (37 adenomas and 20 carcinomas) from 23 children and 34 adults. Twenty and three patients were younger than 15 years. A tissue microarray analysis was performed on a large cohort of 109 ACT (71 adenomas and 38 carcinomas; 39 children and 70 adults) In addition, the effects of NVP-AEW541 treatment (0.3 to 30M) on proliferation and apoptosis were investigated in the NCI H295 cell line and in a new cell line established from a pediatric adrenocortical adenoma of our cohort. Results: IGF-II transcripts were overexpressed in pediatric adrenocortical carcinomas and adenomas (mean ± SE, 50.8 ± 18.5 vs. 31.2 ± 3.7, respectively; p= 0.23). IGF-II gene expression was significantly higher in adult adrenocortical carcinomas than in adenomas (270.5 ± 130.2 vs. 16.1 ± 13.3; p= 0.0001). The percentual of neoplastic cells immunostaining for IGF-II was not statistically different between pediatric adrenocortical adenomas and carcinomas (14.1 ± 2.8% vs. 31.1 ± 13.1%, respectively; p= 0.32). Otherwise, the percentual of positive neoplastic cells for IGF-II was significantly higher in adult adrenocortical carcinomas than in adenomas (34.4 ± 5.8% vs. 14.2 ± 3.2, respectively; p= 0.03). IGF-IR mRNA levels were significantly higher in pediatric adrenocortical carcinomas than in adenomas (9.1 ± 1.2 vs. 2.6 ± 0.3; p= 0.0001), whereas similar IGF-IR expression levels were identified in adult adrenocortical carcinomas and adenomas (1.6 ± 0.3 vs. 1.8 ± 0.5, respectively; p= 0.75). In a Cox multivariate analysis, IGF-IR gene expression [hazard ratio (HR) 2.0, 95% confidence interval (CI) 1.2 to 3.1; p= 0.004] and Weiss score (HR 1.7, 95% CI 1.2 to 2.7; p= 0.003) were independent biomarkers of metastasis in pediatric and adult adrenocortical tumors, respectively. Furthermore, NVP-AEW541 blocked cell proliferation in a dose- and time-dependent manner in both NCI H295 and pediatric adrenocortical cell lines through a significant increase of apoptosis. Additionally, SF-1 gene overexpression was identified in 13% and 15% of pediatric and adult adrenocortical tumors, respectively. The percentual of neoplastic cells with nuclear immunoreactivity for SF-1 was significantly higher in pediatric than in adult adrenocortical tumors (29.1 ± 5.4% vs. 8.3 ± 2.3%, respectively; p= 0.0001). These findings suggest that SF-1 overexpression occurs at the translational level in pediatric adrenocortical tumors. DAX-1 gene overexpression was identified in 39% of adrenocortical tumors with a similar frequency in children and adults. Similarly, DAX-1 protein overexpression was identified in 36% and 27% of pediatric and adult adrenocortical tumors, respectively. DAX-1 immunostaining on nuclei was not statistically different in benign and malignant adrenocortical tumors (29.2 ± 3.8% vs. 21.4 ± 5.8% of neoplastic cells, respectively; p= 0.12). Conclusion: IGF-II overexpression has a pivotal role to adrenocortical tumorigenesis. IGFIR overexpression was a potential biomarker of metastases in children with adrenocortical carcinoma. We demonstrated that a selective IGF-IR kinase inhibitor had anti-tumor effects in adult and pediatric ACT cell lines, suggesting that IGF-IR inhibitors represent a promising therapy for human adrenocortical carcinoma. In addition, SF-1 overexpression might be mainly involved in pediatric adrenocortical tumorigenesis. DAX-1 overexpression has an important role to molecular pathogenesis of benign and malignant adrenocortical tumors

Os polimorfismos do gene TCF7L2 têm sido fortemente associados com risco de desenvolvimento de diabetes mellitus em populações de diversas origens étnicas. No presente estudo, investigou-se se esta associação se confirma em diferentes populações brasileiras e qual seu efeito sobre o desempenho de um modelo de predição de risco de diabetes mellitus quando a informação genética foi acrescentada às variáveis clínicas e laboratoriais iniciais. Concluiu-se que, apesar de haver sido confirmado a associação do polimorfismo rs7903146 ao diabetes tipo 2 na população brasileira, a inclusão desta informação no modelo teve desempenho equivalente ao modelo baseado unicamente em variáveis clínicas. / Recently, polymorphisms of gene TCF7L2 have been strongly associated with Type 2 Diabetes risk in populations of diverse genetic backgrounds. In this study we investigated if this association is present in different Brazilian populations and how the inclusion of genetic information to a diabetes risk prediction model based on clinical and laboratorial variables would affect its would affect its performance. We concluded that, even though the TCF7L2 rs7903146 polimorphism is associated to Type 2 Diabetes risk in the Brazilian population, that inclusion of such information to a diabetes risk prediction model based on clinical variables lead to equivalent performance.

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal. / Purinergic receptors and voltage gated Ca2+ channels have been attributed with developmental functions including gastrulation and neural differentiation. Upon activation, nucleotide-activated P2 purinergic receptor and voltage-gated Ca2+ channel subtypes trigger intracellular calcium transients controlling cellular processes. Here, we studied the participation of voltage-gated calcium channels and P2 receptor activity in spontaneous calcium transients and consequent regulation expression of transcription factors related to retinoic acid-induced neurogenesis of mouse neural stem and embryonic stem cells (ESC). In embryonic pluripotent stem cells, proliferation is accelerated by P2X7 receptor activation, while receptor expression / activity needs to be down-regulated for the progress of neuroblast differentiation. Moreover, along neural differentiation time lapse imaging with means of a cytosolic calcium-sensitive fluorescent probe provided different patterns of spontaneous calcium transients (waves and spikes) showing that both, frequency and amplitude increased along differentiation. Cells treated with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor Xestospongin C showed spikes but not waves, indicating that waves exclusively depended on calcium release from endoplasmic reticulum by IP3R activation. Cells treated with the P2X7 receptor subtype agonist Bz-ATP and the P2Y2 and P2Y4 receptor 2-S-UTP increased frequency and amplitudes of calcium transients, mainly spikes, in embryonic telencephalon neural stem cells (NSC) and NSC pre-differentiated from ESC. Data obtained by luminescence time lapse imaging of stable transfected cells with Mash1 or Ngn2 promoter-protein fusion to luciferase reporter construct revealed increased Mash1 expression due to activation of P2Y2/P2Y4 receptor subtypes, while increased expression of Ngn2 was observed following P2X7 receptor activation. In addition, cells imaged in presence of the extracellular calcium chelator EGTA or following endoplasmic reticulum calcium store depletion by thapsigargin showed a decrease in Mash1 and Ngn2 expression, indicating that both are regulated by calcium signaling. Investigation of the roles of voltage gated Ca2+ channels in neural differentiation showed that Ca2+ influx in NSC pre-differentiated from ESC is due to membrane depolarization and L-type voltage gated Ca2+ channel activation, thereby controlling cell fate decision, by stabilizing the expression of MASH1 and inducing differentiation, by phosphorylation of the transcription factor CREB. Altogether these data suggest that P2X7, P2Y2, P2Y4 receptors and L-type voltage gated Ca2+ channels can modulate spontaneous calcium oscillations during neural differentiation and consequently change the Mash1 and Ngn2 expression patterns, thus favoring the cell fate decision to the neuronal phenotype.

Fatores de transcrição (FT) são proteínas que se ligam em sequências específicas e bem conservadas de nucleotídeos no DNA, denominadas sítios de ligação dos fatores de transcrição (SLFT), localizadas em regiões de regulação gênica conhecidas como módulos cis-reguladores (CRM). Ao reconhecer o SLFT, o fator de transcrição se liga naquele sítio e influencia a transcrição gênica positiva ou negativamente. Existem técnicas experimentais para a identificação dos locais dos SLFTs em um genoma, como footprinting, ChIP-chip ou ChIP-seq. Entretanto, a execução de tais técnicas implica em custos e tempo elevados. Alternativamente, pode-se utilizar as sequências de SLFTs já conhecidas para um determinado fator de transcrição e aplicar técnicas de aprendizado computacional supervisionado para criar um modelo computacional para tal sítio e então realizar a predição computacional no genoma. Entretanto, a maioria das ferramentas computacionais existentes para esse fim considera independência entre as posições entre os nucleotídeos de um sítio - como as baseadas em PWMs (position weight matrix) - o que não é necessariamente verdade. Este projeto teve como objetivo avaliar a utilização de gramáticas regulares estocásticas (GRE) como técnica alternativa às PWMs neste problema, uma vez que GREs são capazes de caracterizar dependências entre posições consecutivas dos sítios. Embora as diferenças de desempenho tenham sido sutis, GREs parecem mesmo ser mais adequadas do que PWMs na presença de valores mais altos de dependência de bases, e PWMs nos demais casos. Por fim, uma ferramenta de predição computacional de SLFTs foi criada baseada tanto em GREs quanto em PWMs. / Transcription factors (FT) are proteins that bind to specific and well-conserved sequences of nucleotides in the DNA, called transcription factor binding sites (TFBS), contained in regions of gene regulation known as cis-regulatory modules (CRM). By recognizing TFBA, the transcription factor binds to that site and positively or negatively influence the gene transcription. There are experimental procedures for the identification of TFBS in a genome such as footprinting, ChIP-chip or ChIP-Seq. However, the implementation of these techniques involves high costs and time. Alternatively, one may utilize the TFBS sequences already known for a particular transcription factor and applying computational supervised learning techniques to create a computational model for that site and then perform the computational prediction in the genome. However, most existing software tools for this purpose considers independence between nucleotide positions in the site - such as those based on PWMs (position weight matrix) - which is not necessarily true. This project aimed to evaluate the use of stochastic regular grammars (SRG) as an alternative technique to PWMs in this problem, since SRGs are able to characterize dependencies between consecutive positions in the sites. Although differences in performance have been subtle, SRGs appear to be more suitable than PWMs in the presence of higher base dependency values, and PWMs in other cases. Finally, a computational TFBS prediction tool was created based on both SRGs and PWMs.

Introdução: As células-tronco apresentam capacidade de proliferação, autorrenovação, potencial de diferenciação e já foram descritas na hipófise estando envolvidas na renovação celular e regulação homeostática, porém pouco se sabe sobre o seu perfil de expressão nos quadros de hipopituitarismo. Dentre os marcadores de células-tronco descritos previamente na hipófise, destacam-se os genes Sox2, Nanog, Nestina, Cd44 e Oct4. Outro marcador, o gene Nr2e1 (Tlx), encontrado em células-tronco neuronais, apresenta-se elevado durante a embriogênese e na vida adulta no cérebro de camundongos, mas, até o momento, não foi caracterizado na hipófise. Objetivo: Analisar a imunolocalização do SOX2 e o padrão de expressão de marcadores de células-tronco/progenitoras, fatores de transcrição precoce, marcadores de apoptose e proliferação celular na hipófise de três linhagens de camundongos com hipopituitarismo de causa genética por alteração em fatores precoces de diferenciação glandular, as linhagens Ames (Prop1) e Snell (Pou1f1), e por fator tardio de conjugação dos hormônios glicoproteicos, a linhagem alfaGSU, nocaute do gene Cga. Material e Métodos: Foram coletadas hipófises nos tempos P0 (ao nascimento), P7 (final da primeira onda de crescimento glandular), 4 semanas (4S-período da puberdade) e 8 semanas (8S-vida adulta). Nas três linhagens de animais, realizou-se imuno-histoquímica com SOX2 e RT-qPCR com os marcadores de células-tronco/progenitoras Sox2, Nanog, Nestina, Cd44, Oct4 e Nr2e1, fatores de transcrição precoces (Hesx1, Hes1 e Otx2), fator de proliferação celular (Ki67), fatores de diferenciação celular (S100beta e Sox9) e marcadores de apoptose (Caspases 3 e 7). A quantificação relativa dos genes-alvo nos animais mutantes teve como calibrador os seus respectivos selvagens. Resultados: A imunolocalização do SOX2 foi observada na zona que circunda a fenda de Rathke (camada marginal) e em nichos difusos pela glândula nas três linhagens estudadas. Na linhagem alfaGSU, evidenciou-se uma redução de Nanog, Nr2e1, Oct4, e Hesx1 em 4S e de Nestina em 8S. Na linhagem Snell, observou-se aumento na expressão de Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e aumento de Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 e Sox9 em 8S, associado à redução de Ki67 em ambos os períodos. Na linhagem Ames, evidenciou-se aumento de Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e 8S. O gene Nr2e1 esteve hiperexpresso em todos os tempos. Houve redução do Ki67 em 4S. As caspases 3 e 7 não se apresentaram alteradas em nenhuma linhagem e/ou tempo. Discussão e conclusão: O padrão de imunolocalização de SOX2 encontrado nas três linhagens estudadas foi semelhante ao descrito em animais sem hipopituitarismo. A evidência da presença do Nr2e1 o coloca como um novo marcador de células-tronco/progenitoras na hipófise. A expressão elevada dos marcadores de células-tronco/progenitoras nas linhagens Ames e Snell sugere que a ausência dos fatores de transcrição precoces não permitiria que a célula tronco/progenitora iniciasse o processo de diferenciação celular, enquanto o oposto ocorreria na linhagem alfaGSU. Adicionalmente, estes achados justificam a hipoplasia hipofisária observada em animais com defeitos em fatores de transcrição expressos no início da diferenciação hipofisária, nos quais o acúmulo de células-tronco pode ser um indicador da indiferenciação hipofisária / Introduction: The role of stem cells, with their capacity for proliferation, self-renewal, and differentiation, has already been described in the cell turnover and homeostatic regulation of the pituitary gland. However, little is known about the expression profiles of these markers in hypopituitarism. Among the stem cell markers previously described in the pituitary include the genes for Sox2, Nanog, nestin, CD44 and Oct4. Another gene marker, Nr2e1 (Tlx), found in neural stem cells, is highly expressed during embryogenesis and adulthood, but so far has not been characterized in the pituitary. Objective: To analyze the immunohistochemical profile of SOX2, as well as the pattern of expression of various markers of stem/progenitor cells, early transcription factors, apoptosis factors and cell proliferation in three pituitary strains of mice with a genetic cause of hypopituitarism. Strains studied with hypopituitarism due to changes in factors of precocious glandular differentiation, include the Ames (Prop1) and Snell (Pou1f1) lineages; hypopituitarism due to the delayed conjugation of glycoprotein hormones include the alfaGSU strain, which is caused by the knockout of the Cga gene. Material and Methods: We collected pituitaries at four time points including P0 (birth), P7 (considered the end of the first wave of growth glandular), 4 weeks (4S - puberty period) and 8 weeks (8S - adulthood). All three strains were subjected to immunohistochemical analysis of SOX2 and RT-qPCR of markers of stem/progenitor cells Sox2, Nanog, Nestin, Cd44, Oct4 and Nr2e1, early transcription factors (Hesx1, Otx2 and Hes1), cell proliferation (Ki67), cell differentiation factors (S100beta and Sox9) and apoptosis (caspases 3 and 7) markers. Relative quantification of target genes in mutant animals was normalized to their respective wild type littermate. Results: The immunolocalization of SOX2 was observed in the area surrounding the Rathke cleft (marginal layer), as well as in diffuse niches throughout the gland in all three strains studied. The alfaGSU strain showed a reduction of Nanog, Nr2e1, Oct4 and Hesx1 at 4S, and Nestin at 8S. The Snell mice exhibited an increase of expression in Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 in at 4S and increased Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 and Sox9 at 8S, associated with the reduction of Ki67 in both periods. The Ames strain showed an increase of Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 at 4S and 8S; the gene Nr2e1 was over expressed at all times; and there was reduction in Ki67 at 4S. Caspases 3 and 7 had not changed in any strain, at any time. Discussion and Conclusion: The pattern of immunolocalization of SOX2 found in the three strains studied was similar to that described in animals without hypopituitarism. The presence of Nr2e1 in our study suggests it as a new marker of stem/progenitor cells in the pituitary. The high expression of markers of stem/progenitor cells in the Ames and Snell strains suggests that the absence of early transcription factors Prop1 and Pou1f1 do not allow the stem/ progenitors cells to start the process of cell differentiation, while the opposite occurs in the alfaGSU lineage. Additionally, these findings explain the pituitary hypoplasia observed in animals with defects in early transcription factors, as indicated by the accumulation of stem cells in the Snell and Ames lineages, preventing the initiation of pituitary differentiation

Introdução: As células-tronco apresentam capacidade de proliferação, autorrenovação, potencial de diferenciação e já foram descritas na hipófise estando envolvidas na renovação celular e regulação homeostática, porém pouco se sabe sobre o seu perfil de expressão nos quadros de hipopituitarismo. Dentre os marcadores de células-tronco descritos previamente na hipófise, destacam-se os genes Sox2, Nanog, Nestina, Cd44 e Oct4. Outro marcador, o gene Nr2e1 (Tlx), encontrado em células-tronco neuronais, apresenta-se elevado durante a embriogênese e na vida adulta no cérebro de camundongos, mas, até o momento, não foi caracterizado na hipófise. Objetivo: Analisar a imunolocalização do SOX2 e o padrão de expressão de marcadores de células-tronco/progenitoras, fatores de transcrição precoce, marcadores de apoptose e proliferação celular na hipófise de três linhagens de camundongos com hipopituitarismo de causa genética por alteração em fatores precoces de diferenciação glandular, as linhagens Ames (Prop1) e Snell (Pou1f1), e por fator tardio de conjugação dos hormônios glicoproteicos, a linhagem alfaGSU, nocaute do gene Cga. Material e Métodos: Foram coletadas hipófises nos tempos P0 (ao nascimento), P7 (final da primeira onda de crescimento glandular), 4 semanas (4S-período da puberdade) e 8 semanas (8S-vida adulta). Nas três linhagens de animais, realizou-se imuno-histoquímica com SOX2 e RT-qPCR com os marcadores de células-tronco/progenitoras Sox2, Nanog, Nestina, Cd44, Oct4 e Nr2e1, fatores de transcrição precoces (Hesx1, Hes1 e Otx2), fator de proliferação celular (Ki67), fatores de diferenciação celular (S100beta e Sox9) e marcadores de apoptose (Caspases 3 e 7). A quantificação relativa dos genes-alvo nos animais mutantes teve como calibrador os seus respectivos selvagens. Resultados: A imunolocalização do SOX2 foi observada na zona que circunda a fenda de Rathke (camada marginal) e em nichos difusos pela glândula nas três linhagens estudadas. Na linhagem alfaGSU, evidenciou-se uma redução de Nanog, Nr2e1, Oct4, e Hesx1 em 4S e de Nestina em 8S. Na linhagem Snell, observou-se aumento na expressão de Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e aumento de Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 e Sox9 em 8S, associado à redução de Ki67 em ambos os períodos. Na linhagem Ames, evidenciou-se aumento de Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e 8S. O gene Nr2e1 esteve hiperexpresso em todos os tempos. Houve redução do Ki67 em 4S. As caspases 3 e 7 não se apresentaram alteradas em nenhuma linhagem e/ou tempo. Discussão e conclusão: O padrão de imunolocalização de SOX2 encontrado nas três linhagens estudadas foi semelhante ao descrito em animais sem hipopituitarismo. A evidência da presença do Nr2e1 o coloca como um novo marcador de células-tronco/progenitoras na hipófise. A expressão elevada dos marcadores de células-tronco/progenitoras nas linhagens Ames e Snell sugere que a ausência dos fatores de transcrição precoces não permitiria que a célula tronco/progenitora iniciasse o processo de diferenciação celular, enquanto o oposto ocorreria na linhagem alfaGSU. Adicionalmente, estes achados justificam a hipoplasia hipofisária observada em animais com defeitos em fatores de transcrição expressos no início da diferenciação hipofisária, nos quais o acúmulo de células-tronco pode ser um indicador da indiferenciação hipofisária / Introduction: The role of stem cells, with their capacity for proliferation, self-renewal, and differentiation, has already been described in the cell turnover and homeostatic regulation of the pituitary gland. However, little is known about the expression profiles of these markers in hypopituitarism. Among the stem cell markers previously described in the pituitary include the genes for Sox2, Nanog, nestin, CD44 and Oct4. Another gene marker, Nr2e1 (Tlx), found in neural stem cells, is highly expressed during embryogenesis and adulthood, but so far has not been characterized in the pituitary. Objective: To analyze the immunohistochemical profile of SOX2, as well as the pattern of expression of various markers of stem/progenitor cells, early transcription factors, apoptosis factors and cell proliferation in three pituitary strains of mice with a genetic cause of hypopituitarism. Strains studied with hypopituitarism due to changes in factors of precocious glandular differentiation, include the Ames (Prop1) and Snell (Pou1f1) lineages; hypopituitarism due to the delayed conjugation of glycoprotein hormones include the alfaGSU strain, which is caused by the knockout of the Cga gene. Material and Methods: We collected pituitaries at four time points including P0 (birth), P7 (considered the end of the first wave of growth glandular), 4 weeks (4S - puberty period) and 8 weeks (8S - adulthood). All three strains were subjected to immunohistochemical analysis of SOX2 and RT-qPCR of markers of stem/progenitor cells Sox2, Nanog, Nestin, Cd44, Oct4 and Nr2e1, early transcription factors (Hesx1, Otx2 and Hes1), cell proliferation (Ki67), cell differentiation factors (S100beta and Sox9) and apoptosis (caspases 3 and 7) markers. Relative quantification of target genes in mutant animals was normalized to their respective wild type littermate. Results: The immunolocalization of SOX2 was observed in the area surrounding the Rathke cleft (marginal layer), as well as in diffuse niches throughout the gland in all three strains studied. The alfaGSU strain showed a reduction of Nanog, Nr2e1, Oct4 and Hesx1 at 4S, and Nestin at 8S. The Snell mice exhibited an increase of expression in Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 in at 4S and increased Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 and Sox9 at 8S, associated with the reduction of Ki67 in both periods. The Ames strain showed an increase of Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 at 4S and 8S; the gene Nr2e1 was over expressed at all times; and there was reduction in Ki67 at 4S. Caspases 3 and 7 had not changed in any strain, at any time. Discussion and Conclusion: The pattern of immunolocalization of SOX2 found in the three strains studied was similar to that described in animals without hypopituitarism. The presence of Nr2e1 in our study suggests it as a new marker of stem/progenitor cells in the pituitary. The high expression of markers of stem/progenitor cells in the Ames and Snell strains suggests that the absence of early transcription factors Prop1 and Pou1f1 do not allow the stem/ progenitors cells to start the process of cell differentiation, while the opposite occurs in the alfaGSU lineage. Additionally, these findings explain the pituitary hypoplasia observed in animals with defects in early transcription factors, as indicated by the accumulation of stem cells in the Snell and Ames lineages, preventing the initiation of pituitary differentiation

Introdução: Alterações em genes relacionados com a secreção de GH ou a organogênese hipofisária foram identificadas em pacientes com deficiência de hormônio do crescimento (DGH) congênita. Entretanto, poucos casos de DGH têm sua etiologia esclarecida. O GHRH é um candidato óbvio para explicar a deficiência isolada de GH (DIGH). Na literatura, os estudos de análise do GHRH não conseguiram identificar mutações, porém são antigos e utilizaram uma metodologia com limitações. A maioria dos pacientes com deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla (DHHM) apresenta neuroipófise ectópica sugerindo a importância do estudo de genes que atuam no início do desenvolvimento hipofisário, com expressão inclusive no infundíbulo. O GLI2 é um fator de transcrição na sinalização Sonic Hedgehog, envolvido com o início da embriogênese hipofisária, expresso na bolsa de Rathke primordial e no diencéfalo ventral. Previamente, mutações no GLI2 foram encontradas em pacientes com holoprosencefalia, e também alterações hipofisárias. Objetivos: Analisar o GHRH em 151 pacientes com DIGH (42 brasileiros e 109 encaminhados de centros internacionais) e analisar o GLI2 em 180 pacientes brasileiros com DIGH ou DHHM por PCR e sequenciamento automático dos genes; e descrever o fenótipo dos pacientes com mutações identificadas. Resultados: No GHRH foram identificadas seis variantes em heterozigose com previsão benigna pelas análises in silico. A análise do GLI2 identificou três mutações novas em heterozigose com códon de parada prematuro (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X), e geração de proteínas truncadas, com perda do domínio responsável pela ativação transcricional. A mutação p.L788fsX794 foi identificada numa paciente com baixa estatura, polidactilia, epilepsia e hipoglicemias. Apresentava deficiência de GH, TSH, ACTH, prolactina, LH e FSH. Na investigação familiar foi diagnosticada DIGH em dois tios e DHHM numa prima. Estes familiares, além de sua mãe e outros parentes maternos também apresentaram a mutação e polidactilia. A mutação p.L694fsX722 foi identificada num menino com baixa estatura por deficiência de GH, além de lábio leporino e fenda palatina. Seu pai, embora saudável, também apresentou a mutação. A mutação p.E380X foi identificada numa lactente com retardo no desenvolvimento, hipoglicemias, poliúria e polidipsia. Apresentava deficiência de GH, ACTH, TSH e ADH. Sua mãe aparentemente normal também apresentou a mutação. Todos os pacientes com DGH e mutação no GLI2 apresentaram neuroipófise ectópica (não visualizada na paciente com p.E380X), adenoipófise hipoplásica e ausência de holoprosencefalia na ressonância magnética. Dezoito variantes não-sinônimas também foram identificadas no GLI2 em 24 pacientes. Dezesseis dessas variantes foram consideradas deletérias em pelo menos um programa de predição in silico e dez delas não foram encontradas em população controle. O fenótipo dos pacientes foi predominante de DHHM e com neuroipófise ectópica e sem holoprosencefalia. Variantes silenciosas, intrônicas e polimorfismos foram identificados no GLI2, mas aparentemente sem alteração funcional. Conclusão: Não identificamos mutação no GHRH e se realmente existe mutação neste gene como causa de DGH, deve ser muito rara. Variantes no GLI2 são frequentes (15%), indicando seu importante papel na etiologia da DGH congênita. Além disso, ampliamos o espectro fenotípico dos pacientes com mutações no GLI2, que foi caracterizado por DIGH ou DHHM, inclusive com diabetes insipidus, neuroipófise ectópica (maioria) e ausência de holoprosencefalia. Outras características observadas foram polidactilia, defeito de linha média facial e herança autossômica dominante com penetrância incompleta / Introduction: Alterations in genes related to GH secretion and pituitary organogenesis have been identified in patients with congenital GH deficiency (GHD). However, in only few cases of GHD the etiology has been established. GH-releasing hormone (GHRH) is an obvious candidate to explain isolated GH deficiency (IGHD). Previous reports in the literature did not identify mutations in GHRH, however, the methodology used was limited. Most patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD) have an ectopic posterior pituitary lobe (EPP) suggesting the study of genes involved in early pituitary development and also expressed in the infundibulum. GLI2 is a transcription factor in Sonic hedgehog signaling expressed in the primordial Rathkes pouch and ventral diencephalon during early pituitary development. Previously, GLI2 mutations were found in patients with holoprosencephaly and pituitary abnormalities. Aim: Analyse GHRH in 151 patients with IGHD (42 Brazilian and 101 from international centers) and GLI2 in 180 Brazilian patients with IGHD or CPHD by PCR and automatic sequencing, and describe the phenotype of patients with mutations. Results: In GHRH, six heterozygous variants that are benign according to in silico analysis were identified. GLI2 study revealed three novel heterozygous mutations leading to premature stop codons (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X) and truncated proteins, without the transcriptional activator domain. p.L788fsX794 was identified in a girl with short stature, polydactyly, epilepsy and hypoglycemia. She had GH, TSH, ACTH, prolactina, LH and FSH deficiencies. Two uncles had IGHD and one cousin CPHD. These relatives, the mother and other maternal relatives had polydactyly and carried the mutation. p.L694fsX722 was identified in a boy with short stature due to GHD who also had cleft lip and palate. His healthy father also carried the mutation. p.E380X was identified in an infant with delayed development, hypoglycemia, polyuria and polydipsia. She had GH, ACTH, TSH and ADH deficiencies. Her apparently normal mother also carried the mutation. All patients with GHD and GLI2 mutations had an EPP (not visualized in the patient with p.E380X), hypoplastic anterior pituitary lobe and absence of holoprosencephaly on MRI. Eighteen non-synonymous variants in GLI2 were identified in 24 patients. Sixteen of these were considered deleterious in at least one in silico prediction program and ten of these were not found in the control population. The phenotype was mainly of CPHD and EPP without holoprosencephaly. Several synonymous and intronic GLI2 variants and polymorphisms apparently without functional consequences were identified. Conclusions: No mutations in GHRH were identified and if mutations in this gene exist as a cause of IGHD, they must be very rare. Variants in GLI2 are frequent (15%) indicating its important role in the etiology of GHD. Furthermore, we expanded the clinical spectrum of patients with GLI2 mutations characterized by IGHD or CPHD including diabetes insipidus, ectopic posterior pituitary lobe (in most patients) and absence of holoprosencephaly. Additional features were polydactyly and midline facial defects and the inheritance was autosomal dominant with incomplete penetrance

Nos mamíferos, a determinação sexual é governada pelo equilíbrio entre duas vias de sinalização paralelas e antagônicas: a via masculina SOX9/FGF9 e a via feminina RSPO1/beta-catenina/WNT4. A R-spondina 1 é uma importante reguladora do processo de diferenciação ovariana e atua modulando a via de sinalização Wnt canônica (Wnt/beta-catenina). Em humanos, mutações em RSPO1 causam uma rara síndrome genética autossômica recessiva caracterizada por Distúrbios do Desenvolvimento Sexual (DDS) 46,XX Testicular ou Ovotesticular, hiperceratose palmoplantar (HPP) e predisposição para o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas (MIM 610644). Identificamos um paciente brasileiro, proveniente de uma grande família consanguínea, que apresentava a associação de HPP e DDS 46,XX Testicular SRY negativo. A avaliação da região codificadora do gene RSPO1 identificou a nova variante alélica c.305G>A (p.Cys102Tyr). O estudo de segregação realizado em 67 familiares demonstrou que a variante c.305G>A segrega em perfeita concordância com o fenótipo de HPP, exibindo um padrão de herança autossômico recessivo. Na família foram identificados 10 indivíduos afetados pelo fenótipo de HPP. As avaliações clínica e hormonal e os estudos molecular e citogenético nesses indivíduos resultou na caracterização de: (a) quatro indivíduos do sexo masculino 46,XX e/ou SRY negativo, com ambiguidade genital e perfil hormonal alterado; (b) cinco indivíduos do sexo masculino 46,XY e/ou SRY positivo, sem ambiguidade genital, com perfil hormonal normal e (c) uma mulher 46,XX, fértil. Experimentos de transfecção transitória in vitro demostraram que a proteína mutante tem menor capacidade de transativação do plasmídio reporter da via Wnt. As simulações de dinâmica molecular constataram que a troca p.Cys102Tyr aumenta a flexibilidade do backbone da R-spondina-1, diminuindo a energia de ligação da proteína ao complexo de receptores, LGR5 e RNF43. Em conjunto, nossos achados demonstram que a variante c.305G > A é patogênica, sendo responsável pela síndrome genética diagnosticada na família brasileira. As análises de expressão gênica e os estudos de imuno-histoquímica, por sua vez, detectaram um aumento da expressão do gene SOX9 e maior imonorreatividade para a proteína Sox9 no tecido testicular do caso índice. Esses resultados sugerem que o processo de reversão sexual nos indivíduos XX ocorra por uma hiperexpressão de SOX9 secundária à menor ativação da via Wnt/beta-catenina na gônada durante a embriogênese. No presente estudo também relatamos o primeiro caso de indivíduo de cariótipo 46,XX portador de mutação em homozigose no gene RSPO1 que não desenvolveu DDS. A variabilidade do fenótipo sexual não está associada com alterações no número de cópias dos genes WNT4 ou do SOX9 e região cis-regulatória. No entanto, a avaliação do exoma da família encontrou uma associação entre o polimorfismo do receptor LGR5 rs17109924 e a atenuação do fenótipo de DDS. Todavia, serão necessários estudos funcionais para esclarecer o impacto biológico da interação das variantes RSPO1 p.Cys102Tyr e LGR5 rs171099 / In mammals, sex determination is governed by the balance between two parallel and antagonic signaling pathways: the male SOX9/FGF9 and the female, RSPO1/beta-catenin/WNT4 pathways. R-spondin 1 regulates the ovarian differentiation process by its modulating action through the canonic Wnt pathway (Wnt/beta-catenin). In humans, patogenic mutations in RSPO1 cause a rare, autosomic recessive syndrome characterized by 46,XX Testicular or Ovotesticular disorders of sexual development (DSD), palmoplantar keratosis (PPK) and predisposition to squamous cell carcinoma (MIM 610644). We identified and studied a SRY-negative 46,XX DSD patient with PPK from a large, consaguineous, brazillian family. Through a \"candidate gene\" approach we identified in the proband a new allelic variant in the coding region of RSPO1, c.305G > A. This variant presented full concordance with the PPK phenotype by segregation analyses in 10 of 67 members of this family. Clinical, hormonal, cytogenetic and molecular genetic studies characterized three patterns in individuals with this variant: (a) four 46,XX and/or SRY-negative males with ambiguous genitalia and altered hormonal profile; (b) five 46,XY and/or SRY-positive males without ambiguous genitalia with normal hormonal profile; (c) one 46,XX fertile woman. In vitro experiments demonstrated that transient transfection of the mutant protein resulted in lower transactivation of the Wnt pathway-reporter plasmid. Moreover, molecular dinamic studies showed that p.Cys102Tyr increased the R-spondin-1 backbone flexibility, thus decreasing the interaction between this protein and its receptors, LGR5 and RNF43. Thus, both in vitro and in silico analysis demonstrate the pathogenicity of the RSPO1 variant c.305G > A. In addition, in the index case, a higher expression of SOX9, corroborated by a reactive immunohistochemistry in testicular tissue, suggested that the process of sexual reversal in the XX individual is driven by a higher SOX9 expression possibly due to a lower Wnt/beta-catenin signaling pathway activation during embriogenesis. In this study, we also reported the first 46,XX individual with RSPO1 mutation without DSD, in which no copy number abnormality was detected in WNT4, SOX9 and its cisregulatory regions. Whole exome sequencing of the affected individuals revealed, in turn, that the LGR5 rs17109924 polymorphism associates with a protacted DSD phenotype in the fertile woman with normal hormonal profile. Despite this evidence, future studies are nedded to address causality and biological impact between RSPO1 p.Cys102Tyr and LGR5 rs17109924 variants

Introdução: Os mecanismos envolvidos na patogênese molecular dos tumores hipofisários corticotróficos são complexos, heterogêneos e permanecem na maioria dos casos desconhecidos. Alterações da expressão de componentes da via Ikaros (Ik), tais como do receptor 4 dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR4) têm sido detectadas em tumores hipofisários, inclusive nos corticotropinomas. O desbalanço entre as isoformas longas e curtas do Ikaros resulta em um início de transcrição alternativa do FGFR4, codificando uma isoforma truncada do gene (pdt- FGFR4) que foi associada a tumores hipofisários maiores e mais invasivos. A isoforma curta Ik6 promove a expressão do fator anti-apoptótico Bcl-XL in vitro, um efeito independente da interação com as isoformas longas. Além disso, um polimorfismo do FGFR4, com substituição da glicina por arginina no códon 388 (G388R), tem sido associado à evolução desfavorável em vários tipos tumorais humanos. Objetivos: Analisar a expressão do Bcl-XL, das isoformas do Ikaros (Ik1+Ik2/Ik total) e do FGFR4 em corticotropinomas humanos. Avaliar a freqüência dos genótipos do códon 388 do FGFR4 nos pacientes com doença de Cushing e sua associação com a evolução pósoperatória após a primeira cirurgia transesfenoidal. Métodos: Noventa e sete pacientes com diagnóstico de doença de Cushing foram estudados. Os dados clínicos, hormonais e histopatológicos foram avaliados retrospectivamente. O estudo da expressão do Bcl-XL, do Ikaros, e do FGFR4 foi realizado por PCR em tempo real em 20 amostras de corticotropinomas, sendo dois tumores correspondentes à síndrome de Nelson. A determinação dos genótipos no códon 388 do FGFR4 foi realizada nos 97 pacientes e em 103 indivíduos controles, por PCR de fragmento do exon 9 do gene FGFR4 seguida de digestão com a enzima de restrição BstNI. A evolução pós-operatória (remissão/recidiva) da doença de Cushing foi avaliada em 76 pacientes. Foram considerados em remissão aqueles pacientes com níveis normais de cortisol urinário durante todo o primeiro ano após a cirurgia, na ausência de reposição hormonal, bem como os que necessitaram de reposição com glicocorticóide no mesmo período. Resultados: Dos 76 pacientes submetidos à primeira cirurgia transesfenoidal, a remissão pós-operatória ocorreu em 68,4% dos pacientes. Treze pacientes (25%) evoluíram com recidiva da doença de Cushing após remissão inicial. A expressão do Bcl-XL foi semelhante à hipófise normal na maioria das amostras tumorais [mediana (mín-máx): 1,36 (0,6 - 2,70)]. Aumento da expressão das isoformas longas do Ikaros foi detectado em 40% dos tumores, enquanto as isoformas curtas corresponderam a mais de 50% da expressão do Ikaros em apenas 3 casos, não havendo associação da expressão do Ikaros com qualquer das variáveis analisadas. O aumento da expressão do FGFR4 foi detectado em 8/18 (44,4%) dos corticotropinomas com doença de Cushing, havendo associação entre a hiperexpressão do FGFR4 e a menor freqüência de remissão pós-operatória da doença de Cushing (p = 0,009). A distribuição genotípica do polimorfismo G388R foi semelhante entre pacientes e controles. O genótipo glicina em homozigose (Gly/Gly) não foi associado à menor frequência de remissão pós-operatória da doença, no entanto, uma freqüência maior de recidiva pós-operatória foi encontrada no grupo de pacientes Gly/Gly (p = 0,019). O genótipo Gly/Gly foi ainda associado à redução da sobrevida livre de doença (hazard ratio [HR], 6,91; Intervalo de Confiança (IC) de 95%, 1,14 a 11,26; p = 0,028). Outras variáveis que se associaram significativamente com maior freqüência de recidiva foram: tamanho e grau de invasão tumoral de acordo com a classificação de Hardy modificada (p = 0,017), o sexo masculino (p = 0,033), a não confirmação Imuno-histológica do tumor produtor de ACTH (p = 0,026) e os valores de cortisol > 2 ?g/dL no pós-operatório precoce (p = 0,01). Conclusões: A expressão normal detectada do Bcl-XL e das isoformas curtas do Ikaros, na maioria das amostras tumorais, sugere a não participação destes fatores na patogênese dos tumores corticotróficos. O aumento da expressão do FGFR4 e o genótipo glicina em homozigose foram associados, respectivamente, à menor freqüência de remissão e maior recidiva pós-operatória da doença de Cushing. Estes resultados sugerem que o FGFR4 pode ter um papel na progressão dos tumores corticotróficos favorecendo a persistência e/ou recidiva da doença de Cushing. / Introduction: The mechanisms involved in the molecular pathogenesis of corticotroph pituitary tumors are complex, heterogeneous and in most cases remain unknown. Changes in the expression of components of Ikaros (Ik) pathway, such as receptor 4 of fibroblast growth factor (FGFR4), have been detected in pituitary tumors including corticotropinomas. Imbalance between long and short Ik isoforms results in alternative transcription initiation of FGFR4 and encodes a truncated isoform of the gene (pdt-FGFR4) which was associated with larger and more invasive pituitary tumors. The Ik6 short isoform promotes Bcl-XL expression in vitro, an effect independent of the interaction with the long isoforms. In addition, a polymorphism of FGFR4 gene, the substitution of glycine by arginine at codon 388 (G388R), has been associated with adverse outcome in several human tumor types. Objectives: To analyze the expression of Bcl-XL, Ikaros isoforms (Ik1 + Ik2/Ikaros total), and FGFR4 in human corticotropinomas. To determine the frequency of each genotype at codon 388 of FGFR4 in patients with Cushing\'s disease and its association with the postoperative outcome after the first transsphenoidal surgery. Methods: Ninety-seven patients with Cushing\'s disease were evaluated. Clinical, hormonal and histopathological findings were assessed retrospectively. The expression of Bcl-XL, Ikaros and FGFR4 were evaluated by real-time PCR in 20 samples of corticotropinomas, including two samples of Nelson\'s syndrome. The FGFR4 genotype was determined in the 97 patients and 103 control subjects by PCR fragment of exon 9 of the FGFR4 gene, followed by digestion with the BstNI restriction enzyme. The postoperative outcome (remission/relapse) of Cushing\'s disease was assessed in 76 patients. The patients with normal urinary cortisol levels during the first year after surgery, in the absence of hormone replacement therapy, and those who required glucocorticoid replacement within the same period were considered in remission. Results: Of the 76 patients who underwent the first transsphenoidal surgery, remission was achieved in 68.4% of patients. Thirteen patients (25%) developed recurrence of Cushing\'s disease after initial remission. The expression of Bcl-XL in the majority of tumor samples was similar to normal pituitary [median (min-max): 1.36 (0.6 - 2.70)]. Overexpression of long isoforms of Ik was detected in 40% of tumors, while the short isoforms represented more than 50% of the expression in only 3 samples. Ik expression was not associated with any of the variables analysed. FGFR4 transcripts were overexpressed in 8/18 (44.4%) of corticotropinomas with Cushing\'s disease. There was an association between the overexpression of FGFR4 and lower postoperative remission rate (p = 0.009). The FGFR4 genotype distribution at codon 388 was similar between control individuals and patients. The glycine homozygous genotype (Gly/Gly) was not associated with lower remission rate. However, a higher frequency of postoperative recurrence was found in the Gly/Gly group (p = 0.019). The Gly/Gly genotype was also associated with reduced disease-free survival (hazard ratio [HR] 6.91, confidence interval (CI) 95%, 1.14 to 11.26; p = 0.028). Other variables that were significantly associated with higher frequency of recurrence were: size and tumor invasion according to modified Hardy classification (p = 0.017), male gender (p = 0.033), non-immuno-histological confirmation of ACTH secreting tumor (p = 0.026) and cortisol levels > 2 ?g/dL in the early postoperative period (p = 0.01). Conclusions: The normal expression of Bcl-XL and short isoforms of Ik in most samples suggest that these factors are not involved in the pathogenesis of corticotroph tumors. Overexpression of FGFR4 and the glycine homozygous genotype were associated with lower frequency of remission and higher postoperative recurrence of Cushing\'s disease, respectively. These results suggest that FGFR4 may play a role in progression of corticotroph tumors favoring the persistence and/or recurrence of Cushing\'s disease.